Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Özet

Bu eser için üç farklı Mısır dokuların içine salgılanan Mısır proteinlerin teslim yerinde bir Ustilago maydis Truva atı zor klonlama açıklar.

Özet

Homer´s Truva atı mit esinlenerek, Mısır patojen Ustilago maydis salgılanan proteinler içinde vivo fenotipik analiz izin Mısır apoplast sunmak için tasarlanmış. Bu yöntem Mısır dönüşüm üzerinde dayanmaz Ancak mikrobiyal genetik ve patojenlerin salgı yetenekleri olağanüstü başarı. Burada, içinde vivo incelenmesi salgılanan proteinler kronolojik zamanmekansal çözünürlükte yüksek enfeksiyon siteleri ve doku çeşitleri ile teslim sağlar. Truva atı strateji-ebilmek var olmak kullanmak geçici işlevsel olarak protein etki alanları, hedef protein etkilerini incelemek veya ofsayt protein overdosage, güçlü bir araç yapmak için çalışmaya karakterize etmek için Mısır işlev kaybı fenotipleri tamamlayacak protein çalışmaları Mısır ürün sistem. Bu eser üç farklı Mısır doku türü için bu yöntemi uygulamak için standart enfeksiyon protokolleri takip bir Truva atı yük oluşturmak nasıl kesin bir iletişim kuralını içerir.

Giriş

Biotrophic patojen Ustilago maydis Mısır kurum hastalığı¹hastalığının olduğunu. Mısır melanized, siyah sporları içeren büyük tümör içinde kaynaklanan tüm hava parçaları bozar. Küresel düzeyde, U. maydis tümörü Meksika'da lezzetin bir incelik olarak takdir edilmektedir iken Mısır verimi, yaklaşık % 2 yıllık bir kaybına neden tahmin edilmektedir. Bitki enfeksiyon Mısır epidermal hücrelerin ilk tabakası nüfuz hücre duvarı lysing enzimler salgılar bir appressorium tarafından başlatılır. Bir birincil enfeksiyon sitesinden bir-iki hücreyi istila katmanlar her gün^1,2, intracellularly ve intercellularly U. maydis yetişir. Beş gün üzerine görünür tümör dönüşüyor bitki hipertrofisi sonuçlarında başarılı enfeksiyon enfeksiyon^1,3,4posta. Bütün enfeksiyon aşamaları sırasında mantar hif bitki sitoplazma membran ana makine sitoplazma^1,2için doğrudan herhangi bir temas olmadan invaginate. Bitki plazma zarı arasındaki bulaşmasını hif sıkı apoplasmic alanı biotrophic etkileşim bölgesi adı verilen ana bilgisayar/patojen interaktif sitesi olarak kabul edilir. Bitki doğuştan gelen bağışıklık sistemi üstesinden gelmek için U. maydis bir dizi efektör proteinlerin biotrophic etkileşim bölgesi¹salgılar. Diğerleri biotrophic etkileşim bölgesi^5,6,7,8' kalır bazı effectors bitki hücreleri tarafından alınır. Bir apoplastic efektör UmPit2, sinyal peptid ZmZIP1 apoplastic proteaz aktivitesi^9,tarafından ZmPROZIP üzerinden¹⁰sürümü önlemek için apoplastic Mısır proteaz ile etkileşim olduğunu.

Son on yıl boyunca U. maydis mantar genetik bitki patojeni etkileşim içinde aynı zamanda iyi anlaşılmış bir yaşam döngüsü, kolay genetik erişilebilirlik nedeniyle biyoteknoloji değerli bir araç için sadece bir model oldu değil ve kapaklı ifade salgılanan proteinler^11,12,13. Her iki geleneksel ve sıradışı protein salgılanması için sinyalleri ardından değişiklikler¹⁴kontrol sağlayan tespit edilmiştir. Son zamanlarda, küçük, çalışmaya bir Truva atı araç salgılanan gibi Mısır proteinler in situ¹⁵ U. maydis istihdam edildi. Truva atı yaklaşım şekilde küçük, salgılanan protein anter geliştirmede söz konusu ZmMAC1 işlev analiz etmek için kullanıldı. ZmMAC1 pluripotent hücreler ve yeni kurulan hücreleri¹⁵hücre kader tayini periclinal bölümü neden olmaktadır. Aynı yöntemle Mısır hasar ilişkili peptid ZmZIP1 biyolojik fonksiyonu ortaya çıktı. ZmZIP1 sonuçlandı Mısır salgılayan U. maydis tümör oluşumu¹⁰Engelli. Böylece, Truva atı yaklaşım temsil in situ çalışmalar ne yapar kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlüklü protein için değerli bir alternatif yol istemek istikrarlı Mısır dönüştürme satırları ne de doku infiltrasyonu ile nesil heterologously ifade ve saf protein. Özellikle, Truva atı strateji Mısır apoplast kapaklı herhangi bir protein salgılanması ve aynı doku içindeki sigara enfekte bitki hücreleri enfekte karşı doğrudan karşılaştırma sağlar.

Bu iletişim kuralı bir protein ilgi çalışmaya bir U. maydis Truva atı gerginlik getirici için başlıca adımları göstermektedir. Hangi kronolojik zamanmekansal enfeksiyon ilerleme ve protein işlevi eğitim için bir önkoşuldur U. maydisile daha fazla üç farklı Mısır doku türü (yetişkin yapraklar, püsküllü ve kulakları) enfeksiyon yordamları hakkında kesin bilgiler içerir Bu hedef dokulara. Daha fazla hiçbir belirtim Mısır gene amplifikasyon üzerinde verilen ve mikroskobik adımları hedef özgü ve enstrüman bağımlı olduğundan teknikleri, görüntüleme. Böylece, bu iletişim kuralı standart moleküler biyoloji teknikleri deneyimli kullanıcılara yöneliktir.

Protokol

1. bir U. maydis Truva atı inşaatı

Not: Bkz: Şekil 1.

1. Bir gen Mısır cDNA gene özgü astar ve proofreading bir DNA polimeraz kullanarak dan ilgi yükseltmek. Birincil PCR ürünü klon ve plazmid satıcının talimatları. E. coli inşa dönüştürmek Faiz sırası Sanger sıralama sonraki klonlama adımlar için kullanmadan önce tarafından doğru gen doğrulayın.
   Not: PCR özellikleri astar sıra özelliklerine ve en uygun DNA polimeraz reaksiyon koşulları nedeniyle optimize edilmiş olması gerekir.
2. Mısır gen ilgi olmadan bir sinyal peptid (SP) kodlama sırası yükseltmek için tasarım astar.
3. RSIATA motifi ve bir Astsubayile ters astar 5´ sonunu uzat ben kesme makinası (Tablo 1).
4. 1.1 PCR şablon olarak oluşturuldu PCR yapı kullanarak okuma DNA polimeraz ile ilgi Mısır gen yükseltmek.
5. Çift-Özet PCR ürünü ve U. maydis dönüştürme plazmid, p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2Zm -mac1-mCherry-Ha¹⁵, Xbaile ben ve Astsubay I. arındırmak sindirilir PCR ürünü ve plazmid.
6. Sindirilir PCR ürünü T4 DNA ligaz manufacturer´s talimatları kullanarak p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2Zm -mac1-mCherry-Ha şablonu içine ligate. E. coli tüp ligasyonu ürün dönüştürmek ve faiz sırası Sanger tarafından doğru gen doğrulayın sıralama.
7. P123-P_Umpit2-Sp_Umpit2- Zmfaiz-mCherry gen-Ha Restriksiyon enzimi Sspile linearize ben ve dönüşüm solopathogenic U. DNA'ya Maydis SG200¹⁶süzün. U. maydis transformants carboxin seçime göre ayırmak ve izole transformants Güney tarafından analiz¹⁶leke onaylayın.
   Not: Her protein ilgi, en az üç bağımsız U. maydis için transformants izole ve rasgele arka plan mutasyonlar herhangi bir fenotip etkilerini tahmin etmek için analiz.

2. Kültür medya

1. YEPSlight sıvı orta¹⁶hazırlamak: %1.0 (w/v) maya ekstresi, (w/v) Bacto-pepton % 0,4 ve % 0,4 (w/v) sükroz. GKD₂O ve basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de tüm bileşenlerinde dağıtılması; ısıyla daha yüksek bir ısıda daha uzun bir süre için art arda zaman veya orta kalitesini azaltmak.
2. Patates dekstroz agar (PD-agar)²⁰hazırlamak: (w/v) % 3.9 patates dekstroz agar ve %1.0 (w/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0.01 M). Tüm bileşenlerinde doğrudan şişeyi ısıyla için mix ve GKD₂O artı bir manyetik heyecan çubuğu ekleyin. Basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de; ısıyla daha yüksek bir ısıda daha uzun bir süre için art arda zaman veya orta kalitesini azaltmak.
3. PD-kömür agar²⁰hazırlamak: (w/v) % 3.9 patates dekstroz agar, %1 (w/v) kömür ve %1.0 (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0.01 M). Tüm bileşenlerinde doğrudan şişeyi ısıyla için mix ve GKD₂O artı bir manyetik heyecan çubuğu ekleyin. Basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de; ısıyla daha yüksek bir ısıda daha uzun bir süre için art arda zaman veya orta kalitesini azaltmak.

3. bitki enfeksiyon

1. Truva atı (Örneğin, mikroskobu tabanlı hücre sayımı) protein teslim yanıt olarak Mısır hücre bölünmesi analizini gerçekleştirmek önceden. U. maydiskaynaklı Mısır hücre çoğalması ve 4-5 gün sonrası enfeksiyon sonraki tümör oluşumu başlar. Nicel hastalığı değerlendirmeler doku bağımlıdır ve 6 ila 14 gün sonrası enfeksiyon için yapılmalıdır.
   Not: Farklı Mısır çeşitlerin U. maydis enfeksiyona yatkınlık farklı düzeylerde gösterir. Mısır cvs W23, A188, Gaspe flint, erken Golden ufak tefek veya Va35 Bu patojen karşı duyarlılık göstermek ve böylece Truva atı çalışmaları için uygun çeşitlerin çoğu.
2. U. maydis inoculum hazırlanması
   1. Enfeksiyon üzerinde yan etkileri tarafından transgenik zorlanma tahmin etmek için tüm Truva atı deneylerde bir negatif kontrol olarak yaratıcı zorlanma SG200 içerir. Burada, bir negatif kontrol olarak ilgi protein olmayan salgılanan sürümünü ifade bir U. maydis zorlanma kullanın. Ancak, pratiklik (Örneğin, daha büyük gösterimleri) nedenlerle progenitör zorlanma denetiminin daha kolay seçim olabilir.
   2. Deneme başlamadan önce enfeksiyon kültür ne miktarda ihtiyaç vardır tahmin ediyoruz. Enfeksiyon her bitkinin U. maydis süspansiyon 1-1.5 mL gerektirir Mısır doku türüne bağımlı unutmayın.
      Not: Bir gecede kültür yaklaşık 1 mL 0,2 20 mL YEPS_ışık orta bir OD₆₀₀ seyreltme için yeterli ve bir U. maydis kültür 25 mL bir doz₆₀₀ 0.8-1.0 ile 13-16 bitkilerin enfeksiyon için yeterli.
   3. Kazı-kazan U. maydis PD agar üzerinden bir steril Pasteur pipet kullanarak plaka, 5 mL YEPS_hafif orta aşılamak ve 28 ° C'de sabit 16 h için 200 devirde sallayarak ile büyümek kültür izin.
   4. Enfeksiyon önce uygun büyüme ve 400 X büyütme, bakteriyel kontaminasyon için standart ışık mikroskobu tarafından U. maydis aşılama kültürünü incelemek.
      Not: Uygun bir kültür, sadece puro şeklinde mantar görülebilir (Şekil 2) olduğunu.
   5. Taze YEPS_ışık , 900 µL gecede Kültür 100 µL ile karıştırıp spektrofotometre analizde boş olarak YEPS_ışık orta kullanarak OD₆₀₀ ölçmek.
   6. Taze YEPS_hafif orta 0.2 OD₆₀₀ ile gecede kültür sulandırmak ve 28 ° C'de orta günlük büyüme aşaması ulaşan aşırı doz tarafından belirtilen kadar sürekli 200 devir / dakikada sallayarak ile büyümek kültür izin_{600 nm} 0.8-1.0.
      Not: U. maydis hücreleri yinelenen her 2 h bu koşullar altında böylece istenen OD₆₀₀ ekimi 4-5 h sonra ulaşılır.
   7. 3000 x g 10 dk de iplik tarafından OD₆₀₀ 0.8-1.0 hücre hasat ve süpernatant atın.
   8. Hücre Pelet GKD₂O. bir kez yıkamak Bu amaçla, GKD₂O, spin ile 3000 x g 10 min için bir kültür hacmi ekleyin ve süpernatant atın.
   9. Hücre Pelet dikkatle GKD₂20 mL Cam Pipet kullanarak O böylece 3.0 (için bir Truva atı tahlil) veya 1.0 (hastalık rating için) son OD₆₀₀ ayarlama resuspend.
3. Truva atı doğrulanması: Mısır füzyon proteinin planta salgı içinde
   1. Bir Truva atı zorlanma¹⁷ile Mısır fidan bulaştırmak.
   2. 2-3 gün sonrası enfeksiyon confocal lazer tarama mikroskop kullanarak, virüslü fidan mikroskobik görüntüleme gerçekleştirmek. Bu amaçla, yaprak enjeksiyon puanın altına 1 cm dikdörtgen bir parçasını tüketim, örnek bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin ve bir damla GKD₂O. eklemek MCherry füzyon protein görselleştirmek için numune λ, heyecanlandırmak 561 nm ve kayıt emisyon, λ = 580-630 nm =.
4. Enfeksiyon yetişkin Mısır yaprak
   1. Yetişkin yapraklar sahneye mısır bitkileri yetiştirmek (ne zaman en az yaprak 7 büyür içinde SAP).
      Not: Bu aşamada 14 h, 28 ° C gün/10 h, 22 ° C gece ritim cv. W23 kullanarak sera koşullarında Ekim üzerine dört hafta sonra ulaşılır. Süre ile Mısır çeşidinde ve sera koşulları değişebilir.
   2. U. maydis kültür aktarım (3.2.9 bakınız) 20G x 1 Hipodermik iğne 3 mL şırınga içine.
   3. Sap sap meristem doku dikkatle yerelleştirmek için tuşuna basın. Meristem tabanının yumuşak doku daha zor sapı bir geçiş tarafından ayrılır.
   4. Meristem bir kalem kullanarak sap üzerinde işaretlemek.
   5. U. maydis kültür ateş meristem veya önümüzdeki meristem yukarıda 1 cm 1,5 mL enjekte.
   6. Hastalık belirtileri, 6 ve 12 gün sonrası enfeksiyon oranı.
5. Püsküllü enfeksiyonu
   1. Püskül sahne erişene dek Mısır bitkiler büyümek.
      Not: Mısır cv. W23 anter ve Püskül kalkınma üzerinde ayrıntılı zaman çizelgesi yukarıda açıklanan¹⁸¹⁹oldu. Önceden segregasyonun jwiles içeren püsküllü U. maydis enfeksiyon için son derece açıktır; Mısır cv. W23 püsküllü 4-7 cm büyüklügündedir.
   2. SAP dikkatle kök Püskül yerelleştirmek için tuşuna basın.
   3. Mark ucu ve bir kalem kullanarak kök üzerinde Püskül Bankası.
   4. U. maydis kültür aktarım (3.2.9 bakınız) 20G x 1 Hipodermik iğne 3 mL şırınga içine.
   5. Püskül çevresinde inoculum 1,5 mL enjekte. İnoculum eşit dağılımını sağlamak için yavaş yavaş 0.5 mL ucu, orta bölümü ve kalemle işaretlenmiş Püskül baz yerleştirin.
   6. Hastalık belirtileri 10 gün sonrası enfeksiyon oranı.
6. Kulak enfeksiyonu
   Not: kulak doku geliştirme ayrı Mısır çeşitlerin ve sera şartlarında farklıdır ve aşı önce dikkatle uyulmalıdır. İpek büyümek yaramaya kulakları U. maydis enfeksiyon için son derece açıktır.
   1. U. maydis kültür aktarım (3.2.9 bakınız) 20 G x 1 Hipodermik iğne 3 mL şırınga içine.
   2. Aşı iğne kabuğu yapraklar arasındaki boşluğa gibi derin kulak ağır yaralı olmadan enjekte et.
   3. Sürüm 1.5 mL inoculum kulak çevresinde.
   4. Şırınga ve iğne kaldırmak ve dikkatle U. maydis çözüm eşit olarak dağıtmak için cob masaj.
   5. Hastalık belirtileri 14 gün sonrası enfeksiyon oranı.
7. U. maydis inoculum canlılığı onaylamak
   1. İnoculum 10 µL PD kömür agar tabakta bırakın ve oda sıcaklığında 2 gün kuluçkaya.
      Not: Eğer ilgili U. maydis kültür formu filamentler için mümkün, kabarık, beyaz miselyum olur görülebilir (Şekil 5)

Sonuçlar

U. maydis Truva atı deneyler için yapıları plazmid p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2-faiz-mCherry gene-Haklonlanır. Mısır gen ilgi mCherry floresan muhabir ve bir epitope HAerimiş-etiket. Özellikle enfeksiyon²¹sırasında aktif U. maydis Umpit2 Düzenleyicinin kontrolü altında füzyon protein ifadesidir. Biotrophic etkileşim bölgesi...

Tartışmalar

Modern ürün araştırma genetik moleküler analiz ve protein düzeyleri için protokoller talep ediyor. Genetik erişilebilirlik ile dönüşüm kullanılabilir veya verimsiz ve Mısır gibi birçok bitki türünün zaman alıcı değil. Ayrıca, güvenilir genetik organizatörü muhabir sistemleri gibi farklı doku siteleri kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlükte yerinde protein işleviyle çalışmaya zor kılan kıt, araçlardır. Apoplastic protein heterologously ifade ve saf protein infiltrasyo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	B. Braun	4606027V
23 G x 1 1/4 hypodermic needle	B. Braun	4657640
Bacto Peptone	BD	211677
cDNA from maize			from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal	Sigma-Aldrich	05105
Confocal laser scanning microscope			use locally available equipment
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm)	Sarstedt	67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm			use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification			use locally available equipment
Nco I	NEB	R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha			please contact the corresponding author
Pasteur pipet (glass, long tip)	VWR	14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO	Thermo Fisher Scientific	K280002	can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar	VWR	90000-745
Sharpie pen			use locally available equipment
Spectrophotometer			use locally available equipment
Ssp I	NEB	R0132
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
T4 DNA ligase	NEB	M0202
TRIS	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Xba I	NEB	R0145
Yeast extract	BD	212750