Aplicação de consistente massagem-como perturbações em bezerros do mouse e monitoramento das mudanças de pressão intramuscular resultante

Resumo

Aqui nós descrevemos os protocolos para aplicar cargas mecânicas definidas aos bezerros do rato e para monitorar as mudanças intramusculares concomitantes da pressão. Os sistemas experimentais que desenvolvemos podem ser úteis para investigar o mecanismo por trás dos efeitos benéficos do exercício físico e da massagem.

Resumo

A massagem é geralmente reconhecida para ser benéfico para aliviar a dor e inflamação. Embora os estudos precedentes relatem efeitos anti-inflammatory da massagem em músculos esqueletais, os mecanismos moleculars atrás são compreendidos mal. Nós desenvolvemos recentemente um dispositivo simples para aplicar a compressão cíclica local (LCC), que pode gerar ondas intramusculares da pressão com amplitudes de variação. Usando este dispositivo, Nós demonstramos que o LCC modula respostas inflamatórios de macrófagos in situ e alivia a atrofia do músculo imobilização-induzida. Aqui, nós descrevemos protocolos para a optimização e a aplicação de LCC como uma massagem-como a intervenção de encontro à inflamação imobilização-induzida e à atrofia de músculos esqueletais de hindmembros do rato. O protocolo que desenvolvemos pode ser útil para investigar o mecanismo subjacente aos efeitos benéficos do exercício físico e da massagem. Nosso sistema experimental fornece um protótipo da abordagem analítica para elucidar a regulação mecânica da homeostase muscular, embora mais desenvolvimento precise ser feito para estudos mais abrangentes.

Introdução

A massagem é geralmente reconhecida como benéfica tanto para o alívio da dor quanto para a melhora do desempenho físico entre atletas competitivos e não atletas iguais^1,2. Na verdade, estudos anteriores mostraram que a massagem suprime a inflamação local³ e solicita a recuperação do dano muscular pós-exercício^4,5. Os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos benéficos da massagem permanecem largamente desconhecidos.

Uma das dificuldades com a investigação mecanicista sobre massagem relaciona-se com a reprodutibilidade de técnicas experimentais pelas quais as intervenções de massagem são testadas. Em estudos prévios, os procedimentos experimentais que imitam a massagem envolvem principalmente a aplicação de intervenções físicas utilizando partes corporais dos praticantes, como palmas e dedos^6,7,8. Isso faz com que seja difícil reproduzir precisamente sua magnitude, frequência, duração e modo.

Muitos dispositivos foram desenvolvidos para aplicar cargas mecânicas definidas aos tecidos-alvo. Por exemplo, Zeng et al. desenvolveram um sistema pneumático para o carregamento mecânico de comprimento-sábio para os membros posteriores do rato⁹ e Wang et al. desenvolveram um dispositivo Mecatrônico que pode aplicar cargas mecânicas de massagem como para os membros posteriores de ratos e coelhos com controle de feedback em tempo real¹⁰. Comparado a eles, o nosso sistema de compressão cíclica local (LCC) é muito mais simples, exigindo muito menos custo para a construção. No entanto, podemos reproduzir as alterações da pressão intramuscular que são geradas durante a contração muscular leve. Usando este dispositivo, Nós demonstramos com sucesso que as intervenções mecânicas massagem-como modulam a dinâmica fluida intersticial local e aliviam a atrofia imobilização-induzida do músculo¹¹.

Aqui, descrevemos os detalhes do nosso dispositivo e do protocolo, que pode ajudar a explorar os mecanismos moleculares por trás dos efeitos positivos dos exercícios e massagens. Os esquemas do protocolo são apresentados como Figura complementar 1.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos a aprovação do Comitê institucional de cuidados e uso de animais do centro nacional de reabilitação para pessoas com deficiência.

1. imobilização dos membros posteriores bilaterais do rato

Nota: camundongos machos C57BL/6 foram utilizados para experimentos com idade de 11-12 semanas após aclimatação por pelo menos 7 dias.

1. Anestesiam adequadamente um rato utilizando pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.). Certifique-se de que os ratos não respondem a uma pitada do dedo do pé do membro traseiro.
   Nota: conduza o procedimento da imobilização entre 10 a.m. e 7 p.m. para minimizar os efeitos possíveis na atividade de alimentação dos ratos.
2. Aplicar fitas cirúrgicas para os membros posteriores bilaterais do rato colocado em uma posição supina com as articulações do joelho estendido e articulações do tornozelo plantar-flexiado.
3. Coloc um fio de alumínio (veja a tabela de materiais) no tronco no nível da espinha L4-5 e enrole o fio em uma configuração espiral em torno dos membros posteriores com as aberturas de 5 milímetros entre cada volta da camada espiral (Figura 1a). Certifique-se de não enrolar o fio muito firmemente e evitar perturbar o fluxo sanguíneo local.
4. Para minimizar a possibilidade de escape da fiação, imobilize as junções ancas na posição da abdução 90 ° ajustando manualmente a configuração do fio de alumínio.
5. Devolva os ratos às suas gaiolas originais. 3 h mais tarde, certifique-se de que eles se recuperam da anestesia e acesso a alimentos e água, como de costume.
6. Casa 3-6 ratos imobilizados por gaiola como antes da imobilização.

2. medida da pressão intramuscular de músculos do gastrocnêmio do rato

Nota: vários pesos diferentes de unidades cilíndricas (36 g, 66 g e 200 g) foram testados nos experimentos de monitorização de pressão combinados com o LCC. Esta medida foi conduzida separadamente dos experimentos para analisar a inflamação e atrofia muscular (ver etapa 3-5 para mais detalhes) ou seja, os camundongos submetidos à medida de pressão não foram utilizados para análises histológicas.

1. Como a medida da pressão envolve procedimentos mais invasivos (por exemplo, incisão cutânea e inserção da agulha) em comparação com a fiação do membro posterior e a LCC, use uma mistura de três agentes anestésicos (medetomidina 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg e butorfanol 5,0 mg/kg, i.p.). Certifique-se de que os ratos não respondem à pinça do dedo do pé posterior.
2. Coloque o mouse em uma posição propensa, faça uma incisão de 2 mm com um bisturi na panturrilha posterior após a depilação com um barbeador elétrico e semi-esterilizando a superfície da pele com 70% de etanol-e algodão absorvente clorexidina embebido.
3. Insira uma agulha de demora de 20 G no músculo gastrocnêmio em um ângulo obtse (150 ° – 170 °) para a superfície da pele.
4. Usando a bainha plástica da agulha como um guia, coloc um sensor do telemeter da pressão sanguínea (veja a tabela de materiais) no mid-Belly do músculo do gastrocnêmio, e remova então a bainha do músculo.
5. Depois de suturar a pele com 4-0 sutura de nylon, aplique LCC com vários pesos diferentes de unidades cilíndricas para o bezerro nos camundongos (ver passo 3 para mais detalhes), e monitorar a pressão intramuscular usando software para análise de sinais biológicos (ver tabela de Materiais).
6. Devolva os ratos às suas gaiolas originais. 3 h mais tarde, certifique-se de que eles se recuperam de anestesia/analgesia e têm acesso a alimentos e água, como de costume.

3. compressão cíclica local (LCC) em bezerros do rato

1. Com exceção da medida da pressão intramuscular e da eutanização (ou seja, luxação cervical), use pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.) para anestesia.
2. Desengate o mouse da fiação do membro posterior e coloque-o em uma posição propensa com as articulações do joelho estendidas e as articulações do tornozelo flexiona plantar para que os bezerros enfrentou para cima. Não fixe os membros posteriores do rato no palco.
3. Aplique o LCC ao bezerro movendo verticalmente uma unidade de peso cilíndrico (Figura 1b) coberta com uma almofada de almofada (Figura 1C) a 1 Hz por 30 min por dia, 7 dias.
4. Após cada ataque do LCC diário, re-Wire os membros posteriores do rato.

4. análise imuno-histoquímica do gastrocnêmio

1. Eutanizar o camundongo por luxação cervical anestesia/analgesia adequada por injeção intraperitoneal de uma mistura de três agentes anestésicos (medetomidina 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg e butorfanol 5,0 mg/kg).
2. Após ter depilando a superfície da vitela do posterior, faça uma incisão da pele, e dissecar os músculos do gastrocnêmio separando do osso tibio-fibular usando uma tesoura cirúrgica e congele-os rapidamente em uma solução óptima do composto da temperatura do corte.
3. Usando um criostat, prepare amostras da Cryo-seção de músculos do gastrocnêmio em corrediças de vidro. Guarde as amostras num congelador de-80 ° c até à análise.
4. Tirar as amostras de secção de crio de gastrocnêmio para serem analisadas a partir do congelador e desidratá-las por secagem de ar à temperatura ambiente.
5. Use uma caneta bloqueador de líquido para desenhar uma área que inclua todas as seções crio no slide. O círculo impedirá que as soluções fluam fora do slide.
6. Evite secar as amostras colocando os slides em uma bandeja na qual um ambiente úmido é criado com um pano de papel embebido em água.
7. Aplique 100 μL de tampão de bloqueio (solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,25% de caseína, proteína portadora e azida de sódio a 0, 15 M) durante 30 min à temperatura ambiente.
8. Enxágüe as lâminas duas vezes incubando com PBS-T (PBS contendo 0,1% de monolaurato de polioxietileno sorbitano (ver tabela de materiais) por 5 min.
9. Aplique 100 μL de anticorpo primário diluído com PBS em cada amostra, cubra a bandeja com uma tampa e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
10. Lave 3 vezes com PBS-T (5 min para cada lavagem).
11. Aplicar 100 μL de anticorpo secundário diluído com PBS em cada amostra e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
    Nota: para a coloração de anti-laminina, use o anticorpo secundário 568-conjugated de Alexa fluor. Para anti-F4/80, anti-MCP-1 e anti-TNF-α, use o anticorpo secundário de Alexa fluor 568-ou 488-conjugados.
12. Lave 3 vezes com PBS-T (5 min para cada lavagem).
13. Aplique 100 μL de solução de DAPI diluída com PBS-T em cada amostra e incubar durante 3 min à temperatura ambiente.
14. Lave 3 vezes com PBS-T (5 min para cada).
15. Monte as amostras com suporte de montagem e cubra-as com lamelas.

5. histo-Análise morfométrica de gastrocnêmio

1. Coloc os slides da amostra em um microscópio de fluorescência (veja a tabela de materiais) e veja as amostras usando um objetivo 20 × com os filtros apropriados (DAPI-B, 360/40 nanômetro para a excitação e 460/50 nanômetro para a emissão; GFP-B, 470/40 nm para excitação e 535/50 nm para emissão; FRITC, 540/25 nm para excitação e 605/55 nm para emissão.
2. Usando o software para análise de imagem (ver tabela de materiais), medir a área transversal (CSA) de cada miofiber, e contar o número de F4/80-, MCP-1-, e TNF-α-células positivas.
   Nota: Determine CSA de cada miofiber traçando a margem interna da membrana do porão visualizada com a imunocoloração anti-laminin-2.

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Resultados

Em consonância com as observações anteriores¹², a CSA de miofibras de gastrocnêmio foi significativamente diminuída pela imobilização do membro posterior (Figura 2A, B). Além disso, nossa análise da coloração da imunofluorescência revelou que as pilhas que expressam MCP-1 e TNF-α, ambo desempenham papéis chaves em regular processos inflamatórios^13,14, aumentaram significativamen...

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Discussão

Nós descrevemos um método para aplicar uma massagem-como o estímulo mecânico, que tem efeitos anti-inflammatory. Nosso sistema tem as seguintes vantagens mesmo quando comparado com aqueles relatados previamente. Em primeiro lugar, estudos prévios não definiram quantitativamente as forças mecânicas aplicadas² ou definiram suas magnitudes com base na medida na superfície do corpo, mas não dentro dos tecidos¹⁰. Ao contrário, Nós medimos a pressão intramuscular usa...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum wire	DAISO JAPAN	B028	An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire
Blood pressure telemeter	Millar	SPR-671	A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy.
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500)	Invitrogen	A11034	Antibody for immunohistochemical staining.
Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500))	Invitrogen	A11077	Antibody for immunohistochemical staining.
ImageJ	NIH	N/A	Analysis software for image
LabChart8	ADInstrumens		Analysis software for acquiring biological signals.
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold is for mounting stained samples.
Protein Block Serum-Free	Dako	X090930-2	For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures.
Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000)	Sigma Aldrich	L0663	Antibody for immunohistochemical staining.
Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500)	Abcam	ab6640	Antibody for immunohistochemical staining.
Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000)	Abcam	ab25124	Antibody for immunohistochemical staining.
Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000)	Abcam	ab66579	Antibody for immunohistochemical staining.
Surgical tape	3M Japan	1530EP-0	Surgical tape is used to restrict joint movement.