С помощью пузырчатая maydis как троянский конь в месте доставки кукурузу белков

Эта работа описывает клонирования штамма троянский конь пузырчатая maydis на месте доставки секретируемые белки кукурузы в три различных видов кукурузы тканей.

Аннотация

Вдохновленный Homer´s троянский конь миф, мы инженерии кукурузы возбудителя пузырчатая maydis доставить секретируемые белки в кукурузы апопласт, позволяющие в естественных условиях фенотипического анализа. Этот метод не полагаться на кукурузу трансформации, но подвиги микробной генетики и секреторную возможности патогенов. Здесь он позволяет осмотр в естественных условиях доставлены секретируемые белки с высоким пространственно-временных резолюции на различные виды сайтов инфекции и тканей. Троянский конь стратегия может быть использован для временно дополнять кукурузы фенотипы функция потерь, функционально характеризовать доменов протеина, анализировать-целевого белка эффекты, или для изучения передозировка играющий белка, что делает его мощным инструментом для изучений протеина в системе урожая кукурузы. Эта работа содержит точный протокол о том, как генерировать штамм троянский конь, следуют стандартизированных инфекции протоколы применить этот метод к трем типам различных кукурузы ткани.

Введение

Возбудитель biotrophic maydis пузырчатая является возбудителем болезни головня кукурузы¹. Он заражает все надземные части кукурузы, что приводит к большой опухоли, которые содержат споры melanized, черный. На глобальном уровне U. maydis оценивается вызвать ежегодные потери около 2% урожая кукурузы, в то время как опухоли ценятся как гастрономическим деликатесом в Мексике. Аппрессории, который выделяет лизировать ферменты клеточной стенки проникнуть первый слой кукурузы эпидермальных клеток инициируется завод инфекции. С сайта первичной инфекции U. maydis растет внутриклеточно и intercellularly, вторгаясь клетки один или два слоя каждый день¹^,². Успешное инфекции приводит к гипертрофии завод, который превращается в видимые опухоли после пяти дней должность инфекции¹^,³^,⁴. На всех стадиях инфекции грибные гифы инвагинировать мембраны цитоплазме завод без прямого контакта в цитоплазме принимающей¹^,². Жесткие apoplasmic пространство между заражение гифы и завод плазматической мембраны считается хост/возбудителя интерактивный сайт, называется biotrophic зоны взаимодействия. Для того, чтобы преодолеть иммунной системы растений, U. maydis выделяет массив эффекторных белков в biotrophic взаимодействия зоны¹. Некоторые эффекторов занимают растительных клеток, в то время как другие остаются в biotrophic взаимодействия зоны⁵^,⁶^,^,⁷⁸. Один apoplastic эффектора — UmPit2, который взаимодействует с apoplastic кукурузы протеазы для предотвращения выхода сигнальный пептид ZmZIP1 от ZmPROZIP^,apoplastic протеазы деятельность⁹¹⁰.

За последние десятилетия U. maydis стал не только модель для грибковых генетики растений возбудитель взаимодействия, но и ценным инструментом в области биотехнологии в силу понятных жизненного цикла, доступность генетических и гетерологичных выражение выделяется белки¹¹^,¹²^,¹³. Сигналы для обоих традиционных и нетрадиционных белка секрецию были определены разрешение контроль Посттрансляционная изменения¹⁴. Недавно U. maydis работал как троянский конь инструмент для изучения малых, выделяется кукуруза белков в situ¹⁵. Троянский конь подход успешно использовался для анализа функции небольшой, выделяется белка ZmMAC1, который участвует в развитии пыльников. ZmMAC1 вызывает periclinal разделение плюрипотентных клеток и клеток судьба спецификации новообразованной клетки¹⁵. Таким же методом была выявлена биологическая функция кукурузы ущерб связанных пептидной ZmZIP1. U. maydis секреции кукурузы, ZmZIP1 привели к нарушение формирования опухоли¹⁰. Таким образом троянский конь подход представляет ценные альтернативный маршрут для белка в situ исследований с высоким пространственно-временных резолюцией, которая делает не требуют поколение стабильной кукурузы преобразование линии ни инфильтрации тканей с участием выраженное и очищенных белков. В частности троянский конь стратегия позволяет секрецию любой гетерологичных белка в кукурузы Апопласт и прямое сравнение инфицированных и неинфицированных растительных клеток внутри же ткани.

Этот протокол иллюстрирует основные шаги для создания штамма троянский конь U. maydis для изучения протеина интереса. Она далее включает в себя точную информацию о процедурах инфекции трех типов различных кукурузы ткани (взрослый листья, кистями и уши) с U. maydis, который является предпосылкой для изучения пространственно-временных инфекции прогрессии и белков функции в этих тканях-мишенях. Без дальнейших спецификаций приводятся кукурузы амплификации генов и микроскопических изображений техники, поскольку эти шаги являются целевыми и инструмент зависимой. Таким образом этот протокол предназначен для опытных пользователей стандартных молекулярные методы биологии.

протокол

1. Строительство U. maydis троянский конь

Примечание: Смотрите Рисунок 1.

Усилить ген интереса от кукурузы кДНК гена специфические праймеры и корректура ДНК-полимеразы. Клон основной продукт PCR и превратить конструкцию в E. coli следуя инструкциям производителя плазмида. Проверьте правильный гена интереса последовательности Сэнгер последовательности до использования клонирования выполнение следующих шагов.
Примечание: ПЦР спецификации должны быть оптимизированы из-за специфики последовательность праймера и условий реакции оптимального ДНК-полимеразы.
Дизайн праймеров для того чтобы усилить кукурузы гена интереса без последовательности кодирования сигнала пептид (SP).
Расширение 5´ конец обратной праймера с RSIATA мотив и НКОя резки сайта (Таблица 1).
Усилить кукурузы гена интереса с корректура ДНК-полимеразы, с помощью ПЦР конструкции сгенерирована 1.1 как шаблон ПЦР.
Двухместный Дайджест продукт PCR и U. maydis трансформации плазмида, p123-P_Um_pit2-Sp_Um_pit2- Zmmac1-mCherry-ха¹⁵, с Xbaя и НКО I. очищают перевариваются продукт PCR и плазмиды.
Перевязать переваривается продукт PCR в p123-P_Um_pit2-Sp_Um_pit2- Zmmac1-mCherry-ха шаблон с помощью T4 ДНК лигаза следуя инструкциям manufacturer´s. Преобразовать перешнуровки продукта в E. coli и проверять правильную гена интереса последовательности Сэнгером последовательности.
Линеаризации p123-P_Um_pit2-Sp_Um_pit2- Zmгена интереса mCherry-ха с энзима ограничения SspI и преобразование ДНК в solopathogenic U. maydis штамма SG200¹⁶. Изолировать U. maydis трансформантов, carboxin выбор и подтвердить, что изолированные трансформантов на юге блот анализ¹⁶.
Примечание: Для каждого протеина интереса, по крайней мере три независимых U. maydis трансформантов должны быть изолированы и проанализированы для оценки воздействия любой фенотип фон случайных мутаций.

2. Культура СМИ

Подготовка YEPSlight жидкость средних¹⁶: 1,0% (w/v) дрожжей экстракт, 0,4% (w/v) Bacto-Пептон и 0,4% (w/v) сахарозы. Распустить все компоненты в ddH₂O и автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин; автоклавирование при более высокой температуре, на более длительный период времени или неоднократно снизит качество среды.
Готовить картофель декстроза агар (PD-агар)²⁰: 3,9% (w/v) картофеля декстроза агар и 1,0% (w/v) 1 М трис-HCl рН 8,0 (ФК 0,01 М). Смешайте все компоненты непосредственно в бутылку для автоклавирования и добавить ddH₂O плюс бар магнитные перемешать. Автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин; автоклавирование при более высокой температуре, на более длительный период времени или неоднократно снизит качество среды.
Подготовить PD-уголь агар²⁰: 3,9% (w/v) картофеля декстроза агар, 1% (w/v) уголь и 1,0% (v/v) 1 М трис-HCl рН 8,0 (ФК 0,01 М). Смешайте все компоненты непосредственно в бутылку для автоклавирования и добавить ddH₂O плюс бар магнитные перемешать. Автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин; автоклавирование при более высокой температуре, на более длительный период времени или неоднократно снизит качество среды.

3. завод инфекции

Выполнить анализ кукурузы деления клеток в ответ на троянский конь, доставлены белков (например, подсчет на основе микроскопии клетки) заранее. U. maydis -индуцированной пролиферации клеток кукурузы и образования последующих опухоли начинается около 4-5 дней поста инфекции. Оценки количественных болезни зависят от тканей и должно выполняться от 6 до 14 дней поста инфекции.
Примечание: Различных сортов кукурузы показывают различные уровни восприимчивость к инфекции U. maydis . Кукурузы cпротив W23, A188, Флинт Гаспе, ранней Золотой петух или Va35 Показать восприимчивость к этой возбудителя и таким образом подходящих сортов для исследования троянский конь.
Подготовка U. maydis посевным материалом
1. Включать прародитель штамм SG200 как отрицательный контроль в всех троянский конь экспериментов для оценки побочных эффектов на инфекции, трансгенных штамм. Здесь используйте штамма U. maydis выражения протеина интереса как отрицательный контроль версии, не выделяется. Однако по соображениям целесообразности (например, больше фильмов), прародитель деформации может быть легче выбор элемента управления.
2. Перед началом эксперимента, оцените, какое количество инфекции культуры необходимы. Имейте в виду, что инфекция каждого завода требует 1-1,5 мл суспензии U. maydis зависит от типа кукурузы ткани.
  Примечание: Примерно 1 мл ночь культуры является достаточным для разбавления ОД₆₀₀мл 0,2 в 20 средних YEPS_свет , и 25 мл с ОД₆₀₀ 0,8-1,0 U. maydis культуры являются достаточными для заражения растений 13-16.
3. Царапинам U. maydis от PD агар пластины с помощью стерильные пипетки Пастера, прививать в 5 мл YEPS_свет среднего и пусть культуры растут на 28 ° C с постоянной тряски на 200 rpm для 16 h.
4. До инфекции изучите U. maydis прививки культуры, стандартные световой микроскопии для правильного роста и бактериального загрязнения при 400-кратном.
  Примечание: В подходящих культуре только сигары в форме гриба является видимым (рис. 2).
5. Смешать 900 мкл свежие YEPS_светс 100 мкл ночь культуры и измерить ОД₆₀₀ с помощью YEPS_светсреднего как пробелы в анализе спектрофотометра.
6. Разбавить ночь культуры с свежие среднего_свет YEPS ОД₆₀₀ 0.2 и пусть культуры растут на 28 ° C с постоянной тряски на 200 об/мин до достижения фазы роста среднего журнала указанного ОД_{600 Нм} 0,8-1,0.
  Примечание: Ю. maydis клетки дублировать каждые 2 ч в этих условиях, достигнув желаемого ОД₆₀₀после 4-5 ч культивирования.
7. Урожай клетки на₆₀₀ OD 0.8-1.0, спиннинг на 3000 x g 10 мин и удалить супернатант.
8. Помыть лепешка клетки один раз с ddH₂O. Для этой цели добавьте один объем культуры ddH₂O, спина с 3000 x g 10 мин и удалить супернатант.
9. Ресуспензируйте тщательно Пелле клеток в ddH₂O, с помощью пипетки стекла 20 мл, тем самым регулируя окончательный ОД₆₀₀до 3.0 (для assay троянский конь) или 1.0 (для болезни рейтинг).
Проверка троянский конь: в planta секрецию кукурузы синтез белка
1. Заразить кукурузы саженцев с троянский конь штамм¹⁷.
2. Выполняйте микроскопических изображений зараженных проростков на 2-3 дня пост инфекции с помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. С этой целью акцизный прямоугольный кусок листьев 1 см ниже точки инъекции, поместите образец на слайд микроскопа и добавить каплю ddH₂O. Чтобы визуализировать mCherry синтез белка, возбуждают образца на λ = 561 Нм и записи выбросов при λ = 580-630 Нм.
Инфицирования взрослых листьев кукурузы
1. Возделывать кукурузные растения на сцену взрослых листьев (когда по крайней мере лист 7 растет внутри стебля).
  Примечание: Этот этап достигнут через четыре недели после посева в тепличных условиях 14 h, день/10 h 28 ° C, 22 ° C ночь ритм с помощью cv. W23. Продолжительность может варьироваться с кукурузы сорта и парниковых условий.
2. Передача U. maydis культуры (см. 3.2.9) в 3-мл шприц с иглой подкожных 20 g x 1.
3. Нажмите стебель тщательно, чтобы локализовать ткани Меристемы стебля. База Меристемы можно отличить по переход от сложнее стебля в мягкие ткани.
4. Марк Меристемы на стебле, с помощью пера.
5. Придать 1,5 мл U. maydis культуры 1 см выше стрелять Меристемы или соцветие Меристемы.
6. Интенсивность симптомов болезни в 6 и 12 дней поста инфекции.
Инфекция кистями
1. Растут растения кукурузы до достижения стадии кисточкой.
  Примечание: Подробный график на пыльников и кисточкой развития кукурузы cv. W23 был ранее описанных¹⁸¹⁹. Кистями, содержащие предварительно meiotic пыльники весьма чувствительны к инфекции U. maydis ; в кукурузы cv. W23 кистями являются размер 4-7 см.
2. Нажмите стебель тщательно, чтобы локализовать кисточкой в стволе.
3. Марк кончик и база кисточкой на оси с помощью пера.
4. Передача U. maydis культуры (см. 3.2.9) в 3-мл шприц с иглой подкожных 20 g x 1.
5. Придать 1,5 мл посевным материалом вокруг кисточкой. Для обеспечения равного распределения посевным материалом, медленно место 0,5 мл на кончик, средняя часть и база кисточкой, помеченные с помощью пера.
6. Ставка на 10 дней поста инфекции симптомы болезни.
Инфекция ушей
Примечание: развития ткани уха отличается в различных сортов кукурузы и тепличных условиях и должны тщательно соблюдаться до прививки. Уши начинают перерастать шелка весьма чувствительны к инфекции U. maydis .
1. Передача U. maydis культуры (см. 3.2.9) в 3 мл шприц с иглой подкожных 20 G x 1.
2. Inject прививка иглы в пространство между шелухи листья так глубоко, как можно без ранив уха.
3. Версия 1.5 мл посевным материалом вокруг уха.
4. Извлеките шприц и иглу и тщательно массаж початка распространить решение U. maydis одинаково.
5. Стоимость на 14 дней поста инфекции симптомы болезни.
Подтвердить жизнеспособность U. maydis посевным материалом
1. Падение 10 мкл посевным материалом на тарелку уголь агар PD и инкубации при комнатной температуре на 2 дня.
  Примечание: Если соответствующие U. maydis культура является возможность формы нитей накала, пушистые, белый грибница становится видимым (рис. 5)

Результаты

Конструкции для U. maydis троянский конь экспериментов клонируются в плазмиду p123-P_Um_pit2-Sp_pit2_Um-гена интереса mCherry-ха. Кукурузы гена интереса сливается с репортером флуоресценции mCherry и epitope ха-тег. Выражение синтез ...

Обсуждение

Исследование современных культур требует протоколы для молекулярного анализа генетических и уровни белка. Генетическая доступность через преобразование не доступен или неэффективным и трудоемким для большинства видов сельскохозяйственных культур, например кукурузы. Кроме тог...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Томас Дресселгауз, Мартин Parniske, Нуреддин Djella и Армин Хильдебранд для предоставления лаборатории пространства и растительных материалов. Оригинальные работы по методу троянский конь было поддержано Леопольдина постдока стипендий и NSF проекта IOS13-39229. Работы, представленные в этой статье было поддержано SFB924 (проекты A14 и В14) от DFG.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	B. Braun	4606027V
23 G x 1 1/4 hypodermic needle	B. Braun	4657640
Bacto Peptone	BD	211677
cDNA from maize			from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal	Sigma-Aldrich	05105
Confocal laser scanning microscope			use locally available equipment
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm)	Sarstedt	67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm			use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification			use locally available equipment
Nco I	NEB	R0193
p123-P_Um_pit2-Sp_Um_pit2-Zmmac1-mCherry-Ha			please contact the corresponding author
Pasteur pipet (glass, long tip)	VWR	14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO	Thermo Fisher Scientific	K280002	can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar	VWR	90000-745
Sharpie pen			use locally available equipment
Spectrophotometer			use locally available equipment
Ssp I	NEB	R0132
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
T4 DNA ligase	NEB	M0202
TRIS	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Xba I	NEB	R0145
Yeast extract	BD	212750