Applicazione di perturbazioni costanti simili a massaggi sui vitelli per topi e monitoraggio dei conseguenti cambiamenti di pressione intramuscolare

Riepilogo

Qui descriviamo i protocolli per l'applicazione di carichi meccanici definiti ai vitelli del topo e per il monitoraggio dei concomitanti cambiamenti di pressione intramuscolare. I sistemi sperimentali che abbiamo sviluppato possono essere utili per studiare il meccanismo alla base degli effetti benefici dell'esercizio fisico e del massaggio.

Abstract

Il massaggio è generalmente riconosciuto per essere utile per alleviare il dolore e l'infiammazione. Anche se studi precedenti hanno segnalato effetti antinfiammatori del massaggio sui muscoli scheletrici, i meccanismi molecolari dietro sono poco compresi. Recentemente abbiamo sviluppato un semplice dispositivo per applicare la compressione ciclica locale (LCC), che può generare onde di pressione intramuscolare con diverse ampiezze. Utilizzando questo dispositivo, abbiamo dimostrato che LCC modula le risposte infiammatorie dei macrofagi in situ e allevia l'atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione. Qui, descriviamo i protocolli per l'ottimizzazione e l'applicazione di LCC come un intervento simile al massaggio contro l'infiammazione indotta dall'immobilizzazione e l'atrofia dei muscoli scheletrici degli arti posteriori del topo. Il protocollo che abbiamo sviluppato può essere utile per studiare il meccanismo alla base degli effetti benefici dell'esercizio fisico e del massaggio. Il nostro sistema sperimentale fornisce un prototipo dell'approccio analitico per chiarire la regolazione meccanica dell'omeostasi muscolare, anche se è necessario un ulteriore sviluppo per studi più completi.

Introduzione

Il massaggio è generalmente riconosciuto per essere utile sia per il sollievo dal dolore che per il miglioramento delle prestazioni fisiche tra gli atleti competitivi e non atleti allo stesso modo^1,2. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che il massaggio sopprime l'infiammazione locale³ e richiede il recupero dal danno muscolare post-esercizio^4,5. I meccanismi molecolari alla base degli effetti benefici del massaggio rimangono in gran parte sconosciuti.

Una delle difficoltà con l'indagine meccanicistica sul massaggio riguarda la riproducibilità di tecniche sperimentali con cui vengono testati interventi di massaggio. In studi precedenti, le procedure sperimentali che imitano il massaggio comportano principalmente l'applicazione di interventi fisici utilizzando parti del corpo dei professionisti, come palme e dita^6,7,8. Questo rende difficile riprodurre con precisione la loro grandezza, frequenza, durata e modalità.

Molti dispositivi sono stati sviluppati per applicare carichi meccanici definiti ai tessuti di destinazione. Per esempio, wang et al. hanno sviluppato un sistema pneumatico per il carico meccanico di lunghezza per gli arti posteriori dei ratti⁹ e Wang et al. controllo del feedback in tempo reale¹⁰. Rispetto a loro, il nostro sistema di compressione ciclica locale (LCC) è molto più semplice, richiedendo molto meno costi per la costruzione. Tuttavia, possiamo riprodurre i cambiamenti di pressione intramuscolare che vengono generati durante la contrazione muscolare lieve. Utilizzando questo dispositivo, abbiamo dimostrato con successo che gli interventi meccanici simili a massaggi modulano la fluidodinamica interstiziale locale e alleviano l'atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione¹¹.

Qui, descriviamo i dettagli del nostro dispositivo e il protocollo, che può aiutare a esplorare i meccanismi molecolari dietro gli effetti positivi di esercizi e massaggi. Gli schemi del protocollo sono presentati come Figura supplementare 1.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del National Rehabilitation Center for Disabilities.

1. Immobilizzazione degli arti posteriori bilaterali del topo

NOTA: I topi maschi C57BL/6 sono stati utilizzati per esperimenti all'età di 11 - 12 settimane dopo l'acclimatamento per almeno 7 giorni.

1. Anesthetizzare adeguatamente un topo utilizzando pentobarbital di sodio (50 mg/kg i.p.). Assicurarsi che i topi non rispondano a un pizzico dell'aglione dell'arto posteriore.
   NOTA: Eseguire la procedura di immobilizzazione tra le 10:00 e le 19:00 per ridurre al minimo i possibili effetti sull'attività di alimentazione dei topi.
2. Applicare nastri chirurgici agli arti posteriori bilaterali del topo disposti in posizione supina con le articolazioni del ginocchio estese e le articolazioni della caviglia piegate dal plantare.
3. Posizionare un filo di alluminio (vedere Tabella dei materiali) sul tronco a livello della colonna vertebrale L4-5 e avvolgere il filo in una configurazione a spirale intorno agli arti posteriori con 5 mm di distanza tra ogni giro dello strato a spirale ( Figura1A). Assicurarsi di non frantrare il filo troppo strettamente ed evitare di disturbare il flusso sanguigno locale.
4. Per ridurre al minimo la possibilità di fuga dal cablaggio, immobilizzare le articolazioni dell'anca nella posizione di un rapimento di 90 gradi regolando manualmente la configurazione del filo di alluminio.
5. Riportare i topi alle gabbie originali. 3 h più tardi, assicurarsi che si riprendano dall'anestesia e l'accesso al cibo e all'acqua come al solito.
6. Casa 3 - 6 topi immobilizzati per gabbia come prima dell'immobilizzazione.

2. Misurazione della pressione intramuscolare dei muscoli gastrocnemius del topo

NOTA: diversi pesi diversi di unità cilindriche (36 g, 66 g e 200 g) sono stati testati negli esperimenti di monitoraggio della pressione combinati con LCC. Questa misurazione è stata condotta separatamente dagli esperimenti per analizzare l'infiammazione muscolare e l'atrofia (vedere i passaggi da 3 a 5 per maggiori dettagli), vale a dire che i topi sottoposti a misurazione della pressione non sono stati utilizzati per analisi istologiche.

1. Poiché la misurazione della pressione comporta procedure più invasive (ad esempio, incisione cutanea e inserimento dell'ago) rispetto al cablaggio degli arti posteriori e all'LCC, utilizzare una miscela di tre agenti anestetici (medetominano 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg, e maorphanol 5,0 mg/kg, i.p.). Assicurarsi che i topi non rispondano al pizzico dell'aglione dell'arto posteriore.
2. Posare il topo in una posizione prona, fare un'incisione di 2 mm con un bisturi sul vitello posteriore dopo depilazione con un rasoio elettrico e semi-sterilizzare la superficie della pelle con 70% cotone assorbente imbevuto di etanolo e Chlorhexidine.
3. Inserire un ago che affonda 20 G nel muscolo gastrocnemio ad un angolo ottuso (150 , 170 gradi) sulla superficie della pelle.
4. Utilizzando la guaina plastica dell'ago come guida, posizionare un sensore del telemetro della pressione sanguigna (vedi Tabella dei materiali) nel mezzo della pancia del muscolo gastrocnemio, e quindi rimuovere la guaina dal muscolo.
5. Dopo aver sordato la pelle con 4-0 sutura in nylon, applicare LCC con diversi pesi di unità cilindriche al polpaccio nei topi (vedere il punto 3 per maggiori dettagli), e monitorare la pressione intramuscolare utilizzando un software per l'analisi del segnale biologico (vedi Tabella di Materiali).
6. Riportare i topi alle gabbie originali. 3 h più tardi, assicurarsi che si riprendano da anestesia/analgesia e abbiano accesso al cibo e all'acqua come al solito.

3. Compressione ciclica locale (LCC) sui vitelli dei topi

1. Fatta eccezione per la misurazione della pressione intramuscolare e l'eutanasia (cioè la lussazione cervicale), utilizzare pentobarbital di sodio (50 mg/kg i.p.) per l'anestesia.
2. Disinserire il topo dal cablaggio dell'arto posteriore e posarlo in posizione prona con le articolazioni del ginocchio estese e le articolazioni della caviglia piegate a pavimento in modo che i polpacci si trovasse verso l'alto. Non fissare gli arti posteriori del topo sullo stage.
3. Applicare LCC al polpaccio spostando verticalmente un'unità di peso cilindrico (Figura 1B) coperta da un cuscinetto (Figura 1C) a 1 Hz per 30 min al giorno, 7 giorni.
4. Dopo ogni incontro di LCC giornaliero, ri-collegare gli arti posteriori del topo.

4. Analisi immunoistochimica di gastrocnemius

1. Eutanasia del topo per lussazione cervicale in sufficiente anestesia/analgesia mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di tre agenti anestetici (medetomina0 0,75 mg/kg, midazolam 4.0 mg/kg, e maorphanol 5,0 mg/kg).
2. Dopo aver depilato la superficie posteriore del polpaccio, fare un'incisione cutanea, e sezionare i muscoli gastrocnemius separando l'osso tibio-fibuloso utilizzando una forbice chirurgica e congelarli rapidamente in una soluzione composta di temperatura di taglio ottimale.
3. Utilizzando un criostato, preparare campioni crio-sezione di muscoli gastrocnemius su vetrini di vetro. Conservare i campioni in un congelatore a -80 gradi centigradi fino all'analisi.
4. Estrarre i campioni di criosezione gastrocnemius da analizzare dal congelatore e disidratarli mediante asciugatura dell'aria a temperatura ambiente.
5. Utilizzare una penna a blocchi liquidi per disegnare un'area che include tutte le criosezioni sulla diapositiva. Il cerchio impedirà alle soluzioni di fluire fuori dalla diapositiva.
6. Evitare l'essiccazione dei campioni mettendo i vetrini in un vassoio in cui viene creato un ambiente umido con un panno di carta imbevuto d'acqua.
7. Applicare 100 l di buffer di blocco (PBS) contenente 0,25% di caseina, proteine portante e 0,015 M di azide di sodio) per 30 min a temperatura ambiente.
8. Sciacquare i vetrini due volte incubando con PBS-T (PBS contenente 0,1% di poloxyethylene monolaurata sorbitano (vedi Tabella dei materiali)per 5 min.
9. Applicare 100 ldell'anticorpo primario diluito con PBS su ogni campione, coprire il vassoio con un coperchio e incubare durante la notte a temperatura ambiente.
10. Lavare 3 volte con PBS-T (5 min per ogni lavaggio).
11. Applicare 100 lantide secondarie diluite con PBS su ogni campione e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: per la colorazione anti-laminin, utilizzare l'anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 568. Per anti-F4/80, anti-MCP-1 e anti-TNF-z, utilizzare Alexa Fluor 568 o 488-agente di anticorpo secondario coniugato.
12. Lavare 3 volte con PBS-T (5 min per ogni lavaggio).
13. Applicare 100 l di soluzione DAPI diluita con PBS-T su ogni campione e incubare per 3 min a temperatura ambiente.
14. Lavare 3 volte con PBS-T (5 min per ciascuno).
15. Montare i campioni con il supporto di montaggio e coprirli con i coperchi.

5. Analisi isto-morfometrica di gastrocnemius

1. Posizionare i vetrini di esempio in un microscopio a fluescenza (vedere Tabella dei materiali)e visualizzare gli esempi utilizzando un obiettivo di oltre 20 con filtri appropriati (DAPI-B, 360/40 nm per l'eccitazione e 460/50 nm per l'emissione; GFP-B, 470/40 nm per l'eccitazione e 535/50 nm per l'emissione; FRITC, 540/25 nm per l'eccitazione e 605/55 nm per l'emissione.
2. Utilizzando il software per l'analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali), misurare l'area della sezione trasversale (CSA) di ogni miofibra e contare il numero di celle F4/80-, MCP-1-, e TNF-z-positive.
   NOTA: Determinare la CSA di ogni miofibra tracciando il margine interno della membrana del seminterrato visualizzata con immunostaining anti-laminina-2.

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Risultati

Coerentemente con le nostre precedenti osservazioni¹², la CSA delle miofibre gastrocnemius sono state significativamente diminuite dall'immobilizzazione degli arti posteriori (Figura 2A,B). Inoltre, la nostra analisi di colorazione dell'immunofluorescenza ha rivelato che le cellule che esprimono MCP-1 e TNF-z, entrambe svolgono un ruolo chiave nella regolazione dei processi infiammatori^13,14, ...

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Discussione

Abbiamo descritto un metodo per applicare uno stimolo meccanico simile al massaggio, che ha effetti antinfiammatori. Il nostro sistema ha seguenti vantaggi anche se confrontati con quelli riportati in precedenza. In primo luogo, studi precedenti non hanno definito quantitativamente le forze meccaniche applicate² o definito le loro magnitudini in base alla misurazione sulla superficie del corpo, ma non all'interno dei tessuti¹⁰. Al contrario, abbiamo misurato la pressione in...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum wire	DAISO JAPAN	B028	An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire
Blood pressure telemeter	Millar	SPR-671	A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy.
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500)	Invitrogen	A11034	Antibody for immunohistochemical staining.
Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500))	Invitrogen	A11077	Antibody for immunohistochemical staining.
ImageJ	NIH	N/A	Analysis software for image
LabChart8	ADInstrumens		Analysis software for acquiring biological signals.
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold is for mounting stained samples.
Protein Block Serum-Free	Dako	X090930-2	For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures.
Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000)	Sigma Aldrich	L0663	Antibody for immunohistochemical staining.
Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500)	Abcam	ab6640	Antibody for immunohistochemical staining.
Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000)	Abcam	ab25124	Antibody for immunohistochemical staining.
Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000)	Abcam	ab66579	Antibody for immunohistochemical staining.
Surgical tape	3M Japan	1530EP-0	Surgical tape is used to restrict joint movement.