Usando o Ustilago maydis como um cavalo de Troia para em Situ entrega de milho proteínas

Resumo

Este trabalho descreve a clonagem de uma estirpe de cavalo de Troia de Ustilago maydis para a entrega no local das proteínas secretadas de milho em três tipos diferentes de tecidos de milho.

Resumo

Inspirado pelo mito de cavalo de Troia Homer´s, nós produzimos o patógeno milho, Ustilago maydis entregar proteínas secretadas para o apoplasto milho permitindo análise fenotípica em vivo. Este método não se baseia na transformação de milho mas explora recursos secretoras de patógenos e genética microbiana. Neste documento, permite a inspeção de in vivo entregue proteínas secretadas com alta resolução spatiotemporal em diferentes tipos de tecidos e infecção sites. A estratégia do cavalo de Troia pode ser utilizada para complementar transitoriamente milho fenótipos de perda-de-função, caracterizar funcionalmente os domínios da proteína, para analisar os efeitos da proteína alvo, ou estudar a sobredosagem de proteína em jogo, tornando-o uma ferramenta poderosa para estudos de proteína no sistema de colheita de milho. Este trabalho contém um protocolo preciso sobre como gerar uma cepa de cavalo de Troia, seguida de protocolos padronizados de infecção para aplicar esse método para três tipos de tecido diferentes de milho.

Introdução

O patógeno biotrófica Ustilago maydis é o agente causador da doença obscenidade milho¹. Ele infecta todas as partes aéreas de milho, resultando em tumores grandes que contêm esporos melanized, preto. A nível global, U. maydis é estimado para causar uma perda anual de cerca de 2% do rendimento do milho, enquanto tumores são apreciados como uma iguaria gastronômica no México. Infecção da planta é iniciada por um apressório que secreta enzimas de lise de parede celular para penetrar a primeira camada de células epidérmicas de milho. De um local de infecção primária, U. maydis cresce intracelular e intercellularly, invadindo a célula de uma a duas camadas cada dia^1,2. Resultados de infecção bem sucedida na hipertrofia da planta que se transforma em tumores visíveis após cinco dias pós infecção^1,3,4. Durante todas as fases da infecção, hifas fúngicas invaginate da membrana do citoplasma de planta sem qualquer contacto directo para o anfitrião citoplasma^1,2. O espaço de apoplasmic apertado entre as hifas infectante e a membrana plasmática de planta é considerado a hospedeiro/agente patogénico interativas do site, chamada de zona de interação biotrófica. A fim de superar o sistema imune inato de planta, U. maydis segrega uma matriz de proteínas efetoras para a interação biotrófica zona¹. Alguns efetores são ocupados por células vegetais, enquanto os outros permanecem no biotrófica interação zona^5,6,7,8. Um efetor apoplástica é UmPit2, que interage com proteases apoplástica milho para impedir a libertação da sinalização do peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplástica protease atividade^9,10.

Nas últimas décadas, U. maydis tornou-se não apenas um modelo para a genética de fungosas na interação planta-patógeno, mas também uma ferramenta valiosa na biotecnologia devido a um ciclo de vida bem compreendida, fácil acessibilidade genética e expressão heteróloga de secretado proteínas^11,12,13. Foram determinados sinais para ambos secreção de proteína convencional e não convencional que permite o controle de modificações do posttranslational¹⁴. Recentemente, U. maydis foi empregado como uma ferramenta de cavalo de Troia para estudar pequeno, secretada milho proteínas em situ¹⁵. A abordagem de cavalo de Troia foi usada com sucesso para analisar a função da proteína secretada, pequena ZmMAC1 que está envolvido no desenvolvimento da antera. ZmMAC1 induz a divisão periclinal de células pluripotentes e especificação de destino célula do recém-formado células¹⁵. Pelo mesmo método, a função biológica do milho associada a danos peptide ZmZIP1 foi revelada. U. maydis segregar o milho que zmzip1 resultou na deficiente formação de tumor¹⁰. Assim, o cavalo de Troia abordagem representa uma valiosa rota alternativa à proteína em situ estudos com alta resolução spatiotemporal que faz nem exigem geração de linhas de transformação de milho estável nem infiltração de tecido com heterologously proteínas expressas e purificadas. Em particular, a estratégia do cavalo de Troia permite a secreção de qualquer proteína heteróloga para o apoplasto milho e comparação direta de infectados contra células não infectadas planta dentro do mesmo tecido.

Este protocolo ilustra as principais etapas para a geração de uma estirpe de cavalo de Troia U. maydis para estudar uma proteína de interesse. Além disso inclui informações precisas sobre os procedimentos de infecção de três tipos de tecido diferentes de milho (folhas adultas, borlas e orelhas) com U. maydis, que é um pré-requisito para estudar a função de progressão e proteína de infecção spatiotemporal nestes tecidos alvo. Sem mais especificações são determinado na amplificação de gene milho e microscópicas de imagens técnicas, uma vez que estas etapas são alvo específico e dependente do instrumento. Assim, o presente protocolo é dirigido aos usuários experientes de técnicas padrão de biologia molecular.

Protocolo

1. construção de um cavalo de Troia maydis U.

Nota: Veja a Figura 1.

1. Amplifica um gene de interesse do milho do cDNA usando as primeiras demão gene-específico e uma correcção DNA polimerase. Clonar o principal produto do PCR e transformar a construção em Escherichia coli , seguindo as instruções do fornecedor do plasmídeo. Verifique se o gene correto da sequência de interesse pelo prior de sequenciamento Sanger usar para as próximas etapas da clonagem.
   Nota: Especificações de PCR precisam ser otimizado devido às especificidades de sequência da primeira demão e condições de reação ideal DNA polimerase.
2. Desenho de primers para amplificar o milho gene de interesse sem a sequência de codificação um peptídeo sinal (SP).
3. Estender o 5´ final do primer reverso com o motivo RSIATA e um Ncoeu corte local (tabela 1).
4. Amplifica o milho gene de interesse com uma correcção DNA polimerase usando a construção PCR gerada em 1.1, como o modelo PCR.
5. Duplo-digerir o produto do PCR e do plasmídeo de transformação U. maydis , p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2Zm -mac1-mCherry-Ha¹⁵, com Xbaeu e Nco I. purificar o produto do PCR digerido e plasmídeo.
6. Ligar o produto do PCR digerido no p123-P_pit2-Sp_Umpit2Zm -mac1-mCherry-Ha modelo_Umusando T4 DNA ligase, seguindo as instruções do manufacturer´s. Transformar o produto de ligadura em Escherichia coli e verifique se o gene correto da sequência de interesse por Sanger sequenciamento.
7. Linearizar a p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2Zm -gene de interesse-mCherry-Ha com a enzima de restrição Sspeu e transformação de DNA para o solopathogenic U. maydis Coe SG200¹⁶. Isolar o U. maydis transformants pela seleção carboxin e confirmar transformants isolados por Southern blot análise¹⁶.
   Nota: Para cada proteína de interesse, pelo menos três independentes U. maydis transformants deve ser isolado e analisado para estimar os efeitos de fenótipo de mutações aleatórias de fundo.

2. meios de cultura

1. Preparar YEPSlight líquido médio¹⁶: extracto de levedura de 1,0% (p/v), 0,4% (p/v)-Bacto peptona e 0,4% (p/v) de sacarose. Dissolver todos os componentes em ddH₂O e autoclave a 121 ° C por 15 min; autoclave a uma temperatura mais elevada, por um longo período de tempo ou repetidamente, reduziria a qualidade do meio.
2. Preparar batata-dextrose-ágar (ágar-PD)²⁰: 3,9% (p/v) de batata dextrose agar e 1,0% (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Misturar todos os componentes diretamente na garrafa para autoclave e adicione O ddH₂mais uma barra de agitação magnética. Autoclave a 121 ° C por 15 min; autoclave a uma temperatura mais elevada, por um longo período de tempo ou repetidamente, reduziria a qualidade do meio.
3. Preparar o PD-carvão ágar²⁰: 3,9% (p/v) batata dextrose ágar-ágar, carvão de 1% (p/v) e 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Misturar todos os componentes diretamente na garrafa para autoclave e adicione O ddH₂mais uma barra de agitação magnética. Autoclave a 121 ° C por 15 min; autoclave a uma temperatura mais elevada, por um longo período de tempo ou repetidamente, reduziria a qualidade do meio.

3. planta de infecção

1. Executar análise de milho divisão celular em resposta ao cavalo de Troia, entregado a proteína (por exemplo, à base de microscopia célula contando) previamente. U. maydisinduzida proliferação celular milho e formação de tumor subsequentes começa em torno de 4-5 dias pós infecção. As avaliações quantitativas doença dependem do tecido e devem ser realizadas de 6 a 14 dias pós infecção.
   Nota: Diferentes cultivares de milho mostram diferentes níveis de suscetibilidade à infecção U. maydis . Milho cvs W23, A188, sílex de Gaspe, cedo Golden Bantam ou Va35 mostrar sensibilidade para este patógeno e são, portanto, as cultivares adequadas para estudos de cavalo de Troia.
2. Preparação do inóculo maydis U.
   1. Inclua a estirpe do progenitor SG200 como controlo negativo em todos os experimentos de cavalo de Troia para estimar os efeitos colaterais sobre a infecção pela cepa transgênica. Aqui, use uma tensão U. maydis , expressando uma versão não-segregada da proteína de interesse, como controlo negativo. No entanto, por razões de exequibilidade (por exemplo, maiores seleções), a cepa progenitora pode ser a escolha mais fácil de controlar.
   2. Antes de iniciar o experimento, estime o que equivale de cultura de infecção é necessários. Tenha em mente que a infecção de cada planta requer 1-1,5 mL de suspensão de U. maydis depende do tipo de tecido de milho.
      Nota: Aproximadamente 1 mL de uma cultura da noite é suficiente para a diluição de uma OD₆₀₀ de 0,2 em 20 mL de meio de_luz YEPS, e 25 mL de uma cultura de U. maydis com uma OD₆₀₀ de 0.8-1.0 são suficientes para a infecção de plantas de 13-16.
   3. Zero U. maydis de agar um PD da placa usando uma pipeta Pasteur estéril, inocular em 5 mL de meio de_luz YEPS e deixar a cultura crescer a 28 ° C, com agitação constante a 200 rpm por 16 h.
   4. Antes da infecção, examine a cultura de inoculação de U. maydis por microscopia de luz padrão para crescimento adequado e contaminação bacteriana na ampliação de X 400.
      Nota: Em uma cultura adequada, apenas o fungo em forma de charuto é visível (Figura 2).
   5. Misture 900 µ l de fresco YEPS_luz com 100 µ l da cultura durante a noite e medir o OD₆₀₀ usando meio de_luz YEPS como um espaço em branco na análise Espectrofotômetro.
   6. Diluir a cultura durante a noite com meio de_luz YEPS fresco para uma OD₆₀₀ de 0.2 e deixar a cultura crescer a 28 ° C, com agitação constante a 200 rpm até atingir a fase de crescimento de log mid indicada por overdose_{600 nm} de 0.8-1.0.
      Nota: U. maydis células duplicar a cada 2 h sob essas condições, assim, o desejado de OD₆₀₀ é alcançado após 4-5 h de cultivo.
   7. Recolher as células em OD₆₀₀ de 0.8-1.0 por fiação a 3.000 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.
   8. Lave o centrifugado uma vez com o ddH₂O. Para este efeito, adicionar um volume de cultura de DDQ₂O, rotação com 3000 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.
   9. Ressuspender as células cuidadosamente em ddH₂O usando uma pipeta de vidro de 20 mL, ajustando assim o OD final₆₀₀ 3.0 (para um ensaio de cavalo de Troia) ou 1.0 (para classificação da doença).
3. Verificação do cavalo de Troia: em planta de secreção da proteína do milho fusão
   1. Infectar plântulas de milho com um cavalo de Troia cepa¹⁷.
   2. Realize imagens microscópicas de mudas infectadas em 2-3 dias pós infecção usando um microscópio confocal de varredura a laser. Para este fim, excisar um pedaço retangular da folha 1 cm abaixo do ponto de injeção, colocar a amostra numa lâmina de microscópio e adicionar uma gota de DDQ₂O. Para visualizar a proteína de fusão de mCherry, excitar o espécime em λ = 561 nm e emissão recorde em λ = 580-630 nm.
4. Infecção de folhas de milho adultas
   1. Cultivar plantas de milho para a fase de folhas adultas (pelo menos quando da folha 7 cresce dentro do caule).
      Nota: Este estágio é alcançado após quatro semanas após a sementeira sob condições de estufa de 14 h, h do dia/10 de 28 ° C, ritmo de noite de 22 ° C usando CV W23. Duração pode variar com as condições de cultivar e estufa de milho.
   2. Transferir a cultura U. maydis (ver 3.2.9) uma seringa de 3 mL com agulha hipodérmica 20 x 1.
   3. Pressione o talo cuidadosamente para localizar o tecido meristema do caule. A base do meristema pode ser distinguida por uma transição de talo mais duro de tecido mais suave.
   4. Marca a meristema no talo usando uma caneta.
   5. Injecte 1,5 mL de cultura U. maydis 1 cm acima do tiro meristema ou meristema de inflorescência.
   6. Taxa de sintomas da doença em 6 e 12 dias pós infecção.
5. Infecção de borlas
   1. Cultivar plantas de milho até atingir o estágio de borla.
      Nota: Um cronograma detalhado sobre o desenvolvimento da antera e pendão em milho CV. W23 foi descrito anteriormente,¹⁸¹⁹. Borlas, contendo pre-meióticas anteras são altamente suscetíveis à infecção U. maydis ; no milho CV. W23 borlas são do tamanho de 4 a 7 cm.
   2. Pressione o talo cuidadosamente para localizar a borla no tronco.
   3. Marca a ponta e a base da borla na haste usando uma caneta.
   4. Transferir a cultura U. maydis (ver 3.2.9) uma seringa de 3 mL com agulha hipodérmica 20 x 1.
   5. Injete 1,5 mL do inóculo em torno o pendão. Para assegurar a distribuição igual do inóculo, lentamente coloque 0,5 mL cada na ponta, a parte do meio e a base da borla marcada com a caneta.
   6. Taxa de sintomas da doença em 10 dias pós infecção.
6. Infecção dos ouvidos
   Nota: o desenvolvimento de tecido de orelha difere em diferentes cultivares de milho e as condições da estufa e devem ser cuidadosamente observado antes da inoculação. Orelhas, começando a superar sedas são altamente suscetíveis à infecção U. maydis .
   1. Transferir a cultura U. maydis (ver 3.2.9) uma seringa de 3 mL com agulha hipodérmica 20 x 1.
   2. Injete a agulha de inoculação para o espaço entre as folhas de casca tão profundamente quanto possível, sem ferir o ouvido.
   3. Lançamento 1,5 mL do inóculo em torno da orelha.
   4. Remova a seringa e agulha e massagear cuidadosamente o cob para distribuir a solução U. maydis igualmente.
   5. Taxa de sintomas da doença em 14 dias pós infecção.
7. Confirmar a viabilidade do inóculo maydis U.
   1. Queda de 10 µ l de inóculo numa placa de ágar carvão PD e incubar a temperatura ambiente por 2 dias.
      Nota: Se a respectiva cultura U. maydis é capaz de filamentos forma, micélio branco, macio torna-se visível (Figura 5)

Resultados

Construções para experimentos de cavalo de Troia U. maydis são clonadas em plasmídeo p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2-gene de interesse-mCherry-Ha. O milho gene de interesse é fundido a uma repórter de fluorescência de mCherry e um epítopo HA-marca. A expressão da proteína de fusão está sob controle dopit2 U. maydis Um promotor que é especificamente ativa...

Discussão

Pesquisa de cultura moderna exige protocolos de análise molecular, a genética e os níveis de proteína. Genética de acessibilidade através de transformação não é disponível ou ineficiente e demorado para a maioria das espécies de culturas como o milho. Além disso, ferramentas genéticas confiáveis tais como sistemas de repórter do promotor são escassas, o que torna difícil para o estudo da função das proteínas in situ com alta resolução spatiotemporal nos sítios de tecidos distintos. Apopl?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	B. Braun	4606027V
23 G x 1 1/4 hypodermic needle	B. Braun	4657640
Bacto Peptone	BD	211677
cDNA from maize			from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal	Sigma-Aldrich	05105
Confocal laser scanning microscope			use locally available equipment
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm)	Sarstedt	67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm			use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification			use locally available equipment
Nco I	NEB	R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha			please contact the corresponding author
Pasteur pipet (glass, long tip)	VWR	14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO	Thermo Fisher Scientific	K280002	can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar	VWR	90000-745
Sharpie pen			use locally available equipment
Spectrophotometer			use locally available equipment
Ssp I	NEB	R0132
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
T4 DNA ligase	NEB	M0202
TRIS	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Xba I	NEB	R0145
Yeast extract	BD	212750