À l’aide d’Ustilago maydis comme un cheval de Troie pour la livraison de la protéine maïs In Situ

Résumé

Cet ouvrage décrit le clonage d’une souche de cheval de Troie Ustilago maydis pour la prestation in situe des protéines sécrétées de maïs en trois différents types de tissus de maïs.

Résumé

Inspiré par le mythe de cheval Troie Homer´s, nous avons conçu le pathogène maïs Ustilago maydis pour fournir des protéines sécrétées dans l’apoplaste maïs permettant une analyse phénotypique in vivo. Cette méthode ne s’appuie pas sur la transformation de maïs, mais exploite la génétique microbienne et des capacités sécrétoires des agents pathogènes. Il permet aux présentes, inspection in vivo livré des protéines sécrétées à haute résolution spatio-temporelle à différents types de tissus et de sites d’infection. La stratégie du cheval de Troie peut être utilisée en complément transitoirement maïs phénotypes de perte de fonction, afin de caractériser sur le plan fonctionnel des domaines protéiques, pour analyser les effets de la protéine hors cible, ou d’étudier un surdosage onside protéine, ce qui en fait un outil puissant études de protéine dans le système de récolte de maïs. Cet ouvrage contient un protocole précis sur la façon de générer une souche de cheval de Troie suivie de protocoles normalisés de l’infection à appliquer cette méthode à trois types de différents tissus de maïs.

Introduction

Le pathogène biotrophe Ustilago maydis est l’agent causal du maïs charbon maladie¹. Il infecte tous les parties aériennes de maïs ayant pour résultat les grosses tumeurs qui renferment des spores mélanisées, noir. Au niveau mondial, U. maydis est estime susceptible de causer une perte annuelle d’environ 2 % du rendement du maïs, tandis que les tumeurs sont appréciés comme un délice gastronomique au Mexique. Infection des plantes est initiée par un appressorium qui sécrète des enzymes lyse de la paroi cellulaire pour pénétrer dans la première couche de cellules épidermiques de maïs. Partir d’un site d’infection primaire, U. maydis se développe dans les cellules et entre les cellules, envahir les cellules d’une à deux couches chaque jour^1,2. Résultats infection réussie dans l’hypertrophie de plante qui se transforme en tumeurs visibles sur cinq jours après l’infection^1,3,4. Durant tous les stades de l’infection, les hyphes fongiques invaginent la membrane de cytoplasme de plante sans aucun contact direct au cytoplasme hôte^1,2. L’espace apoplasme serré entre les hyphes infectant et la membrane plasmique de la plante est réputé être le site interactif de l’hôte/pathogène, appelé la zone d’interaction biotrophe. Afin de surmonter le système immunitaire inné de plante, U. maydis sécrète un tableau des protéines effectrices dans biotrophe interaction zone¹. Certains effecteurs sont absorbés par les cellules végétales, tandis que d’autres restent dans l’interaction biotrophe zone^5,6,7,8. Un effecteur apoplastique est UmPit2, qui interagit avec des protéases apoplastique maïs pour éviter la sortie de la signalisation du peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP par apoplastique protéase activité^9,10.

Au cours des dernières décennies, U. maydis est devenu non seulement un modèle pour la génétique des champignons dans l’interaction plante-pathogène, mais aussi un outil précieux en matière de biotechnologie en raison d’un cycle de vie bien compris, facilité d’accès génétique et expression hétérologue de sécrétée protéines^11,12,13. Signaux pour la sécrétion de ces deux protéines conventionnelles et non conventionnelles ont été déterminées en permettant le contrôle des modifications post-traductionnelles¹⁴. Récemment, U. maydis a été employée comme un outil de cheval de Troie pour étudier petit, sécrétée protéines de maïs en situ¹⁵. L’approche d’un cheval de Troie a été utilisé avec succès pour analyser la fonction de la protéine de petite, sécrétée ZmMAC1 qui est impliqué dans le développement de l’anthère. ZmMAC1 induit la division Péricline de cellules pluripotentes et la spécification des cellules nouvellement formé¹⁵sort des cellules. Selon la même méthode, la fonction biologique du peptide associés aux dommages maïs ZmZIP1 a été révélée. U. maydis sécrétant le maïs que zmzip1 entraîné avec facultés affaiblies tumeur formation¹⁰. Ainsi, le cheval de Troie approche représente un itinéraire alternatif précieux à la protéine de situ études à haute résolution spatio-temporelle qui ne fait ni exiger génération de lignes de transformation de maïs stable ni infiltration des tissus avec façon hétérologue protéines exprimées et purifiées. En particulier, la stratégie du cheval de Troie permet la sécrétion d’une protéine hétérologue dans l’apoplaste maïs et une comparaison directe des infectés contre les cellules végétales non infectés dans le même tissu.

Ce protocole illustre les principales étapes pour générer une souche de cheval de Troie d’u. maydis afin d’étudier une protéine d’intérêt. Il comprend également des informations précises sur les procédures de l’infection de trois types de différents tissus de maïs (les feuilles adultes, les glands et les oreilles) avec U. maydis, qui est une condition sine qua non pour l’étude de la fonction spatio-temporelle de l’infection de progression et de protéines dans ces tissus de cible. Aucune précisions ne sont donnée sur maïs amplification génique et microscopiques imaging techniques, étant donné que ces étapes sont spécifiques à la cible et instrument-dépendante. Ainsi, le présent protocole s’adresse aux utilisateurs expérimentés des techniques standard de biologie moléculaire.

Protocole

1. construction d’un cheval de Troie maydis U.

Remarque : Voir la Figure 1.

1. Amplifier un gène d’intérêt de maïs cDNA utilisant des amorces spécifiques de gènes et une relecture ADN polymérase. Cloner le principal produit PCR et transformer la construction de e. coli en suivant les instructions du fournisseur plasmide. Vérifiez le gène correct de la séquence d’intérêt par avant séquençage Sanger à utiliser pour les prochaines étapes de clonage.
   Remarque : Spécifications de PCR doivent être optimisées en raison des amorces séquence spécificités et conditions optimales ADN polymérase de la réaction.
2. Conception des amorces pour amplifier le gène d’intérêt de maïs sans la séquence codant pour un peptide signal (SP).
3. Étendre l’extrémité 5´ du primer inverse avec le motif RSIATA et un sous-officierje coupe site (tableau 1).
4. Amplifier le gène d’intérêt de maïs avec une relecture ADN polymérase utilisant la PCR construction générée en 1.1 comme le modèle de la PCR.
5. Double-digest du produit PCR et le plasmide de transformation U. maydis , p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2- Zmmac1-mCherry-Ha¹⁵, avec XbaI et Nco I. purifier le produit PCR digéré et les plasmide.
6. Ligaturer le produit PCR digéré dans le p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2- Zmmac1-mCherry-Ha modèle à l’aide de T4 DNA ligase suivant les instructions de manufacturer´s. Transformer le produit de ligation dans e. coli et vérifier le gène correct de la séquence d’intérêt par Sanger séquençage.
7. Linéariser la p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2Zm -gène d’intérêt-mCherry-Ha avec l’enzyme de restriction SspI et transformation ADN dans la de solopathogenic U. maydis souche SG200¹⁶. Isoler U. maydis transformants par sélection carboxin et confirmez isolés transformants par Southern blot analyse¹⁶.
   Remarque : Pour chaque protéine d’intérêt, au moins trois indépendants U. maydis transformants devraient être isolés et analysés pour estimer les effets du phénotype des mutations aléatoires fond.

2. les milieux de Culture

1. Préparer YEPSlight liquide moyen¹⁶: extrait de levure 1,0 % (p/v), 0,4 % (p/v) Bacto-Peptone et 0,4 % (p/v) de sucrose. Dissoudre tous les composants de ddH₂O et stériliser à 121 ° C pendant 15 min ; autoclave à une température plus élevée, pour une plus longue période de temps ou à plusieurs reprises réduirait la qualité du milieu.
2. Préparer les pommes de terre-dextrose-agar (PD-agar)²⁰: gélose dextrosée à la pomme de terre de 3,9 % (p/v) et 1,0 % (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (c.f. 0,01 M). Mélanger tous les composants directement dans la bouteille pour l’autoclavage et ajouter ddH₂O, plus une barre magnétique remuer. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min ; autoclave à une température plus élevée, pour une plus longue période de temps ou à plusieurs reprises réduirait la qualité du milieu.
3. Préparer les PD-fusain agar²⁰: gélose dextrosée de 3,9 % (p/v) de pommes de terre, charbon de bois de 1 % (p/v) et 1,0 % (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (c.f. 0,01 M). Mélanger tous les composants directement dans la bouteille pour l’autoclavage et ajouter ddH₂O, plus une barre magnétique remuer. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min ; autoclave à une température plus élevée, pour une plus longue période de temps ou à plusieurs reprises réduirait la qualité du milieu.

3. Infection des plantes

1. Effectuer une analyse de maïs la division cellulaire en réponse à un cheval de Troie livré des protéines (p. ex., axée sur la microscopie cellulaire compter) au préalable. U. maydisinduite par la prolifération des cellules de maïs et de la formation de tumeurs ultérieures commence autour de 4-5 jours après l’infection. Les évaluations quantitatives de la maladie dépendent du tissu et doivent être effectuées de 6 à 14 jours après l’infection.
   Remarque : Des cultivars de maïs distinctes montrent différents niveaux de sensibilité à l’infection d’u. maydis . Maïs cvs W23, A188, silex de Gaspé, Early Golden Bantam ou Va35 montrent une sensibilité envers ce pathogène et sont donc des cultivars adaptés pour les études de cheval de Troie.
2. Préparation de l’inoculum maydis U.
   1. Inclure la souche progénitrices SG200 comme témoin négatif dans toutes les expériences de cheval de Troie afin d’estimer les effets secondaires sur l’infection par la souche transgénique. Ici, utilisez une souche U. maydis exprimant une version non-sécrétée de la protéine d’intérêt comme témoin négatif. Toutefois, pour des raisons de praticabilité (p. ex., des projections plus grandes), la souche de l’ancêtre peut être le choix plus facile du contrôle.
   2. Avant de commencer l’expérience, estimer ce qui revient de la culture de l’infection est nécessaires. N’oubliez pas que l’infection de chaque plante nécessite 1 à 1,5 mL de suspension d’u. maydis dépendant du type de tissus de maïs.
      Remarque : Environ 1 mL d’une culture d’une nuit ne suffit pas pour la dilution à une OD₆₀₀ de 0,2 à 20 mL de milieu de_lumière d’Yep, et 25 mL d’une culture de l’u. maydis avec un OD₆₀₀ de 0,8 à 1,0 ne suffisent pas pour l’infection des plantes 13-16.
   3. Gratter U. maydis d’une gélose de PD sur plaque à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, ensemencer dans 5 mL de milieu de_lumière d’Yep et laisser la culture pousser à 28 ° C sous agitation constante à 200 tr/min pendant 16 h.
   4. Avant l’infection, examiner la culture de l’inoculation d’u. maydis par microscopie optique standard pour une bonne croissance et contamination bactérienne à un grossissement de X 400.
      Remarque : Dans une culture adéquate, seulement le champignon en forme de cigare est visible (Figure 2).
   5. Mélanger 900 µL d’Yep fraîche_lumière avec 100µl de la culture au jour le jour et mesurer l' OD₆₀₀ utilisant Yep_lumière milieu comme un vide dans l’analyse du spectrophotomètre.
   6. Diluer la culture au jour le jour avec un milieu frais Yep_lumière à une OD₆₀₀ de 0,2 et laisser la culture pousser à 28 ° C sous agitation constante à 200 tr/min jusqu'à atteindre la phase de croissance logarithmique indiquée par une OD_{600 nm} de 0,8 à 1,0.
      Remarque : U. maydis cellules dupliquer toutes les 2 h dans ces conditions, donc le désiré de l’OD₆₀₀ est atteint après 4-5 h de culture.
   7. Récolter les cellules à OD₆₀₀ de 0,8 à 1,0 par rotation à 3 000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.
   8. Laver le culot cellulaire une fois avec les ddH₂O. Pour cela, ajouter un volume de culture de ddH₂O, spin avec 3000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.
   9. Resuspendre le culot cellulaire soigneusement dans ddH₂O à l’aide d’une pipette de verre de 20 mL, ajustant ainsi la finale de l’OD₆₀₀ à 3.0 (pour un dosage de cheval de Troie) ou 1.0 (pour la notation de la maladie).
3. Vérification le cheval de Troie : planta la sécrétion de la protéine de fusion maïs
   1. Infecter les jeunes plants de maïs avec un cheval de Troie souche¹⁷.
   2. Effectuer une imagerie microscopique des plantules infectées à 2 ou 3 jours après l’infection à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. À cette fin, l’accise un morceau rectangulaire de la feuille 1 cm en dessous du point d’injection, placez l’échantillon sur une lame de microscope et ajouter une goutte de ddH₂O. Pour visualiser la protéine de fusion mCherry, exciter le spécimen à λ = 561 nm et l’émission record à λ = 580-630 nm.
4. Infection des feuilles de maïs adultes
   1. Cultiver des plants de maïs au stade des feuilles adultes (quelle feuille d’au moins 7 se développe au sein de la tige).
      Remarque : Ce stade est atteint après quatre semaines après semis en serre de 28 ° C jour/10 h, 14 h, rythme de nuit de 22 ° C à l’aide de CV W23. Durée peut varier selon les conditions maïs du cultivar et à effet de serre.
   2. Transférer la culture U. maydis (voir 3.2.9) dans une seringue de 3 mL avec une seringue hypodermique 20 x 1.
   3. Appuyer sur la tige avec précaution pour localiser le tissu méristématique dans la tige. La base du méristème se distingue par une transition de tige plus difficile pour les tissus plus doux.
   4. Marquer le méristème sur la tige à l’aide d’un stylo.
   5. Injecter 1,5 mL de la culture U. maydis 1 cm au-dessus du méristème caulinaire ou le méristème de l’inflorescence.
   6. Le taux de symptômes de la maladie à 6 et 12 jours après l’infection.
5. Infection des glands
   1. Cultiver les plants de maïs jusqu'à atteindre le stade de gland.
      Remarque : Une chronologie détaillée du développement anthère et gland en maïs CV W23 a été précédemment décrit¹⁸¹⁹. Glands contenant pré méiotiques anthères sont très vulnérables à l’infection d’u. maydis ; dans le CV de maïs W23 glands sont la taille de 4 à 7 cm.
   2. Appuyer sur la tige avec précaution pour localiser le gland à la tige.
   3. Marquer la pointe et la base de la frange sur la tige à l’aide d’un stylo.
   4. Transférer la culture U. maydis (voir 3.2.9) dans une seringue de 3 mL avec une seringue hypodermique 20 x 1.
   5. Injecter 1,5 mL de l’inoculum autour du gland. Afin d’assurer une distribution uniforme de l’inoculum, lentement verser 0,5 mL de chaque à la pointe, la partie centrale et la base de la panicule marquée avec le stylo.
   6. Taux de symptômes de la maladie à 10 jours après l’infection.
6. Infection des oreilles
   Remarque : développement des tissus de l’oreille est différente dans les différents cultivars de maïs et de conditions de serre et doit être soigneusement observé avant l’inoculation. Oreilles commençant à dépasser les soies sont très sensibles à l’infection par U. maydis .
   1. Transférer la culture U. maydis (voir 3.2.9) dans une seringue de 3 mL avec une seringue hypodermique 20 x 1.
   2. Injecter l’aiguille de l’inoculation dans l’espace entre les feuilles de balle aussi profondément que possible sans blesser l’oreille.
   3. Communiqué de 1,5 mL de l’inoculum autour de l’oreille.
   4. Retirer la seringue et l’aiguille et masser soigneusement la cob pour distribuer la solution U. maydis également.
   5. Taux de symptômes de la maladie à 14 jours après l’infection.
7. Confirmer la viabilité de l’inoculum maydis U.
   1. Déposer 10 µL de l’inoculum sur une gélose au fusain de PD et incuber à température ambiante pendant 2 jours.
      Remarque : Si le respectifs la culture U. maydis est capable de forment des filaments, mycélium blanc moelleux devient visible (Figure 5)

Résultats

Des constructions pour des expériences de cheval de Troie U. maydis sont clonées dans le plasmide p123-P_Umpit2-Sp_Umpit2-gène d’intérêt-mCherry-Ha. Le maïs gène d’intérêt est fusionné à un journaliste de fluorescence mCherry et un épitope HA-tag. L’expression de la protéine de fusion est sous contrôle du promoteurpit2 U. maydis mu qui est...

Discussion

Recherche sur les cultures modernes exige des protocoles pour l’analyse moléculaire sur la génétique et des niveaux de protéine. L’accessibilité génétique par transformation n’est pas disponible ou inefficaces et fastidieuse pour la plupart des espèces de cultures telles que le maïs. En outre, des outils génétiques fiables tels que les systèmes de journaliste promoteur sont rares, ce qui rend difficile d’étudier la fonction des protéines in situ avec une haute résolution spatio-temporelle ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	B. Braun	4606027V
23 G x 1 1/4 hypodermic needle	B. Braun	4657640
Bacto Peptone	BD	211677
cDNA from maize			from maize tissue expressing the gene of interrest
Charcoal	Sigma-Aldrich	05105
Confocal laser scanning microscope			use locally available equipment
Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm)	Sarstedt	67742
Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm			use locally available equipment
Light microscope with 400-fold magnification			use locally available equipment
Nco I	NEB	R0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha			please contact the corresponding author
Pasteur pipet (glass, long tip)	VWR	14673-043
pCR-Blunt-II-TOPO	Thermo Fisher Scientific	K280002	can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET
Potato Dextrose Agar	VWR	90000-745
Sharpie pen			use locally available equipment
Spectrophotometer			use locally available equipment
Ssp I	NEB	R0132
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
T4 DNA ligase	NEB	M0202
TRIS	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Xba I	NEB	R0145
Yeast extract	BD	212750