Дифференциация стволовых клеток нерва по одношаговый атмосферной плазмы лечение в пробирке

Резюме

Этот протокол направлен на обеспечение подробные экспериментальные шаги для лечения холодной плазмы атмосферного нервных стволовых клеток и обнаружение иммунофлюоресценции для дифференциации повышение.

Аннотация

Как развитие физической плазменной технологии, холодный атмосферной плазмы (CAPs) широко исследованы в дезактивации, лечение рака, заживление ран, лечение корневых каналов, и т.д., формируя новое поле исследований имени плазмы медицины. Будучи смесью электрические, химические и биологические реактивных видов, шапки показали свои способности активизировать дифференцировки стволовых клеток нерва как в пробирке и в естественных условиях и являются становится перспективным способом для лечения неврологических заболеваний в будущем. Гораздо более интересные новости, что с помощью шапки может реализовать один шаг и безопасно направлены, дифференцировка нервных стволовых клеток (NSCs) для перевозки ткани. Мы демонстрируем здесь подробный экспериментальный протокол с помощью самодельное устройство CAP струи для повышения НСК дифференциации в C17.2-NSCs и первичных крыса нервные стволовые клетки, а также наблюдения за судьбу клеток, Перевернутый и микроскопии флуоресцирования. С помощью иммунофлюоресценции, окрашивание технологии мы обнаружили, как NSCs, показал ускоренными темпами дифференциальных чем группе необработанных и ~ 75% NSCs выборочно дифференцированной в нейроны, которые в основном пожилые, холинэргические и мотор нейроны.

Введение

Направленного дифференцирования NSCs в определенной линии для транспортировки ткани считается одним из самых перспективных терапии нейродегенеративных и neurotraumatic заболеваний¹. К примеру catecholaminergic дофаминергические нейроны особенно желательны в лечении болезни Паркинсона (PD). Однако традиционные методы подготовить нужные ячейки для перевозки имеют много недостатков, таких как химическая токсичность, рубцов или другие, которые во многом препятствует приложения NSCs в регенеративной медицине². Таким образом это очень необходимо найти Роман и безопасный способ для дифференциации НСК.

Плазма это четвертый состояние вопросы, следующие твердых, жидких и газовых, и он составляет более 95% вопросов во всей Вселенной. Плазмы электрически нейтрален с несвязанных позитивных/негативных и нейтральных частиц и обычно генерируется высоковольтного разряда в лаборатории. В последние два десятилетия применение плазмы в биомедицине привлекает огромное внимание во всем мире как развития технологии холодного атмосферного давления, плазмы. Благодаря этой технике стабильной низкотемпературной плазмы могут создаваться в окружающий воздух в атмосферу без образования дуги и состоит из различных реактивных видов, таких как химически активные разновидности азота (RNS), реактивнооксигенных видов (ров), ультрафиолетового (УФ) излучения, электроны, ионы и электрическое поле³. Кепки имеют уникальные преимущества для инактивации микроорганизмов, лечение рака, ранозаживляющее, лечение кожных заболеваний, пролиферации и дифференцировки клеток^4,5,6,7. В предыдущей работе мы продемонстрировали, что холодной атмосферы плазменной струи может повысить дифференциация NSCs в мышиных нервных стволовых клеток C17.2 (C17.2-NSCs) и первичной крыса нервные стволовые клетки, выставке большой потенциал, чтобы стать мощным инструментом для направленного дифференциация NSCs⁸. Хотя механизм повышения CAP НСК дифференциации полностью не поняли еще, NO, порожденных шапки доказано, чтобы быть ключевым фактором в процессе. В этой работе, мы стремимся предоставить подробный экспериментальный протокол использования атмосферное давление гелиево кислородную плазменной струи для лечения NSCs в пробирке, подготовка клетки и предварительной обработки, морфология наблюдение с помощью инвертированного микроскопа, и флуоресценции наблюдение микроскопии иммунофлуоресценции пятнать.

протокол

1. сотовый культур и Predifferentiation

1. Культура нервных стволовых клеток и predifferentiation
   1. Подготовьте поли D-лизин покрытием coverslips. Стерильные coverslip (20 мм в диаметре) положите в тарелку 12-Ну. Слой покрытия стекла с поли D-лизин, 0.1% w/v, в воде (Таблица материалов) для улучшения адгезии клеток на coverslips, выполнив следующие шаги.
      Примечание: Оптимальные условия должны быть определены для каждой ячейки строки и приложения.
      1. Асептически пальто поверхности coverslip с поли D-лизин, 0.1% w/v, в воде. Рок мягко обеспечить ровное покрытие поверхности coverslip.
      2. После культивирования на ночь (~ 12 ч) при 37 ° C, удалить раствор поли D-лизин и промыть поверхность 3 x с 1 мл стерильной воды.
      3. Сухие клетки по крайней мере 30 мин перед посевом их.
2. C17.2 (C17.2-НСК) культура мышиных нервных стволовых клеток и predifferentiation
   1. Инкубируйте C17.2-NSCs в колбу 25 см² в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным (ФБС) 10%, 5% лошадь сыворотки (СС) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 ° C и 5% CO₂ ~ 2-3 d.
   2. Когда клетки достигает 85% слияния, извлеките носитель, вымыть клетки с 1 мл раствора PBS и добавьте 1 mL свежих трипсина (0,25%) в колбу. Оставьте его в течение 1 мин; Затем добавьте 1 мл питательной среды в колбу и пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить одну ячейку подвеска.
   3. Граф плотность клеток в суспензии с помощью Горяева. Рассчитайте необходимый объем суспензии клеток дать окончательный клетки концентрация 2 х 10⁴ клеток/мл.
   4. Семя C17.2-NSCs на с покрытием coverslips в 12-ну пластины с плотностью ~ 2 x 10-⁴ клетки на хорошо. Проверьте плотность клеток под микроскопом.
      Примечание: Для лучшего результата, плотность оптимальной клеток должен быть определен перед иммунофлюоресценции эксперимент.
   5. Инкубируйте клетки при 37 ° C в ячейке инкубатор для 12 h для вложения.
   6. После вложения, вымыть клетки 2 x с 1 мл раствора PBS и культивировать клетки с дифференциации среднего, состоящий из DMEM/F12 с 1% N2 доплата за 48 ч до плазменной обработки.
3. Основная крыса нервных стволовых клеток культуры и predifferentiation
   1. Культура первичной крыса НСК подвеска в крыса НСК среднего роста в неглазированные T25 колбы на плотности тарелок 5 x 10⁵ клеток.
      Примечание: Основная крыса NSCs были изолированы после протокол СЕ и др. ⁹.
   2. Проверьте формирования neurospheres под инвертированным микроскопом. Убедитесь, что морфология neurospheres экспонатов сферических и прозрачной многоклеточных комплексов.
   3. Когда neurospheres достигают диаметра 3 мм или более, передать стерильных пластиковых пробирок 15мл нейросферы подвеска и пусть neurospheres урегулировать самотеком.
   4. Удалите супернатант тщательно, чтобы оставить neurospheres в минимальный объем среднего.
   5. Промыть neurospheres 1 x с 5 мл PBS и пусть neurospheres урегулировать самотеком. Удалите супернатант оставить минимальный объем PBS.
   6. Добавление подходящих тома дифференциации среды для настройки плотности клеток к neurospheres ~ 12-15 на миллилитр. Средством дифференциации первичных крыса NSCs состоит из DMEM/F12, 2% B27 и 1% FBS.
   7. 1 мл суспензии нейросферы на каждый с покрытием coverslip в пластине 12-ну семян.
      Примечание: Shake пластину осторожно, чтобы обеспечить равномерное распределение neurospheres. Этот шаг очень важен для лучшего результата иммунофлюоресценции.
   8. Установите пластину в инкубаторе и позволить ему predifferentiate за 24 ч до плазменной обработки.

2. Подготовка плазменной струи

1. Выбор, половина открытый кварцевые трубки с внутренним диаметром 2 мм и наружным диаметром 4 мм. вставить провод высокого напряжения с диаметром 2 мм в трубу.
2. Вставьте кварцевая трубка с провод высокого напряжения в шприц 5 мл и используйте держатель смонтировать внутри центр шприца. Задайте расстояние между запечатанном конце кварцевая трубка и кончик шприца на 1 см.
3. Подключите 1 м трубы резиновые силиконовые (с внутренним диаметром 12 мм) к открытый конец шприца и, затем, подключите его к расходомера и газовый клапан в последовательности.

3. приобретение самолетов

1. Соедените цепь по схеме, как показано на рисунке 1. Подключите выходной провод питания к устройству плазменной струи и, затем, подключите кончик зонда высокого напряжения с выходной провод для обнаружения напряжения. Подключите другой конец зонда высокого напряжения к осциллографу для записи информации выходного напряжения. Проверка всей цепи и убедитесь, что блок питания, осциллограф и высокого напряжения зонда обоснованы.
2. Проверьте газовой линии. Убедитесь, что трубки газа был подключен к устройству плазменной струи; открыть клапан газового гелия (объёмная, 99,999%) и кислорода (объёмная, 99,999%) затем установите поток газа 1 L:0.01 Л/мин (₂он: O).
   Примечание: Пусть потока газа на несколько минут перед включением питания в первый раз.
3. Значение амплитуды импульса, частоту и длительность импульса как 8 кв, 8 кГц и 1600 ns, соответственно. Проверка цепи снова и, затем, включите кнопку Выход для создания плазменной струи.
   Предупреждение: Не касайтесь провод высокого напряжения в любое время.

4. Плазменная обработка нервных стволовых клеток

1. Задайте расстояние между сопло шприц и хорошо отверстие клеток до 15 мм.
   Примечание: Расстояние измеряется от нижней части платформы, где 12-ну пластина помещается.
2. 12-ну пластины из инкубатора и изменить среднего predifferentiated клеток до 800 мкл свежие дифференциации среднего.
3. Ячейки можно разделить на три группы: группу управления необработанными, 60 s он и O₂ (1%) газ потока лечения группу и группу лечения плазмы 60 s.
   Примечание: Существует нет очевидно жидких потери при условии обращения.
4. Место пластину 12-ну под плазменной струи, убедитесь, что сопло шприц фиксируется в центре каждого отверстия и дать соответствующие обращения к различным группам, упомянутым на шаге 4.3.
   Примечание: Необработанные элементы хранились в дифференциации среднего при комнатной температуре в ходе экспериментальной процедуры для обеспечения единообразного толкования условий. Группе лечения потока газа₂ (1%) он и O лечили только он и потока газа O₂ (1%), без создания плазмы. Все процедуры должны выполняться в трех экземплярах.

5. нейронные стволовых клеток

1. После лечения удалите самобытную культуру и добавьте 1 mL новой дифференциации среднего для каждой скважины.
2. Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂ на 6 d. изменить носитель каждый день.
3. Проверьте статус дифференциации различных групп ежедневно под Перевернутый фазово контрастной световой микроскоп. Случайным образом выбрать поля, по меньшей мере 12 и снимать фотографии для записи морфологических изменений.

6. иммунофлюоресценции пятнать

1. Промывка
   1. Взять образцы из инкубатора клеток и удалите среды путем аспирации. Промойте клетки 1 x с 1 мл раствора PBS.
      Примечание: После дифференциации, клетки легко отсоединяется. Это необходимо для добавления PBS со стороны культуры скважин, чтобы избежать смывания клетки.
2. Фиксация
   1. Исправьте клетки с 500 мкл параформальдегида 4% в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации, Осторожно промойте клетки 3 x с 1 мл раствора PBS, 5 минут, чтобы удалить остаточные параформальдегида 4%.
      Примечание: Точка оптимальное время для фиксации клетки должен быть определен согласно типы клеток. После фиксации добавляют 1 мл PBS со стороны культуры скважин и оставить образец на столе за 5 мин. Не использовать лаборатории шейкер, чтобы обеспечить минимальные потери клеток.
3. Permeabilization
   1. Разрушения образцов с 0,2% TritonX-100 в PBS 10 мин при комнатной температуре. После permeabilization промойте клетки мягко с 1 мл раствора PBS для три раза по 5 минут.
      Примечание: Точка оптимальное время для клеток permeabilization должна определяться согласно типы клеток. После permeabilization добавить 1 мл PBS со стороны культуры скважин, оставьте образец на столе за 5 мин. Не использовать лаборатории шейкер для обеспечения минимальной потери клеток.
4. Блокировка
   1. Добавить 1 мл 10% козьего сыворотки в PBS для каждой выборки и оставить образец на столе за 1 ч до блокировать любые неспецифического взаимодействия.
      Примечание: Не используйте лаборатории шейкер, чтобы предотвратить отключение слайд из клетки. Ополаскивание не является необходимым на данном этапе.
5. Инкубация с основного антитела
   1. Разбавьте основное антитело, используя основное антитело буфером для разбавления проб.
      Примечание: Для получения оптимальных результатов, коэффициент разрежения окончательного основного антитела должны определяться предтестовая. Коэффициентам разрежения по анти Нестин (для недифференцированных стволовых клеток), анти β-тубулина III (для нейрона), анти О4 (для Олигодендроциты), анти NF200 (для зрелых нейронов), анти чат (для холинергических нейронов), анти LHX3 (для двигательных нейронов), анти ГАМК (для ГАМК нейроны), анти серотонина (для серотонинергической нейроны) и анти й (для дофаминергические нейроны), 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 и 1: 100, соответственно.
   2. Применить 300 мкл разбавленного первичных антител к различных образцов.
   3. Проинкубируйте образцы клетки на ночь при 4 ° C.
      Примечание: Рекомендуется инкубировать первичных антител при 4 ° C для уменьшения фона и неспецифические пятнать.
   4. Удаление первичных антител и осторожно промойте клетки 3 x с 1 мл раствора PBS.
6. Инкубация с вторичного антитела
   1. Разбавьте Cy3-конъюгированных или Alexa Fluor 488-конъюгированных вторичные антитела, с помощью 3% козьего сыворотки в PBS.
      Примечание: Для получения оптимальных результатов, коэффициент разрежения окончательный вторичные антитела должны определяться предтестовая.
   2. Примените 300 мкл соответствующих вторичных антител для обнаружения каждого основного антитела.
      Примечание: Все последующие шаги должны быть выполнены в темноте, чтобы предотвратить тушения флуоресценции.
   3. Инкубируйте образец клеток в темноте втечение 2 ч при комнатной температуре.
   4. Вторичные антитела снимите и промойте клетки мягко с 1 мл раствора PBS 10 мин при комнатной температуре.
7. Ядерные пятнать
   1. Примените 500 мкл рабочего раствора Hoechst 33258 погрузить образец клеток.
   2. Инкубируйте образец клеток в темноте для 8 мин при комнатной температуре на этикетке ядер.
   3. Осторожно промыть клетки 3 x с 1 мл раствора PBS, 10 мин каждая, защищенном от света.
      Примечание: Для минимальной потери клеток, состояние оптимальный режим стирки необходимо определить эмпирически.
8. Монтаж
   1. Поместите одну каплю монтажа средних в центре микрослайдовому.
   2. Возьмите из coverslips (с примерами) с помощью пинцета и осторожно поместите образец поверх средства монтажа. Избегайте воздушных пузырей.
   3. Удалите любые излишки монтажной среды с фильтровальной бумаги.
9. Наблюдение микроскопии флуоресцирования
   1. Наблюдать за образцы под микроскопии флуоресцирования, оснащены фильтрами для Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 и Cy3. Для каждого образца произвольно выберите по крайней мере 8-12 поля и записи изображения с камеры.

Результаты

Морфология клеток наблюдалось под инвертированным микроскопом каждый день после лечения Кап. Рисунок 2 показывает изображения обычных Перевернутый фазово контрастной световой микроскоп дифференцировки клеток в обоих клеточных линий. Плаз?...

Обсуждение

C17.2-NSCs является своего рода увековечен нервных стволовых клеток линии от новорожденных мыши мозжечковой зернистый слой клеток, разработанный Снайдер и другие^10,11. C17.2-NSCs могут дифференцироваться в нейронах, астроциты и Олигодендроциты и широко использую?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A