JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем протоколы для применения определенных механических нагрузок к телятам мыши и для мониторинга сопутствующих внутримышечных изменений давления. Экспериментальные системы, которые мы разработали, могут быть полезны для исследования механизма, лежащего в основе благотворного воздействия физических упражнений и массажа.

Аннотация

Массаж, как правило, признается полезным для снятия боли и воспаления. Хотя предыдущие исследования сообщили противовоспалительные эффекты массажа на скелетные мышцы, молекулярные механизмы позади плохо изучены. Недавно мы разработали простое устройство для применения локального циклического сжатия (LCC), которое может генерировать внутримышечные волны давления с различной амплитудой. Используя это устройство, мы продемонстрировали, что LCC модулирует воспалительные реакции макрофагов на месте и облегчает иммобилизацию индуцированной атрофии мышц. Здесь мы описываем протоколы для оптимизации и применения LCC как массажное вмешательство против иммобилизации индуцированного воспаления и атрофии скелетных мышц задней части мыши. Разработанный протокол может быть полезен для изучения механизма, лежащего в основе благотворного воздействия физических упражнений и массажа. Наша экспериментальная система является прототипом аналитического подхода к прояснению механической регуляции мышечного гомеостаза, хотя необходимо дальнейшее развитие для более комплексных исследований.

Введение

Массаж, как правило, признается полезным для облегчения боли и улучшения физической работоспособности среди конкурентоспособных спортсменов и не-спортсменов, так1,2. В самом деле, предыдущие исследования показали, что массаж подавляет местное воспаление3 и подсказывает восстановление после тренировки повреждения мышц4,5. Молекулярные механизмы, лежащие в основе благотворного воздействия массажа остаются в значительной степени неизвестными.

Одна из трудностей с механистическим исследованием массажа связана с воспроизводимостью экспериментальных методов, с помощью которых тестируются массажные вмешательства. В предыдущих исследованиях, экспериментальныепроцедуры,которые имитируют массаж в основном включают в себя применение физических вмешательств с использованием частей тела практикующих, таких как ладони и пальцы6,7,8. Это затрудняет точное воспроизведение их величины, частоты, продолжительности и режима.

Многие устройства были разработаны для нанесения определенных механических нагрузок на ткани-мишени. Например, Цзэн и др. разработали пневматическую систему для длительной механической нагрузки на задние конечности крыс9 и Wang et al. разработали мехатронное устройство, которое может применять массажные механические нагрузки на задние конечности крыс и кроликов с контроль обратной связи в режиме реального времени10. По сравнению с ними, наша местная циклическая система сжатия (LCC) гораздо проще, требуя гораздо меньших затрат на строительство. Тем не менее, мы можем воспроизвести внутримышечное давление изменения, которые генерируются во время мягкого сокращения мышц. Используя это устройство, мы успешно продемонстрировали, что массаж, как механические вмешательства модулировать местные интерстициальной динамики жидкости и облегчить иммобилизации индуцированной мышечной атрофии11.

Здесь мы описываем детали нашего устройства и протокола, которые могут помочь изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе положительных эффектов упражнений и массажей. Схемы протокола представлены как дополнительная цифра 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и использованию Национального реабилитационного центра для инвалидов.

1. Иммобилизация мыши двусторонних задних конечностей

ПРИМЕЧАНИЕ: Мужские мыши C57BL/6 использовались для экспериментов в возрасте 11 - 12 недель после акклиматизации в течение по крайней мере 7 дней.

  1. Адекватно обезболивать мышь с помощью пентобарбитала натрия (50 мг/кг ит.). Убедитесь, что мыши не реагируют на задний нос щепотку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение процедуры иммобилизации между 10 утра и 7 вечера, чтобы свести к минимуму возможные последствия для кормления деятельности мышей.
  2. Нанесите хирургические ленты на двусторонние задние конечности мыши, уложенные в положение лежа с удлиненными коленными суставами и подошвенными суставами голеностопных суставов.
  3. Поместите алюминиевую проволоку (см. таблицу материалов) на стволе на уровне позвоночника L4-5 и свернуть проволоку в спиральной конфигурации вокруг задних конечностей с 5 мм зазорами между каждым поворотом спирального слоя(рисунок 1A). Убедитесь в том, чтобы не скручивать провод слишком плотно и избежать нарушения местного кровотока.
  4. Чтобы свести к минимуму возможность побега от проводки, обездвижить тазобедренные суставы в положении 90 "похищение путем ручной настройки конфигурации алюминиевой проволоки.
  5. Верните мышей в их оригинальные клетки. 3 ч спустя, убедитесь, что они оправиться от анестезии и доступ к пище и воде, как обычно.
  6. Дом 3 - 6 обездвижемых мышей на клетку, как и до иммобилизации.

2. Измерение внутримышечного давления мышц желудочно-кишечного желудка мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько различных весов цилиндрических единиц (36 г, 66 г и 200 г) были протестированы в экспериментах по мониторингу давления в сочетании с LCC. Это измерение проводилось отдельно от экспериментов по анализу воспаления и атрофии мышц (см. шаг 3 - 5 для более подробной информации), т.е. мыши, подвергающиеся измерению давления, не использовались для гистологического анализа.

  1. Поскольку измерение давления включает в себя более инвазивные процедуры (например, разрез кожи и вставка иглы) по сравнению с проводкой и LCC, используйте смесь из трех анестезирующих агентов (медетомидин 0,75 мг/кг, мидазолам 4,0 мг/кг, и бутафанфол 5,0 мг/кг, т.п.). Убедитесь, что мыши не реагируют на задний нос щепотку.
  2. Положите мышь в логовое положение, сделать 2-мм разрез с скальпелем на задней теленка после депилирования с электрической бритвой и полустерилизации поверхности кожи с 70% этанола и хлоргексидин пропитанной абсорбирующий хлопок.
  3. Вставьте 20 G жилой иглы в гастрокнемиоз мышцы под тупым углом (150 " - 170") на поверхность кожи.
  4. Используя пластиковую оболочку иглы в качестве направляющего, поместите датчик телеметра кровяного давления (см. Таблица Материалов)в середине живота гастрокнемии мышцы, а затем удалить оболочку из мышцы.
  5. После зашву кожи с 4-0 нейлоновый шов, применять LCC с несколькими различными весами цилиндрических единиц для теленка в мышах (см. шаг 3 для более подробной информации), и контролировать внутримышечное давление с помощью программного обеспечения для биологического анализа сигнала (см. Таблица Материалы).
  6. Верните мышей в их оригинальные клетки. 3 ч спустя, убедитесь, что они оправиться от анестезии / анальгезии и имеют доступ к пище и воде, как обычно.

3. Местное циклическое сжатие (LCC) на мышах телят

  1. За исключением измерения внутримышечного давления и эвтаназии (т.е. вывихшей шейки матки), для анестезии используйте пентобарбитал натрия (50 мг/кг т.п.).
  2. Отлините мышь от проводки задних конечностей и положите ее в логовое положение с удлиненными коленными суставами и подошвенными суставами голеностопных суставов, так что икры выходили вверх. Не фиксировать мышь задние конечности на сцене.
  3. Нанесите LCC на теленка, вертикально двигаясь цилиндрической единицы веса(рисунок 1B) покрыты подушки площадку (Рисунок 1С) на 1 Гц в течение 30 минут в день, 7 дней.
  4. После каждого боя ежедневно LCC, повторно провода мыши задние конечности.

4. Иммуногистохимический анализ гастрокнемии

  1. Эвтанизировать мышь путем вывиха шейки матки при адекватной анестезии/анальгезии путем интраперитонеальной инъекции смеси из трех анестезиологических агентов (медетомидин 0,75 мг/кг, мидазолам 4,0 мг/кг и буторфанол 5,0 мг/кг).
  2. После депиаляции задней поверхности теленка, сделать разрез кожи, и вскрыть гастрокнемии мышц, отделяясь от тибио-фибулярной кости с помощью хирургических ножницами и быстро заморозить их в оптимальном решении соединения резки.
  3. С помощью криостата приготовьте криосекционные образцы гастрокнемиозных мышц на стеклянных слайдах. Храните образцы в морозильной камере -80 градусов до анализа.
  4. Выньте образцы криосеции гастрокнемия для анализа из морозильной камеры и обезвоживают их путем высыхания воздуха при комнатной температуре.
  5. Используйте жидкую ручку-блокатор, чтобы нарисовать область, которая включает в себя все крио-секции на слайде. Круг предотвратит поток решений со слайда.
  6. Избегайте сушки образцов, поместив горки в лоток, в котором влажная среда создается с пропитанной водой бумажной тканью.
  7. Нанесите 100 qL блокирующего буфера (фосфат-буферированный солевым раствором (PBS), содержащим 0,25% казеина, несущего белка и 0,015 М азида натрия) на 30 мин при комнатной температуре.
  8. Промыть слайды дважды путем инкубации с PBS-T (PBS, содержащий 0,1% полиоксиэтилен сорбитанского монолаурата (см. Таблица материалов)в течение 5 мин.
  9. Нанесите 100 л первичных антител, разбавленных PBS, на каждый образец, накройте лоток крышкой и инкубируете на ночь при комнатной температуре.
  10. Вымойте 3 раза pbS-T (5 мин для каждой стирки).
  11. Нанесите 100 л вторичных антител, разбавленных PBS, на каждый образец и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анти-ламинин окрашивания, используйте Alexa Fluor 568-конъюгированных вторичных антител. Для анти-F4/80, анти-MCP-1, и анти-TNF-я, используйте Alexa Fluor 568- или 488-конъюгированных вторичных антител.
  12. Вымойте 3 раза pbS-T (5 мин для каждой стирки).
  13. Нанесите 100 л раствора DAPI, разбавленного PBS-T, на каждый образец и инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре.
  14. Вымойте 3 раза pbS-T (5 мин для каждого).
  15. Смонтировать образцы с монтажной средой и покрыть их крышками.

5. Гисто-морфометрический анализ гастрокнемии

  1. Поместите образец слайдов на флуоресцентный микроскоп (см. Таблица материалов)и просмотрите образцы с помощью 20-й цели с соответствующими фильтрами (DAPI-B, 360/40 нм для возбуждения и 460/50 нм для выбросов; GFP-B, 470/40 нм для возбуждения и 535/50 нм для выбросов; FRITC, 540/25 нм для возбуждения и 605/55 нм для выбросов.
  2. Используя программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблица Материалов),измерьте поперечную область (CSA) каждого миофибра, и подсчитайте количество F4/80-, MCP-1-, и TNF-я-положительные клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите CSA каждого миофибра путем отслеживания внутреннего края мембраны подвала визуализированы с анти-ламинин-2 иммуно-2 иммуно-2 иммуно-2 иммуно-сточки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В соответствии с нашими предыдущими наблюдениями12, CSA гастрокнемий миофиберов были значительно снижены на hindlimb иммобилизации(Рисунок 2A,B). Кроме того, наш иммунофлуоресцентный анализ окрашивания показал, что клетки, выражающие MCP-1 и TNF-з, оба из кото...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы описали метод применения массажа, как механический стимул, который имеет противовоспалительные эффекты. Наша система имеет следующие преимущества даже по сравнению с теми, о которых сообщалось ранее. Во-первых, предыдущие исследования не количественно определить механические силы...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что нет конкурирующих интересов, связанных с рукописью.

Благодарности

Мы благодарим К. Наканиши, К. Хамамото, Н. Куме и К. Цуруми за их постоянную поддержку на протяжении всего проекта. Эта работа частично была поддержана Фондом внутренних исследований министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии; Гранты в помощь научным исследованиям от Японского общества содействия науке; Программа MEXT для Фонда стратегических исследований частных университетов на 2015-2019 годы от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (S1511017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum wireDAISO JAPANB028An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire
Blood pressure telemeterMillarSPR-671A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure.
DAPIThermo Fisher ScientificD1306DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy.
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500)Invitrogen A11034Antibody for immunohistochemical staining.
Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500))Invitrogen A11077Antibody for immunohistochemical staining.
ImageJNIHN/AAnalysis software for image
LabChart8ADInstrumens Analysis software for acquiring biological signals.
Prolong goldThermo Fisher ScientificP36930Prolong gold is for mounting stained samples.
Protein Block Serum-FreeDakoX090930-2For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures.
Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000)Sigma AldrichL0663Antibody for immunohistochemical staining.
Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500)Abcamab6640Antibody for immunohistochemical staining.
Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000)Abcamab25124Antibody for immunohistochemical staining.
Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000)Abcamab66579Antibody for immunohistochemical staining.
Surgical tape3M Japan1530EP-0Surgical tape is used to restrict joint movement.

Ссылки

  1. Furlan, A. D., Imamura, M., Dryden, T., Irvin, E. Massage for low back pain: an updated systematic review within the framework of the Cochrane Back Review Group. Spine. 34 (16), 1669-1684 (2009).
  2. Robertson, A., Watt, J. M., Galloway, S. D. R. Effects of leg massage on recovery from high intensity cycling exercise. British Journal of Sports Medicine. 38 (2), 173-176 (2004).
  3. Waters-Banker, C., Butterfield, T. A., Dupont-Versteegden, E. E. Immunomodulatory effects of massage on nonperturbed skeletal muscle in rats. Journal of Applied Physiology. 116 (2), 164-175 (2014).
  4. Haas, C., et al. Massage timing affects postexercise muscle recovery and inflammation in a rabbit model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (6), 1105-1112 (2013).
  5. Crane, J. D., et al. Massage therapy attenuates inflammatory signaling after exercise-induced muscle damage. Science Translational Medicine. 4 (119), 119ra113(2012).
  6. Bove, G. M., Harris, M. Y., Zhao, H., Barbe, M. F. Manual therapy as an effective treatment for fibrosis in a rat model of upper extremity overuse injury. Journal of the Neurological Sciences. 361, 168-180 (2016).
  7. Andrzejewski, W., et al. Increased skeletal muscle expression of VEGF induced by massage and exercise. Folia Histochemica et Cytobiologica. 53 (2), 145-151 (2015).
  8. Mantovani Junior, N., et al. Effects of massage as a recuperative technique on autonomic modulation of heart rate and cardiorespiratory parameters: a study protocol for a randomized clinical trial. Trials. 19 (1), 459(2018).
  9. Zeng, H., Butterfield, S., Agarwal, F., Haq, T., Zhao, Y. An engineering approach for quantitative analysis of the lengthwise strokes in massage therapies. Journal of Medical Devices. 2 (4), (2008).
  10. Wang, Q., et al. A mechatronic system for quantitative application and assessment of massage-like actions in small animals. Annals of Biomedical Engineering. 42 (1), 36-49 (2014).
  11. Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
  12. Onda, A., et al. A New mouse model of skeletal muscle atrophy using spiral wire immobilization. Muscle Nerve. 54 (4), 788-791 (2016).
  13. Luster, A. D. Chemokines--chemotactic cytokines that mediate inflammation. The New England Journal of Medicine. 338, 436-445 (1998).
  14. Reid, M. B., Li, Y. P. Tumor necrosis factor-α and muscle wasting: a cellular perspective. Respiratory Research. 2 (5), 269-272 (2001).
  15. Baumann, J. U., Sutherland, M. D., Hangg, A. Intramuscular pressure during walking: An experimental study using the wick catheter technique. Clinical Orthopaedics Related Research. 145, 292-299 (1979).
  16. Lee, I., et al. Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases worldwide: an analysis of burden of disease and life expectancy. Lancet. 380, 219-229 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

151MCP 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены