Differenziazione delle cellule staminali nervose di un One-Step Plasma atmosferico freddo trattamento In Vitro

Riepilogo

Questo protocollo mira a fornire la procedura dettagliata sperimentale di un trattamento al plasma atmosferico freddo su cellule staminali neurali e rilevamento di immunofluorescenza per la valorizzazione di differenziazione.

Abstract

Come lo sviluppo della tecnologia di fisica del plasma, plasmi atmosferici freddi (CAPs) ampiamente sono stati studiati nella decontaminazione, trattamento del cancro, la guarigione della ferita, cura canalare, ecc., formando un nuovo campo di ricerca denominato medicina del plasma. Essendo una miscela di specie reattive elettriche, chimiche e biologiche, tappi hanno dimostrato le loro capacità per migliorare la differenziazione di cellule staminali nervose entrambi in vitro e in vivo e sono diventando una soluzione promettente per il trattamento di malattia neurologica in futuro. La notizia molto più eccitante è che utilizza capsule può realizzare uno stadio e diretto in modo sicuro, differenziazione delle cellule staminali neurali (NSC) per il trasporto del tessuto. Dimostriamo qui il dettagliato protocollo sperimentale di utilizzando un dispositivo di CAP jet self-made per migliorare la differenziazione NSC in C17.2-NSC e cellule staminali neurali del ratto primario, nonché osservando il destino della cellula da invertito e microscopia a fluorescenza. Con l'aiuto della tecnologia di colorazione di immunofluorescenza, abbiamo trovato entrambi la NSC ha mostrata un tasso accelerato di differenziale rispetto al gruppo non trattato, e ~ 75% del NSC differenziato selettivamente nei neuroni, che sono principalmente maturo, colinergici e motore neuroni.

Introduzione

La differenziazione di NSC diretto verso una certa linea per il trasporto del tessuto è considerata una delle più promettenti terapie per malattie neurodegenerative e neurotraumatic¹. Ad esempio, i neuroni dopaminergici catecholaminergic soprattutto sono desiderati nel trattamento del morbo di Parkinson (PD). Tuttavia, i metodi tradizionali per preparare le cellule desiderate per trasporto hanno molti inconvenienti, come ad esempio tossicità chimica, formazione della cicatrice o altri, che in gran parte ostacola le applicazioni delle CSN in medicina rigenerativa². Di conseguenza, è molto necessario per trovare un romanzo e un modo sicuro per il differenziamento di NSC.

Il plasma è il quarto stato della materia, seguente solido, liquido e gas, e costituisce oltre il 95% della materia nell'intero universo. Il plasma è elettricamente neutro con unbound positivo/negativo e particelle neutre e viene solitamente generato da una scarica ad alta tensione in laboratorio. Negli ultimi due decenni, l'applicazione del plasma in biomedicina ha attirato grande attenzione in tutto il mondo come lo sviluppo della tecnologia del plasma freddo pressione atmosferica. Grazie a questa tecnica, stabile al plasma a bassa temperatura può essere generato nell'aria circostante atmosfera senza formazione di arco e si compone di varie specie reattive, come specie reattive dell'azoto (RNS), specie reattive dell'ossigeno (ROS), ultravioletto (UV) radiazione, gli elettroni, ioni e campo elettrico³. Tappi presentano i vantaggi unici per inattivazione di microrganismi, la terapia del cancro, cicatrizzazione, trattamento delle malattie della pelle, la proliferazione delle cellule e cellula differenziazione^4,5,6,7. Nel precedente lavoro, abbiamo dimostrato che il getto di plasma atmosferico freddo può migliorare il differenziamento di NSC in murino delle cellule staminali neurali C17.2 (C17.2-NSC) e cellule staminali neurali del ratto primario, che esibisce un grande potenziale per diventare un potente strumento per la regia differenziazione di NSC⁸. Sebbene il meccanismo del potenziamento di CAP di differenziazione NSC completamente non è capito ancora, NO generato da tappi è stato dimostrato di essere un fattore chiave nel processo. In questo lavoro, ci proponiamo di fornire un dettagliato protocollo sperimentale di usando un getto plasma di elio/ossigeno di pressione atmosferica per il trattamento di NSC in vitro, preparazione delle cellule e pretrattamento, osservazione della morfologia di microscopio invertito, e osservazione di microscopia di fluorescenza di immunofluorescenza.

Protocollo

1. culture e Predifferentiation delle cellule

1. Predifferentiation e coltura delle cellule staminali neurali
   1. Preparare vetrini coprioggetti rivestiti con poli-D-lisina. Mettete un coprioggetto sterile (20 mm di diametro) in un piatto di 12-pozzetti. Ricoprire il vetro di copertura con poli-D-lisina, 0,1% p/v, in acqua (Tabella materiali) per migliorare l'aderenza delle cellule su lamelle seguendo i passi successivi.
      Nota: Le condizioni ottimale devono essere determinate per ogni linea cellulare e l'applicazione.
      1. Asetticamente rivestire la superficie del coprivetrino con poli-D-lisina, 0,1% p/v, in acqua. Roccia delicatamente per garantire un rivestimento anche della superficie del vetrino coprioggetti.
      2. Dopo la coltura a 37 ° C durante la notte (~ 12 h), rimuovere la soluzione di poli-D-lisina e sciacquare la superficie 3 x con 1 mL di acqua sterile.
      3. Asciugare le cellule almeno 30 min prima della semina di loro.
2. Predifferentiation e cultura C17.2 (C17.2-NSC) murino delle cellule staminali neurali
   1. Incubare C17.2-NSC in un pallone da² 25 cm in mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) completato con 10% siero bovino fetale (FBS), 5% di siero equino (HS) e 1% di penicillina/streptomicina a 37 ° C e 5% di CO₂ per ~ 2-3 d.
   2. Quando le cellule raggiungono la confluenza di 85%, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con 1 mL di PBS e aggiungere 1 mL di tripsina fresca (0,25%) nel pallone. Lasciarlo per 1 min; quindi, aggiungere 1 mL di terreno di coltura nel matraccio e pipetta su e giù parecchie volte per garantire una sospensione unicellulare.
   3. Contare la densità delle cellule in sospensione utilizzando un emocitometro. Calcolare il volume richiesto di sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale cella di 2 x 10⁴ cellule/mL.
   4. C17.2-NSC di seme su lamelle rivestite in lastra 12-pozzetti con la densità di ~ 2 x 10⁴ cellule per pozzetto. Controllare la densità delle cellule al microscopio.
      Nota: Per un risultato migliore, la densità cellulare ottimale deve essere determinata prima dell'esperimento di immunofluorescenza.
   5. Incubare le cellule a 37 ° C in un'incubatrice di cellulare per 12 h consentire allegato.
   6. Dopo aver allegato, lavare le cellule 2 x con 1 mL di PBS e coltivare le cellule con mezzo di differenziazione consistente DMEM/F12 con supplemento di 1% N2 per 48 h prima del trattamento al plasma.
3. Predifferentiation e coltura delle cellule staminali neurali primari di ratto
   1. La sospensione del ratto primario NSC nel mezzo di crescita di ratto NSC in non patinata T25 matracci a una densità di 5 x 10⁵ cellule della coltura.
      Nota: Il ratto primario NSC sono stati isolati seguendo il protocollo di Xie et al. ⁹.
   2. Controllare la formazione di neurosfere sotto un microscopio invertito. Assicurarsi che la morfologia della neurospheres esibisce complessi multicellulari sferici e trasparente.
   3. Quando i neurosfere raggiungono un diametro di 3 mm o più grandi, trasferire la sospensione neurosphere un 15 mL sterile provetta e lasciare che i neurosfere depositarsi per gravità.
   4. Rimuovere il surnatante con attenzione per lasciare il neurosfere in un volume minimo del mezzo.
   5. Sciacquare il neurosfere 1 x 5 ml di PBS e lasciare che i neurosfere depositarsi per gravità. Eliminare il surnatante per lasciare un minimo volume di PBS.
   6. Aggiungere un volume adeguato di mezzo di differenziazione per regolare la densità delle cellule di neurosfere ~ 12-15 per millilitro. Il mezzo di differenziazione per primari di ratto NSCs consiste in DMEM/F12, 2% B27 e 1% FBS.
   7. Semi di 1 mL di sospensione neurosphere su ogni vetrino coprioggetti rivestito in lastra 12-pozzetti.
      Nota: Agitare la piastra delicatamente per garantire che la neurospheres siano distribuiti uniformemente. Questo passaggio è fondamentale per un migliore risultato di immunofluorescenza.
   8. Posizionare la piastra in incubatrice e consentirle di predifferentiate per 24 h prima del trattamento al plasma.

2. preparazione dei getti di Plasma

1. Scegliere un tubo di quarzo semiaperta con un diametro interno di 2 mm e un diametro esterno di 4 mm. Inserire un cavo dell'alta tensione con un diametro di 2 mm nel tubo.
2. Inserire il tubo di quarzo con il filo dell'alta tensione in una siringa da 5 mL e utilizzare un utensile per il montaggio all'interno del centro della siringa. Impostare la distanza tra l'estremità sigillata del tubo al quarzo e la punta della siringa a 1 cm.
3. Collegare un tubo di gomma del silicone di 1 m (con un diametro interno di 12 mm) all'estremità aperta della siringa e, quindi, collegare alla valvola gas e flussometro in sequenza.

3. acquisizione dei getti

1. Collegare il circuito come mostrato in Figura 1. Collegare il cavo di uscita dell'alimentatore al dispositivo getto plasma e, quindi, collegare la punta della sonda ad alta tensione con l'uscita del filo per rilevare la tensione. Collegare l'altra estremità della sonda ad alta tensione all'oscilloscopio per registrare le informazioni della tensione in uscita. Controllare tutto il circuito e assicurarsi che il cavo di alimentazione, l'oscilloscopio e la sonda ad alta tensione sono tutti a terra.
2. Controllare la tubazione del gas. Assicurarsi che il tubo del gas è stato collegato al dispositivo getto plasma; quindi, aprire la valvola del gas della Elio (frazione di volume, 99,999%) e ossigeno (frazione di volume, 99,999%) e impostare il flusso del gas a 1 L:0.01 L/min (He: O₂).
   Nota: Lasciare che il flusso di gas per alcuni minuti prima di accendere l'alimentazione elettrica per la prima volta.
3. Impostare l'ampiezza di impulso, frequenza e larghezza di impulso come 8 kV, 8 kHz e ns 1600, rispettivamente. Controllare il circuito di nuovo e, quindi, accendere il pulsante di uscita per creare un getto di plasma.
   Attenzione: Non toccare il filo ad alta tensione in qualsiasi momento.

4. plasma trattamento di cellule staminali neurali

1. Impostare la distanza tra l'ugello della siringa e il pozzo di cella a 15 mm.
   Nota: La distanza è misurata dalla parte inferiore della piattaforma dove si trova la piastra 12-pozzetti.
2. Prendere la piastra 12-pozzetti fuori l'incubatrice e cambiare il mezzo delle cellule predifferentiated 800 µ l di terreno di differenziazione fresco.
3. Le cellule si divide in tre gruppi: un gruppo di controllo non trattato, un gruppo di trattamento di 60 di s He-e-O₂ (% 1) gas flusso e un gruppo di trattamento al plasma s 60.
   Nota: Non c'è nessuna perdita di liquida evidente sotto la condizione di trattamento.
4. Posizionare la piastra 12-pozzetti sotto i getti di plasma, accertarsi che l'ugello della siringa è fissato al centro di ogni foro e dare il trattamento relativo ai diversi gruppi indicati al punto 4.3.
   Nota: I controlli non trattati erano tenuti in mezzo di differenziazione a temperatura ambiente durante la procedura sperimentale per garantire condizioni di uniformità di trattamento. Il gruppo di trattamento lui-e-O flusso gas₂ (% 1) è stato trattato con solo un lui e O₂ (% 1) flusso di gas, senza generazione di plasma. Tutti i trattamenti devono essere eseguiti in triplice copia.

5. neural Stem Cell Differentiation

1. Dopo il trattamento, rimuovere la cultura originale e aggiungere 1 mL di nuovo mezzo di differenziazione in ciascun pozzetto.
2. Incubare le cellule nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO₂ per 6 d. modificare il mezzo ogni altro giorno.
3. Controllare lo stato di differenziazione dei diversi gruppi ogni giorno sotto un microscopio ottico a contrasto di fase invertita. In modo casuale selezionare almeno 12 campi e scattare foto per registrare i cambiamenti morfologici.

6. immunofluorescenza

1. Risciacquo
   1. Prelevare i campioni fuori l'incubatrice di cellulare e rimuovere il supporto dall'aspirazione. Sciacquare le cellule 1 x con 1 mL di PBS.
      Nota: Dopo la differenziazione, le cellule si staccano facilmente. È necessario aggiungere il PBS dal lato dei pozzi cultura per evitare di lavare fuori le cellule.
2. Fissazione
   1. Fissare le cellule con 500 µ l di paraformaldeide al 4% per 20 min a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, sciacquare delicatamente le cellule 3 x con 1 mL di PBS, 5 minuti ciascuno, per rimuovere il residuo paraformaldeide al 4%.
      Nota: Il punto di tempo ottimale per la fissazione delle cellule deve essere determinato secondo i tipi di cellule. Dopo la fissazione, aggiungere 1 mL di PBS dal lato dei pozzi cultura e lasciare il campione sul tavolo per 5 min. Non utilizzare un agitatore di laboratorio, per garantire una minima perdita di cellule.
3. Permeabilizzazione
   1. Permeabilize i campioni con 0,2% TritonX-100 in PBS per 10 min a temperatura ambiente. Dopo il permeabilization, sciacquare le cellule delicatamente con 1 mL di PBS per tre volte, 5 minuti ciascuno.
      Nota: Il punto di tempo ottimale per la permeabilizzazione delle cellule deve essere determinato in base ai tipi di cella. Dopo il permeabilization, aggiungere 1 mL di PBS dal lato dei pozzi cultura, lasciare il campione sul tavolo per 5 min. Non utilizzare un agitatore di laboratorio per garantire la minima perdita di cellule.
4. Blocco
   1. Aggiungere 1 mL di siero di capra del 10% in PBS per ogni campione e lasciare il campione sul tavolo per 1 h bloccare eventuali interazioni non specifiche.
      Nota: Non utilizzare un agitatore di laboratorio, per impedire alle cellule di scollegamento dalla diapositiva. Un risciacquo non è necessario in questo passaggio.
5. Incubazione con anticorpo primario
   1. Diluire l'anticorpo primario mediante tampone di diluizione di anticorpo primario.
      Nota: Per risultati ottimali, il rapporto di diluizione finale dell'anticorpo primario deve essere determinato dal pretest. Ai rapporti di diluizione di anti-nestina (per cellule staminali indifferenziate), anti-β-tubulina III (per neurone), anti-O4 (per oligodendrociti), anti-NF200 (dei neuroni maturi), anti-ChAT (per i neuroni colinergici), anti-LHX3 (per i neuroni di motore), anti-GABA (per I neuroni GABAergici), anti-serotonina (per neuroni serotonergic) e anti-TH (per i neuroni dopaminergici) sono 1: 80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 e 1: 100, rispettivamente.
   2. Applicare 300 µ l di anticorpi primari diluiti a diversi campioni.
   3. Incubare i campioni delle cellule durante la notte a 4 ° C.
      Nota: È consigliabile per Incubare gli anticorpi primari a 4 ° C per ridurre lo sfondo e colorazione aspecifica.
   4. Rimuovere gli anticorpi primari e sciacquare delicatamente le cellule 3 x con 1 mL di PBS.
6. Incubazione con anticorpo secondario
   1. Diluire i Cy3-coniugati o coniugati Alexa Fluor 488 anticorpi secondari utilizzando siero di capra del 3% in PBS.
      Nota: Per risultati ottimali, il rapporto di diluizione finale dell'anticorpo secondario deve essere determinato dal pretest.
   2. Applicare 300 µ l di anticorpi secondari pertinenti per rilevare ogni anticorpo primario.
      Nota: Tutti i passi successivi devono essere eseguite al buio per evitare l'estinzione di fluorescenza.
   3. Incubare il campione di cellule al buio per 2 h a temperatura ambiente.
   4. Rimuovere gli anticorpi secondari e sciacquare le cellule delicatamente con 1 mL di PBS per 10 min a temperatura ambiente.
7. Macchiatura nucleare
   1. Applicare 500 µ l di soluzione di lavoro di Hoechst 33258 per immergere il campione di cellule.
   2. Incubare il campione di cellule al buio per 8 min a temperatura ambiente per etichettare i nuclei.
   3. Sciacquare delicatamente le cellule 3 x con 1 mL di PBS, 10 min ciascuno, al riparo dalla luce.
      Nota: Per una minima perdita di cellule, la condizione di lavaggio ottimale deve essere determinata empiricamente.
8. Montaggio
   1. Mettere una goccia di mezzo di montaggio al centro della 250D.
   2. Togliere i vetrini coprioggetti (con esempi) usando la pinzetta e posizionare accuratamente il campione sopra il mezzo di montaggio. Evitare le bolle d'aria.
   3. Rimuovere qualsiasi mezzo di montaggio in eccesso con carta assorbente.
9. Osservazione di microscopia di fluorescenza
   1. Osservare i campioni sotto il microscopio a fluorescenza dotato di filtri per Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 e Cy3. Per ogni campione, in modo casuale selezionare almeno 8-12 campi e registrare le immagini con una macchina fotografica.

Risultati

Morfologia delle cellule è stata osservata al microscopio invertito ogni giorno dopo il trattamento di CAP. La figura 2 Mostra le immagini del microscopio chiaro ordinario invertito in contrasto di fase della differenziazione delle cellule in entrambe le linee cellulari. Il gruppo trattato al plasma presenta un tasso di accelerazione del differenziamento e un rapporto di elevata differenziazione rispetto al gruppo di flusso di controllo e g...

Discussione

C17.2-NSC è una sorta di linea di cellule staminali neurali immortalata da cellule di strato granulare cerebellare di topo neonatale, sviluppata da Snyder e altri^10,11. C17.2-NSC può differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti e sono ampiamente usate in neuroscienze¹². Nel nostro studio precedente, tappi potrebbero migliorare la differenziazione delle C17.2-CSN in neuroni. Uno studio di prova-de-principio è stato anche effett...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A