Fare Buzağılarına Tutarlı Masaj Benzeri Pertürbasyonların Uygulanması ve Bunun Sonucu Kas içi Basınç Değişikliklerinin İzlenmesi

Özet

Burada fare buzağılarına tanımlanmış mekanik yüklerin uygulanması ve eşlik eden kas içi basınç değişikliklerinin izlenmesi için protokolleri açıklıyoruz. Geliştirdiğimiz deneysel sistemler, fiziksel egzersiz ve masajın yararlı etkilerinin arkasındaki mekanizmayı araştırmak için yararlı olabilir.

Özet

Masaj genellikle ağrı ve iltihabı giderici için yararlı olduğu kabul edilmektedir. Önceki çalışmalarda iskelet kasları üzerinde masaj anti-inflamatuar etkileri rapor olmasına rağmen, arkasındaki moleküler mekanizmalar kötü anlaşılmaktadır. Biz son zamanlarda yerel döngüsel sıkıştırma uygulamak için basit bir cihaz geliştirdik (LCC), değişen genlikleri ile kas içi basınç dalgaları üretebilir. Bu cihazı kullanarak, LCC'nin makrofajların inflamatuar yanıtlarını yerinde modüle ettiğini ve immobilizasyona bağlı kas atrofisini hafifletdiğini gösterdik. Burada, lcc optimizasyonu ve uygulanması için protokolleri immobilizasyona bağlı inflamasyona ve fare arka larının iskelet kaslarının atrofisine karşı masaj benzeri bir müdahale olarak tanımlıyoruz. Geliştirdiğimiz protokol, fiziksel egzersiz ve masajın yararlı etkilerinin altında yatan mekanizmayı araştırmak için yararlı olabilir. Deneysel sistemimiz kas homeostazının mekanik regülasyonunun aydınlatılması için analitik yaklaşımın bir prototipini sağlar, ancak daha kapsamlı çalışmalar için daha fazla geliştirme yapılması gerekmektedir.

Giriş

Masaj genellikle hem ağrı kesici ve rekabetçi sporcular ve olmayan sporcular arasında fiziksel performansın iyileştirilmesi için yararlı olduğu kabul edilmektedir^1,2. Aslında, önceki çalışmalarda masaj yerel inflamasyon bastırır göstermiştir³ ve egzersiz sonrası kas hasarı kurtarma ister^4,5. Masajın yararlı etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir.

Masaj üzerine mekanistik araştırma ile zorluklardan biri hangi masaj gibi müdahaleler test edilir deneysel tekniklerin tekrarlanabilirlik ile ilgilidir. Önceki çalışmalarda, masaj taklit deneysel prosedürler çoğunlukla avuç içi ve parmak lar 6 gibi uygulayıcıların vücut parçaları kullanarak fiziksel müdahalelerin uygulanması içerir^6,7,8. Bu, büyüklüklerini, sıklıklarını, sürelerini ve modlarını tam olarak yeniden oluşturmayı zorlaştırır.

Birçok cihaz hedef dokulara tanımlanmış mekanik yükler uygulamak için geliştirilmiştir. Örneğin, Zeng ve diğerleri farelerin arka bacaklar⁹ ve Wang ve ark için uzunluk bilge mekanik yükleme için bir pnömatik sistem geliştirdik sıçan ve tavşan arka bacaklar için masaj gibi mekanik yükler uygulayabilirsiniz bir mekatronik cihaz geliştirdik gerçek zamanlı geri bildirim kontrolü¹⁰. Onlarla karşılaştırıldığında, bizim yerel döngüsel sıkıştırma (LCC) sistemi inşaat için çok daha az maliyet talep, çok daha basittir. Yine de, biz hafif kas kasılması sırasında oluşturulan intramüsküler basınç değişiklikleri çoğaltabilir. Bu cihazı kullanarak, başarıyla masaj benzeri mekanik müdahaleler lokal interstisyel akışkanlar dinamikleri modüle ve immobilizasyon kaynaklı kas atrofisi hafifletmek göstermiştir¹¹.

Burada, egzersiz ve masajların olumlu etkilerinin ardındaki moleküler mekanizmaları keşfetmeye yardımcı olabilecek cihazımızın ayrıntılarını ve protokolü anlatıyoruz. Protokolün şemaları Ek Şekil 1olarak sunulmuştur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Engelliler Rehabilitasyon Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. Farenin iki taraflı arka ayaklarının immobilizasyonu

NOT: Erkek C57BL/6 fareler en az 7 gün uyum sonra 11 - 12 hafta yaşında deneyler için kullanılmıştır.

1. Sodyum pentobarbital (50 mg/kg i.p.) kullanarak fareyi yeterince anestezi edin. Farelerin arka bacak lı bir sıkışmaya yanıt vermediğinden emin olun.
   NOT: Farelerin beslenme aktivitesi üzerindeki olası etkilerini en aza indirmek için 10:00 ile 19:00 saatleri arasında immobilizasyon işlemini gerçekleştirin.
2. Diz eklemleri uzatılmış ve ayak bileği eklemleri plantar-fleksile bir supine pozisyonda koydu farenin çift arka bacaklar için cerrahi bantlar uygulayın.
3. L4-5 omurga seviyesinde gövdeye alüminyum bir tel yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve spiral tabakanın her bir dönüşü arasında 5 mm boşluk olan arka bacaklar etrafında spiral konfigürasyonda teli bobinleyin(Şekil 1A). Teli çok sıkı bir şekilde sarmamaya ve yerel kan akışını bozmamaya özenmeyin.
4. Kablolamadan kaçış olasılığını en aza indirmek için, alüminyum telin konfigürasyonunu manuel olarak ayarlayarak kalça eklemlerini 90° kaçırma pozisyonunda hareketsiz hale getirin.
5. Fareleri orijinal kafeslerine geri getirin. 3 saat sonra, onlar anestezi ve her zamanki gibi gıda ve suya erişim kurtarmak emin olun.
6. House 3 - 6 immobilizasyon öncesi gibi kafes başına fareler hareketsiz.

2. Fare gastroknemius kaslarının kas içi basıncının ölçülmesi

NOT: LCC ile birlikte yapılan basınç izleme deneylerinde silindirik ünitelerin (36 g, 66 g ve 200 g) birkaç farklı ağırlıkları test edilmiştir. Bu ölçüm kas iltihabı ve atrofi analiz etmek için deneylerden ayrı olarak yapılmıştır (daha fazla ayrıntı için 3 - 5. adıma bakınız) yani basınç ölçümü yapılan fareler histolojik analizlerde kullanılmadı.

1. Basınç ölçümü, arka ekstremite kablolama ve LCC ile karşılaştırıldığında daha invaziv prosedürler (örn. cilt kesive iğne ekleme) içerdiğinden, üç anestezik ajanın karışımını (medetomidin 0.75 mg/kg, midazolam 4.0 mg/kg ve butorphanol 5.0 mg/kg, i.p.). Farelerin arka bacak takimı sıkışmasına yanıt vermediğinden emin olun.
2. Fareyi yatkın bir pozisyonda yerleştirin, elektrikli bir tıraş edici ile depilating ve yarı sterilize cilt yüzeyini% 70 etanol ve Klorheksidin-ıslatılmış emici pamuk ile sonra arka buzağı üzerinde bir neşter ile 2-mm kesi yapmak.
3. Cilt yüzeyine kalın bir açıyla (150° – 170°) gastroknemius kaslarına 20 G'lik bir iğne yerleştirin.
4. Bir kılavuz olarak iğne plastik kılıf kullanarak, gastroknemius kas orta karın kan basıncı telemetre (Malzeme Tablosubakınız) bir sensör yerleştirin ve sonra kas kılıfı çıkarın.
5. 4-0 naylon sütür ile cildi diktikten sonra, farelerdeki buzağıya silindirik ünitelerin birkaç farklı ağırlıkta LCC uygulayın (daha fazla ayrıntı için 3. adıma bakın) ve biyolojik sinyal analizi için yazılım kullanarak kas içi basıncı izleyin (Bkz. Tablo Malzemeler).
6. Fareleri orijinal kafeslerine geri getirin. 3 saat sonra, onlar anestezi / analjezi kurtarmak ve her zamanki gibi gıda ve suya erişimi olduğundan emin olun.

3. Fare buzağılarında lokal döngüsel sıkıştırma (LCC)

1. İntramüsküler basınç ölçümü ve ötenazi (yani servikal çıkış) dışında anestezi için sodyum pentobarbital (50 mg/kg i.p.) kullanın.
2. Fareyi arka ekstremite kablolarından uzaklaştırın ve diz eklemleri uzatılmış ve ayak bileği eklemleri dikilmiş, böylece buzağılar yukarı doğru karşı karşıya kalın. Sahnede fare arka bacaklar sabitlemeyin.
3. Silindirik ağırlık ünitesini(Şekil 1B)yastık pedi(Şekil 1C)ile kaplanmış, günde 30 dk,7 gün boyunca 1 Hz'de dikey olarak hareket ettirerek buzağıya LCC uygulayın.
4. Günlük LCC her nöbetsonra, fare arka bacaklar yeniden tel.

4. Gastroknemiusun immünohistokimyasal analizi

1. Üç anestezik ajanın (medetomidin 0.75 mg/kg, midazolam 4.0 mg/kg ve butorphanol 5.0 mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile yeterli anestezi/analjezi altında servikal çıkış ile fareyi ötenazi edin.
2. Posterior baldır yüzeyini depilating sonra, bir deri kesi yapmak, ve cerrahi bir makas kullanarak tibio-fibular kemik ayırarak gastrocnemius kasları incelemek ve hızlı bir şekilde optimal kesme sıcaklığı bileşik çözeltisi onları dondurmak.
3. Bir kriyostat kullanarak, cam slaytlar üzerinde gastroknemius kaslarıkro-kesit örnekleri hazırlamak. Numuneleri analiz edilene kadar -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
4. Dondurucudan analiz edilecek gastroknemius kriyo-kesit örneklerini alın ve oda sıcaklığında hava kurutularak kurutun.
5. Slayttaki tüm kriyo bölümlerini içeren bir alan çizmek için sıvı engelleyici kalem kullanın. Daire, çözümlerin slayttan akmasını önler.
6. Slaytları suyla ıslatılmış kağıt bezle nemli bir ortamın yaratıldığı bir tepsiye yerleştirerek numunelerin kurumasını önleyin.
7. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %0,25 kazein, taşıyıcı protein ve 0,015 M sodyum azit içeren 100 μL bloke tamponu (fosfat tamponlu salin (PBS) uygulayın.
8. 5 dakika boyunca PBS-T (PBS %0,1 polioksietilen sorbitan monolaurate içeren PBS) ile kuluçkaya yatarak slaytları iki kez durular.
9. Her numuneye PBS ile seyreltilmiş 100 μL primer antikor uygulayın, tepsiyi bir kapakla kapatın ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatırın.
10. PBS-T ile 3 kez yıkayın (her yıkama için 5 dk).
11. Her numuneye PBS ile seyreltilmiş 100 μL ikincil antikor uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Anti-laminin boyama için Alexa Fluor 568 konjuge ikincil antikor kullanın. Anti-F4/80, anti-MCP-1 ve anti-TNF-α için Alexa Fluor 568 veya 488 konjuge ikincil antikor kullanın.
12. PBS-T ile 3 kez yıkayın (her yıkama için 5 dk).
13. Her numuneye PBS-T ile seyreltilmiş 100 μL DAPI çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
14. PBS-T ile 3 kez yıkayın (her biri için 5 dk).
15. Numuneleri montaj ortamına yerleştirin ve üzerini kapaklı dudaklarla kapatın.

5. Gastroknemius histo-morfometrik analizi

1. Örnek slaytları bir floresan mikroskobuna yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve numuneleri uygun filtrelerle (DAPI-B, uyarma için 360/40 nm ve emisyon için 460/50 nm) 20× bir hedef kullanarak görüntüleyin; GFP-B, 470/40 nm uyarma ve emisyon için 535/50 nm; FRITC, uyarma için 540/25 nm ve emisyon için 605/55 nm.
2. Görüntü analizi için yazılımı kullanarak (Bkz. Malzemeler Tablosu),her miyofiberin kesit alanını (CSA) ölçün ve F4/80-, MCP-1-ve TNF-α-pozitif hücrelerin sayısını sayın.
   NOT: Anti-laminin-2 immünboyama ile görselleştirilen bodrum zarının iç kenarlığını izleyerek her miyofonun CSA'sını belirleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Önceki gözlemlerimizle tutarlı^12,gastroknemius miyofiberlerinin CSA'sı arka ekstremite immobilizasyonu ile önemli ölçüde azalmıştır(Şekil 2A,B). Ayrıca, immünofloresan boyama analizimiz, mcp-1 ve TNF-α'yı ifade eden hücrelerin, her ikisi de inflamatuar süreçlerin düzenlenmesinde kilit rol oynadığını ortaya çıkardı^13,14, gastroknemius kaslarında önemli ölçüde art...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Biz anti-inflamatuar etkileri olan bir masaj benzeri mekanik uyarıcı uygulamak için bir yöntem tarif ettik. Sistemimiz, daha önce bildirilenlerle karşılaştırıldığında bile aşağıdaki avantajlara sahiptir. İlk olarak, önceki çalışmalarda nicel uygulanan mekanik kuvvetler tanımlamak vermedi² veya vücut yüzeyinde ölçümdayalı büyüklükleri tanımlanan, ancak dokular içinde¹⁰. Buna karşılık, bir kan basıncı telemetre kullanarak kas içi basınc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum wire	DAISO JAPAN	B028	An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire
Blood pressure telemeter	Millar	SPR-671	A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy.
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500)	Invitrogen	A11034	Antibody for immunohistochemical staining.
Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500))	Invitrogen	A11077	Antibody for immunohistochemical staining.
ImageJ	NIH	N/A	Analysis software for image
LabChart8	ADInstrumens		Analysis software for acquiring biological signals.
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold is for mounting stained samples.
Protein Block Serum-Free	Dako	X090930-2	For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures.
Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000)	Sigma Aldrich	L0663	Antibody for immunohistochemical staining.
Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500)	Abcam	ab6640	Antibody for immunohistochemical staining.
Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000)	Abcam	ab25124	Antibody for immunohistochemical staining.
Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000)	Abcam	ab66579	Antibody for immunohistochemical staining.
Surgical tape	3M Japan	1530EP-0	Surgical tape is used to restrict joint movement.