Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Özet

Bu protokol, akustik damlacık fırlatma teknolojisini kullanarak 384-Well plakasında memelinin hücrelerinin yüksek verim Plasmid transfeksiyonunu açıklar. Zaman alıcı, hataya eğilimli DNA dağıtımı ve çoğullama, aynı zamanda transfeksiyon reaktif dispenpleme, yazılım odaklı ve bir nanodispenser cihaz tarafından gerçekleştirilir. Hücreler daha sonra bu önceden doldurulmuş kuyuların içinde tohumlandı.

Özet

Birçok biyolojik çalışmada vazgeçilmez olan hücre transfeksiyonu, doğru ve başarılı bir başarı için birçok parametreyi kontrol etmesini gerektirir. Çoğu zaman düşük verim olarak gerçekleştirilen, dahası zaman alıcı ve hata eğilimli, hatta daha çok zaman çeşitli plazmids çoğulma. Akustik damlacık ejeksiyon (ADE) teknolojisini kullanarak 384-kuyu plaka mizanpajında hücre transfeksiyonunu gerçekleştirmek için kolay, hızlı ve doğru bir yöntem geliştirdik. Bu çalışmada kullanılan nanodispenser cihazı, bu teknolojiye dayanmaktadır ve kaynak kuyu plakasına kadar yüksek hızda hassas nanohacim teslimatını bir hedefe sağlar. Önceden tasarlanmış bir elektronik tabloya göre, DNA ve transfeksiyon reakajlarını dağıtabilir. Burada, ADE tabanlı yüksek verim Plasmid transfeksiyonunu gerçekleştirmek için optimal bir protokol sunuyoruz ve bu da% 90 ' e kadar bir verimliliğe ve cotransfection deneylerinde yaklaşık% 100 ' lik bir kotransfeksiyona ulaşmayı mümkün kılıyor. Biz bir Kullanıcı dostu elektronik tablo tabanlı makro, en fazla dört plazmids/kuyuları 1.536 farklı plazmids ve tablet tabanlı pipetleme Kılavuzu uygulaması içeren bir kütüphaneden yönetmek mümkün teklif ederek ilk işi uzatmak. Makro, kaynak plakanın gerekli şablonunu (s) tasarlar ve nanodispenser ve tablet tabanlı uygulama için kullanıma hazır dosyaları oluşturur. Dört adımda transfeksiyon protokolü, i) klasik bir sıvı işleyici, ii) Plasmid dağılımı ve multiplexing, iii) bir transfeksiyon reakajının nanodispenser tarafından dağıtılması ve iv) ön doldurulmuş kuyularda hücre kaplamasını içerir. Ade Plasmid çoğullama ve transfeksiyon açıklanan yazılım tabanlı kontrol, hızlı ve güvenli bir şekilde güvenilir bir hücre transfeksiyon gerçekleştirmek için alanında bile uzman olmayan sağlar. Bu yöntem, belirli bir hücre türü için en iyi ayarların hızlı tanımlanması sağlar ve daha yüksek ölçekli ve el ile yaklaşımlar aktarılabilir. Protokol, insan ORFeome proteini (genom açık okuma çerçeveleri [ORFs] seti) ifadesi veya CRISPR-Cas9 tabanlı gen fonksiyon doğrulama gibi uygulamaları, havuzlu tarama stratejilerinde kolaylaştırır.

Giriş

Burada sunulan yöntem, alanda uzman olmayan kişiler için bile 384-Well plakasında akustik bazlı sıvı nanodispenser kullanarak yüksek verim ile meme hücrelerinde DNA plazmid çoğullama ve transfeksiyon gerçekleştirme konusunda ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu son yayınlanan Yöntem¹ ' den az 1 saat içinde bir deneyde 384 bağımsız plazmid DNA çoğullama ve transfeksiyon koşulları kadar performans sağlar. tek veya kotransfection deneyler başarılı oldu, yakın bir 100% ulaşan nakledilmiş hücreler nüfusu içinde cotransfection. Bu protokol transfeksiyon kolaylaştırır çünkü sıkıcı, zaman alıcı ve hataya eğilimli adımların çoğu artık yazılımla yönetilir (genel bir bakış için bkz. Şekil 1 ). Genel süreç boyunca insan hatalarının önlenmesi ve alanda uzman olmayan kişiler için bile başarılı transfeksiyon teşvik etmek amacıyla kullanım kolaylığı geliştirmek için özel araçlar geliştirmek için daha fazla çaba yapılmıştır. Açıklanan protokol, 384 bağımsız transfeksiyon koşullarını, her bir kuyunda dört plazmid 'e kadar olan çoğullama olanaklarla yönetmek için geliştirdiğimiz "Kullanıcı dostu" bir makro elektronik tablosu içerir. Makro otomatik olarak stok çözümleri ve girilen deneysel tasarım üzerine nanodispenser yazılım sürücü için gerekli dosyaları başlayarak beklenen DNA Plasmid hacmi yüklemek için kaynak plaka (ler) şablonları oluşturur. Bir 384-iyi kaynak plaka el ile DNA dağıtımı gibi sıkıcı ve hata eğilimli, biz de şablona göre DNA çözümü dağıtma sırasında Kullanıcı rehberlik için özel bir tablet tabanlı uygulama geliştirdi.

Şekil 1: deneysel iş akışı. Optimum otomatik yüksek verimlilik ters transfeksiyon protokolünün şematik gösterimi (deneysel tasarımdan özel biyolojik tahlil). Manuel adımlar el sembolüyle belirtilir ve her adım için yaklaşık süre kırmızı kutuda yazılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Birçok hücre tabanlı deneyler Plasmid DNA transfeksiyon ile başlar, ve hatta birçok adanmış reaktifler olmuştur ve hala transfeksiyon verimliliği artırmak ve/veya prosedürü kolaylaştırmak için geliştirilmiştir, çok^2,3 yapılması kalır ^{, 4}. DNA plazmid hücreli transfeksiyon, ilk kompleks alımı, endosomal kaçış ve çekirdek^5,6sitoplazmik taşıma gibi yüksek verimliliğe ulaşmak için birkaç adım içerir. Kalsiyum yağış veya özel cihazlar kullanarak mikroenjeksiyon gibi Elektroporasyon ya da fiziksel teknikler yanı sıra⁷, modern kimyasal yöntemler hücre sitoksisite azaltarak DNA hücre teslim artırılması üzerinde duruldu^{8, 9}' a kadar. Lipozit benzeri kompleksleri oluşturan lipidler veya katyonik polimerlerin kullanımı ve daha son zamanlarda, nonliposomal polimerik Kimya sistemleri transfeksiyon daha kolay ve daha verimli hale gelmiştir¹⁰. Bu gelişmelere rağmen, hücre transfeksiyon hala bu fiziksel veya kimyasal transfeksiyon protokollerinin çoğunda bilim adamlarının her DNA transfeksiyon reaksiyonu durumunu el ile hazırlamalarına ihtiyaç duyması için belirli becerilerin doğru şekilde gerçekleştirilmesi gerekir, böylece verimliliği önler. Bu sorunu aşmak için, ters transfeksiyon protokolleri, kullanıcının birkaç plazmid 'i daha hızlı bir şekilde test etmesini veya birleştirmesini sağlayan kimyasal transfeksiyon reaktifler^11,12,13kullanılarak geliştirilmiştir. Bu protokollerde, hücrelerde hücreler tohumlama yapmadan önce transfeksiyon reaktifleri ile nüklik asit kompleksler oluşur. Ancak, bu ters protokoller hala DNA çözümlerinin manuel olarak işlenmesi ve her bağımsız koşulların kombinasyonu ile sınırlıdır. Bir 96-Well plaka formatında bunları gerçekleştirmek için mümkün olmasına rağmen, DNA hazırlama ve dağıtır sıkıcı olacak ve orada büyük olasılıkla hata olacaktır. Çeşitli DNA plazmids farklı miktarlarda gerekli ve birbirleri ile Multiplexed olduğunda, hücre transfeksiyon elde etmek ve daha fazla zaman alıcı daha zor olur ve insan hataları oldukça kaçınılmaz hale gelir. Ters transfeksiyon yaklaşımında 384-Well plaka biçimine kadar ölçeklendirme, birkaç Multiplexed DNA transfeksiyon koşullarına rağmen, aşağıdaki nedenlerden dolayı imkansız bir sorun haline gelir. i) yönetmek için DNA miktarları, transfeksiyon reaksiyonu veya reaksiyon karışımı hacimleri her bir kuyu için 1 μL 'den daha düşüktür. ii) 384 için plazmids çoğullama bağımsız koşullar son derece karmaşık hale gelir. 384 kuyuların her birinde teslimat da iii) son derece zaman alıcı ve iv) hata eğilimli. Gerçekten de, beklenen kuyularda doğru çözeltinin dağıtımı, düşük hacimlerin zaten boşaltıldığından, boş ve zaten doldurulmuş kuyular arasında görsel izleme yapılmasına izin vermediğinden yönetmek zordur. v) son olarak, gerekli dağıtım adımlarını gerçekleştirmek için gereken süre nedeniyle hücreler eklenmeden önce buharlaşma ile karışımı kurutma riski yüksektir. Özetle, yüksek verimlilik sağlayan DNA plazmid transfeksiyonunun ayarlanması için sınırlama faktörü, düşük hacimli çoğullama ve el ile artık ele alınamaz ama aynı zamanda pek de ulaşılamaz bir şekilde yönetilebilen tahlil, minyatürleşme gibi görünüyor Klasik peristatik sıvı işleyicileri tarafından güvenilir bir şekilde.

Bir zorluk kanıtı olarak otomatize bu tür ve yüksek verim kazanmak için, sadece birkaç girişimi nakli otomatikleştirmek için şimdiye kadar yayınlandı: bir 96-iyi plaka formatında ticari bir sıvı taşıma cihazı ve kalsiyum fosfat yağış kullanarak¹⁴ ve, daha yakın zamanda, lipoplex reaktif ve mikroakışkan çip 280 bağımsız transfeksiyonları¹⁵ ancak bu alanda özel beceriler gerektiren sağlar. Başka bir yöntem, akustiği, sıvı Levitation izin ve sıvı manipülasyon ve karıştırma yol, 24-96-Well plaka formatları¹⁶DNA transfeksiyon gerçekleştirmek için kullanıldı. Mümkün olsa da, bu yaklaşım, DNA transfeksiyon karışımı olan hücrelerin karıştırılması gibi son derece düşük bir verim muzdarip, tohumlama öncesinde her bir nokta için 60 s inkübasyon gerektirir. Bu, tam bir 96-kuyu plakası için en az 96 dk süresi anlamına gelir. Ayrıca, bu protokol şu anda piyasada mevcut olmayan bir ev tasarımı ve üretilen cihaz ile yapılan bu iş olarak genel biyologlar ' seyirci için izin olmaktan uzak. Aksine, son birkaç yılda, kullanımı kolay bir yazılım odaklı akustik tabanlı dağıtım teknolojisi nano hacim dispenseri cihazları ile ortaya çıkmıştır. Bu cihazlar, odaklı akustik enerjiyi kullanarak, küçük sıvı hacimlerinin sıkı kontrollü şekilde çıkarılmasına 2,5 nL 'den 500 nL 'ye, kaynak plakalı bir¹⁷hedefe kadar izin verir. Akustik damlacık ejeksiyon (ADE) adı verilen bu teknolojinin sayısız avantajı vardır: tamamen otomatiktir, temassız, kesin, doğru, hassas ve son derece tekrarlanabilir ve yüksek verim¹⁸' e sahiptir. İlk olarak dimetil sulfoxid (DMSO) çözümleri sunmaya adamış, ayarlar sulu tamponlar¹⁹dağıtmak için geliştirilmiştir. Akustik nanodispensers, daha sonra, ters hücre transfeksiyon protokolleri için uygun görünüyor ve yukarıda belirtilen manuel sınırlamalar çoğunu aşmak olabilir. Hiçbir Plasmid transfeksiyon girişimleri daha önce bu teknoloji kullanılarak tanımlanmıştır olarak, son zamanlarda ters hücre transfeksiyon gerçekleştirmek için bir akustik tabanlı dağıtım sisteminin uygunluğu değerlendirilmiştir.

Nanodispenser verimi ve kullanım kolaylığı yararlanarak, biz bir 384 üzerinde DNA transfeksiyon etkileyebilecek çeşitli parametreler Cross-Testing ile HeLa hücreleri için bir ters transfeksiyon Protokolü optimize-iyi, tek plaka, yani, toplam DNA miktarı ve Kaynak DNA başlangıç konsantrasyonu, seyreltme hacmi, transfeksiyon reaktif, ve yayılma hücrelerinin sayısı. Gelişmiş protokol, hücre transfeksiyonunun yukarıda açıklanan manuel sınırlamalarını kısıtladı ve diğer otomatik transfeksiyon girişimleri üzerinde çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, bu minyatür, böylece DNA plazmid preparatları ve transfeksiyon reaktif tasarrufu ile maliyet-etkili transfeksiyon reaktif sağlar. İkincisi, bu çok daha yüksek verimlilik ve manuel protokol daha (yeni başlayanlar için bile), tüm 384-Well plaka transfeksiyon olarak daha az 1 saat içinde elde edilebilir daha tekrarlanabilir olduğunu. Son olarak, yazılım odaklı, dağıtılmaktadır DNA miktarı ve çeşitli plazmids çoğullama kontrol sağlar. Nitekim, nanodispenser yazılımı sayesinde (malzeme tablosu), Kullanıcı bir hedef bir tanımlanan kaynak iyi plaka dağıtılacak hacimleri kontrol etmek için bir çalışma planı ayrıntılı olabilir.

Burada sunulan protokol özellikle bir nanodispenser erişimi olanlar için tasarlanmıştır ve yüksek verim transfeksiyon deneyler kurmak istiyorum, aynı zamanda hızlı bir şekilde belirli bir hücre türü için transfeksiyon parametrelerini optimize etmek isteyenler için yüksek verimlilik çeşitli parametreler çapraz test etmek için bu protokol uygulama. Nitekim, bu nano protokolüyle tanımlanan optimize edilmiş parametrelerin daha büyük ölçekli ve manuel transfeksiyon deneylerine aktarılmasını gösteriyoruz. Son olarak, mevcut protokolde kullanılan transfeksiyon reakajının üreticiye göre DNA veya siRNA transfeksiyonuna izin vermesine bağlı olarak, protokol, gen ekspresyonu veya knockdown için dizi yaklaşımlarını amaçlayan kişilerin de ilgisini çekmekte. DNA ile önceden doldurulan hedef plakalar, bu tür bir uygulama için aşağıdaki protokolün başka bir avantajı olan, etkinlik kaybı olmaksızın transfeksiyon testinde kullanmadan önce 7 güne kadar koruyucu olabilir.

Protokol

1. önceden preparatlar

1. Peristaltik sıvı işleyici programlarının hazırlanması
   Not: protokolün seyreltilme ve hücre dağıtım adımları Için, dağıtım kafasının yüksekliğini kullanılan plakaya ve adım amacını dikkate alarak özel bir program hazırlanmalıdır.
   1. 1 μL seyreltilme adımı için 1 μL kaset bağlayın ve 1.1.1.1 ve 1.1.1.2 adımlarında açıklandığı gibi ayarları içeren bir program hazırlayın.
      1. Akış hızı parametresini yüksek olarak ayarlayın bu adımda biyolojik malzeme hasarı beklense en iyi verim için. Dağıtım yüksekliğini 9,6 mm 'ye ayarlayın (kullanılan hücre kültürü plakasına göre, ek Şekil 1) 1 μL düşmesine izin verme sırasında kuyuların altına dokunmayın.
         Not: Bu adım, damla yeterli bir hacim ulaşıncaya kadar dağıtım kafası damlacıklar tutulması önlemek için çok önemlidir.
      2. Her bir satırı dağıttıktan sonra dağıtım kafasının plakanın üzerinde serbest yer değiştirmesine izin vermek için plaka açık yüksekliği 14,4 mm 'ye ayarlayın. Peristaltik sıvı işleyici kafa yüksekliğinin uygun ayarlarını görsel olarak kontrol edin: dağıtım sırasında hiçbir damla dağıtım ipuçları korunur emin olun ve kafası her satır dağıttıktan sonra kafa deplasman izin verecek kadar yüksek olduğunu doğrulayın.
         Not: bırakma tutma önleme çok önemli bir parametredir, bu da dağıtmanın hacminin doğruluğunu zarar verecektir.
   2. 40 μL hücre süspansiyonunu dağıtmak için, 10 μL kaset bağlayın ve 1.1.2.1-1.1.2.2 adımlarında açıklandığı gibi ayarlarla bir program hazırlayın.
      1. Akış hızı parametresini düşük olarak ayarlayın hücreleri düşük hızda dağıtmak için, hücrelerdeki olası hasarların kesme stres ve kuyuların alt kısmında yüksek etkisi ile teşvik edilmesini önlemek için. Dağıtım yüksekliği 11,43 mm (kullanılan hücre kültürü plakasına göre, ek Şekil 1), dağıtım işlemi sırasında kuyuların altındaki hücre etkisini düşürmek için yeterince yüksek ancak damlacıklar üzerinde tutulması önlemek için yeterli düşük ayarlayın dağıtma kafası. Her bir satırı dağıttıktan sonra dağıtım kafasının plaka üzerinde serbest yer değiştirmesine izin vermek için plaka açık yüksekliği 16 mm 'ye ayarlayın.
      2. Peristaltik sıvı işleyici kafa yüksekliğinin uygun ayarlarını görsel olarak kontrol edin: dağıtım sırasında hiçbir damla dağıtım ipuçları korunur emin olun ve kafası her satır dağıttıktan sonra kafa deplasman izin verecek kadar yüksek olduğunu doğrulayın.
         Not: güvenilir olmayan bir hücre numarası dağıtmak için yol açacak gibi bırakma bekletme kaçınarak önemli bir parametresidir.
2. DNA plazmid hazırlığı (klasik Sage ekstraksiyon Protokolü)
   1. 125 μg/mL ampisilin seçim antibiyotiğiyle (malzeme tablosu) bir gecede 37 °c ' de ve bir orbital Shaker (malzeme tablosu) üzerinde nazik ajitasyon (200 rpm) altında takviye edilen lb orta olarak dönüştürülmüş DH5α bakteri gerilmesini büyütün.
   2. Kültür 2 ml hasat, 6.000 x g5 dakika santrifüpleme hücreleri Pelet ve supernatant atın.
   3. RNase A (malzeme tablosu) içeren 250 μL Resuspension tampon ile hücre Pelet resuspend. 250 μL liziz tamponu ekleyin ve üreticinin talimatlarına göre oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
   4. 300 μL nötralizasyon tamponu (malzeme tablosu) ekleyerek ve kısa bir süre içinde voronyalaştırarak liziz reaksiyonu durdurun. 11.000 x g'de 5 dakika boyunca tüpleri santrifüjün.
   5. 2 mL toplama tüpünde yeni bir Plasmid minicolumn (malzeme tablosu) yerleştirin ve 11.000 x g'de 1 dakika santrifügleme yaparak sütunda süpernatant koyun.
   6. Akış yoluyla atın ve minicolumn geri toplama tüpüne yerleştirin.
   7. Üreticinin talimatlarına göre, Plasmid minicolumn ile 500 μL opsiyonel yıkama tamponu (malzeme tablosu) ve 11.000 x g'de 1 dakika Santrifüjden yıkayın.
   8. Akış yoluyla atın ve Plasmid minicolumn geri toplama tüpü yerleştirin.
   9. Üreticinin talimatlarına göre, 11.000 x g'de 1 dakika boyunca etanol ve santrifüjlerle tamamlayıcı 700 μL yıkama tamponu (malzeme tablosu) ekleyin.
   10. Akış yoluyla atın ve Plasmid minicolumn ve onun toplama tüpü 1/2 dakika için 11.000 x g at silika membranı kurutmak için iki dakikada santrifüj.
   11. Kuru Plasmid minicolumn yeni bir 1,5 mL tüp yerleştirin ve 60 °C ' de prewarmed 30 μL distile su ekleyin, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca inkük, ve sonra, 1 dakika için santrifüj 11.000 x g.
   12. Plasmid minicolumn atın ve arındırılmış DNA plazmid içeren yıkantıdaki tutun.
   13. Mikrohacim spektrofotometresi (malzeme tablosu) kullanarak ELTILMIŞ DNA 'nın DNA konsantrasyonunu ölçün.
       1. Spektrofotometreyi açın ve DNA ölçüm ayarlarını seçin.
       2. Boş bir kalibrasyon yapmak için spektrofotometre ve pipet 1 μL su ölçüm kaide üzerine örnekleme kolu yükseltin.
       3. Örnekleme kolunu azaltın, boş ölçümü başlatın ve tamamlama için bekleyin.
       4. Örnekleme kolunu kaldırın ve numuneyi üst ve alt Kaide 'lerden silin.
       5. Alt kaide üzerine DNA çözeltisi 1 μL pipet onu ölçmek için.
       6. Örnekleme kolunu azaltın, DNA konsantrasyon ölçümünü başlatın ve tamamlama için bekleyin.
       7. Örnekleme kolunu kaldırın ve numuneyi üst ve alt Kaide 'lerden silin.
       8. Daha fazla DNA konsantrasyonu ölçümleri için, 1.2.13.5-1.2.13.7 adımlarını tekrarlayın.
   14. Ölçümler bittikten sonra, DNA çözümlerini kullanıma kadar 4 °C ' de saklayın.

2. ADE tabanlı dispensleri sürmek için deneysel tasarım ve seçim listelerinin oluşturulması

Not: bir özel "Kullanıcı dostu" elektronik tablo makro DNA miktarları yönetmek ve bir 384-Well plaka formatında dört plazmid kadar karıştırmak için geliştirilmiştir. Girilen deneysel tasarıma dayanarak, bu makro nanodispenser tarafından ADE tabanlı DNA transfeksiyon protokolünü sürücü için gerekli dosyaları üretir. Bu dosyaları oluşturmak için, Şekil 2' de gösterildiği gibi çeşitli alanların Şablon sayfasında doldurulması gerekir.

Şekil 2 : E-tablo makrosunu kullanarak Ade dağıtımında sürüş yapmak için seçim listelerinin oluşturulması. Çeşitli parametrelerin doldurulması gerekir, yani (1) TRANSFEKSIYON reaktif (tr) ve kaynak plakasında kullanılacak minimal/maksimal hacimler, (2) ilk Plasmid konsantrasyonları kaynak plakasında dağıtılacak ve (3) Tüm plaka tasarımı, beklenen Plasmid miktarları ve 384-Wells her birinde çoğullama dahil. (4) seçim listeleri oluşturma etkinleştirme farklı alanların doğrulanmasını sağlar ve bir kez düzgün doldurulur, DNA ve tr dağıtımı için seçim listeleri ve gerekli kaynak plakası şablonu otomatik olarak oluşturulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

1. Pembe alanlara nanodispenser protokol parametrelerini girin. Transfeksiyon reakajının (TR) karışım değerini 500 nL olarak ayarlayın. Kaynak plaka kuyularında minimum hacim değerini 4 μL olarak ayarlayın. kaynak plaka kuyularında maksimum hacmi 11,25 μL 'ye ayarlayın.
   Not: burada kullanılan nanodispenser sadece ADE bir çalışma içinde en fazla 500 nL transfer edebilirsiniz. Bu pembe alanlar önerilen değerlerle önceden doldurulur ancak kullanıcı gereksinimlerine göre değiştirilebilir.
2. Altta yatan DNA 'ya karşılık gelen mavi alanlarda 100 ng/μL DNA başlangıç konsantrasyonları girin.
   Not: Bu değer daha önce tanımlanmış en iyi konsantrasyonudur, ancak farklı kullanıcı ihtiyaçları için değiştirilebilir.
3. İstenen DNA miktarını gri/yeşil alanlara girin. 384 kuyuları için tutarlar ve Plasmid adlarını girin, aynı Plasmid birkaç kuyularda kullanılırsa aynı yazım sağlanması.
4. Kaynak plaka tasarımı, seçim listeleri dosyaları ve pipetleme Kılavuzu dosyasını oluşturun. Makro DNA-Picklist. csv, T. R.-Picklist. csv ve 384-Wells-Pipetting-Guide. csv dosyaları ilgili sayfada toplanan verilerden oluşturmak izin vermek için seçim listeleri oluşturmak tıklayın. İstenirse, Portakal Dolgulu hücre değerlerini, nanodispenser tarafından işlenemez hataları veya birimleri gösterir gibi düzeltin.
5. Şablonu (s) kaynak plaka sayfasından yazdırın. Plasmid isimleri ve kuyu doldurmak için minimal hacim belirtilir. Aynı şekilde, sonraki kuyularda doldurulacak olan transfeksiyon reaktif karışım hacimleri tr olarak belirtilir ve yeşil renkte vurgulanır.

3.384-Well pipetleme Kılavuzu uygulamasını kullanarak DNA kaynak plakası hazırlığı

1. Damıtılmış suyu kullanarak 1.2.14 ila 100 ng/μL 'den saklanan DNA Plasmid 'inden seyreltin.
2. 384-kuyu ızgarasını plaka boyutlarına göre kalibre edin: bir tablette 384-Well pipetleme Kılavuzu uygulamasını açın (Şekil 3). Alt ekranda ızgarada kaynak plaka yerleştirin ve sol üst kalibrasyon menüsünde, + veya - (veya kırmızı imleci kullanın) geliştirmek veya plaka dört köşe kuyuları yeşil kuyuları ayarlamak için ızgara ve kuyuların boyutunu azaltmak için .

Şekil 3 : 384-Well pipetleme Kılavuzu uygulamasının kullanımı. (1) 384-kuyu ızgarasının plaka boyutuna kalibrasyonu; (2)) çift taraflı teyp kullanarak tablete evrensel 3B baskılı plaka adaptörünün montajı; (3) plakanın adaptörün üzerine yerleştirilmesi; (4) ızgaranın deplasman onu monte plaka merkezi. (5) kalibrasyon adımının kilidi. (6) 384 kuyuları pipetleme Guide. csv dosyasının açılması. (7) dosya listesi verildiğinde, uygulama beklenen kaynak plakası adını gösterecektir, REAKTIF (DNA veya transfeksiyon reaktif), konsantrasyon, ve ses hedef kuyuları içine dağıtmak için, tek tek aydınlatılmış olacak. (8) sol ve sağ ok düğmeleri Kullanıcı elektronik tablo makro kaynak plakası şablona göre reaktifler kolayca dağıtmak için pipetleme kılavuzu takip izin verir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

3. Çift taraflı teyp kullanarak, dağıtım sırasında kaynak plaka hareketlerini önlemek için 3B baskılı plaka adaptörünü ekrana monte edin. Gerekirse, ekrandaki ızgarayı plaka konumuna ayarlamak için döndürme okları ve yukarı/aşağı/sağ/sol düğmelerini kullanarak kalibre edilmiş ızgarayı taşıyın. Izgara ve iyi boyutlar düzgün kalibre edilmiş ve bulunduktan sonra, kilit kalibrasyon kutusunu işaretleyin.
4. Dosya tıklayın ve 384 Wells pipetleme Guide. csv dosyasını açın. Gösterilen Plasmid belirtilen hacminin, beklenen plakanın uygun hedef hedefine karşılık gelen beyaz renkte belirtilen konsantrasyonda el ile dağıtması için ekran talimatlarını izleyin. Kullanmak - veya + oklar GERI veya daha fazla DNA dağıtım sürecinde gitmek için. Yüklemek için ilk transfection reaktif çözeltisi ulaşıldığında dağıtım durdurun.
5. DNA dispensasyonları bittiğinde, kaynak plakasını adaptörden çıkarın. Birkaç kaynak plakasının doldurulması gerekiyorsa, bağdaştırıcıya yeni bir kaynak plakası yerleştirin ve dağıtım talimatlarını izleyin. DNA dağıtımı bittikten sonra, uygun sıvı seviyelendirmeyi sağlamak ve ADE tabanlı aktarımların hatasına yol açan kabarcıkları kaldırmak için DNA dolu kaynak plakasını (s) (2 dk için 1.500 x g ) santrifüjler.

4. hedef plakasında peristaltik sıvı işleyici bazlı 1 μL seyreltme dağıtımı

Not: bir biyolojik Güvenlik kabininde 4.1-4.5 adımları gerçekleştirin.

1. 1 μL kaset kafasını sprey dezenfektan (malzeme tablosu) ile püskürterek dezenfekte edin ve bu çözümün uç tutucuya girmesine izin verin. Emici kağıt üzerinde kalan dezenfektan absorbe. 1 μL kasetini peristaltik sıvı işleyici cihazına bağlayın. Cihazı açın ve kaset tipi ayarının doğru olduğundan (1 μL) ve plaka formatı (384 kuyuları) olduğundan emin olun.
2. Tüpün tüm lümenini dezenfekte edin: tüp organizatörü (sekiz tüpü birlikte tutarak) steril bir damarla takın ve 5 mL% 70 alkol ile doldurun. Peristaltik sıvı işleyicinin astar fonksiyonunu kullanarak, ilk olarak tüpteki alkolü temizler ve 5 mL distile su ve 5 mL serum-serbest Orta (Dulbecco 'nun modifiye kartal orta [DMEM] 100 U/mL ile tamamlayıcı olarak geçerek durulayın. penisilin-streptomisin; Malzeme tablosu), aynı gemi içinde başarıyla doldurma. Tüm bunlardan sıvı akışını görsel olarak inceleyerek ucu hiçbiri tıkanmış olduğundan emin olun.
3. Prewarmed serum-ücretsiz orta ve dalış içinde tüp Organizatör 10 mL ile yeni bir steril gemi doldurarak serum-ücretsiz orta ile boru Prime. Yaklaşık 10 s için peristaltik sıvı işleyici Prime düğmesine basın. Bir kez daha, herhangi bir ipucu görsel olarak tüm bunlardan sıvı akışını inceleyerek tıkanmış olduğundan emin olun.
4. Plakayı 1 μL seyreltilme ile doldurun. Peristaltik sıvı iþleyici plaka taşıyıcısına steril 384-Well kültür plakası (hedef) yerleştirin ve kapağını çıkarın.
5. 384-kuyu plakasının her bir kuyunda 1 μL dağıtmak için ön kalibre programı çalıştırın. Dağıtım süresi yaklaşık 8 sn. Ardından 384-kuyu plakasının kapağını değiştirin.
   Not: Alternatif olarak, bu adım, bir emniyet kabininde, çok kanallı bir mikropipet kullanarak el ile ele alınabilir.

5. el ile Dağıtılmış birimleri kontrol etmek için bir anketin performansı

Not: Ayrıntılar Için Şekil 4' a bakın.

1. Nanodispenser programı çalıştırın, tanılama sekmesine gidin, kaynak plaka Out Box Tick, plaka tutucu üzerinde kaynak plaka yük ve plaka girmek için ın kene. İstendiğinde, nanodispenser 'i sulu tampon dağıtım moduna ayarlamak için 384Ldv_aq_b2 öğesini seçin ve oktuşuna basın.
2. Çeşitli menüde anket 'yi seçin ve Başlat'a tıklayın. Analiz etmek için önceden doldurulmuş kuyuları seçin ve Go düğmesine tıklayın. Ölçülen birimlerin beklenen olanlar ile eşleştiğinden emin olun ve bu transferlerden kaçınacak şekilde 12 μL 'den fazla hacmine sahip hiçbir kuyuların yüklenmemiş olmasını sağlayın.

Şekil 4 : Anket yazılım parametrelerini tanımlama. (1) nanodispenser programını başlatın. (2) Tanılama sekmesini açın. (3) kaynak plakası için dışarı çıkarak kaynak plakayı yerleştirin ve sonra, içinde. (4) istendiğinde menüde kaynak plakası tipini tanımlayın. (5) sair kutusunda, açılır menüde anket 'yi seçin. (6) açılışa tıklayarak anket programını başlatın. (7) ölçmek için önceden doldurulan kuyuları seçin. (8) gitmek tıklayarak analiz başlatın. (9) anket yapıldıktan sonra, ölçülen hacimler ilgili seçilen kuyularda yazılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

6. hedef plakaya ADE Driven DNA dağıtımı

1. Seçim listesi yazılımını çalıştırın, 384-Well kaynak ve hedef plaka türlerini sırasıyla 384_LDV ve Greiner 384PS_781096 olarak ayarlayın (Şekil 5). 384ldv_aq_b2seçerek cihazı sulu tampon dağıtım moduna ayarlayın ve "aktarım verimi en iyi duruma getir" işaretini kaldırın.

Şekil 5 : Seçim listesi tabanlı dispensasyonların performansı. (1) nanodispenser yazılımını başlatın. Protokol sekmesinde, (2) örnek plaka biçimini, (3) hedef plaka tipini ve (4) "aktarım verimi en iyi duruma getirme" seçeneğini belirleyin. (5) seçim listesi sekmesini seçin. (6) ithalat tıklayın ve uygun *. csv dosyasını seçin (DNA-seçim listesi veya t.c.-Picklist). (7) bir kez seçilen, ithalattıklayın. (8) tıkırtı üstünde çalmak ve kaydetmek belgili tanımlık protokol. (9) simülasyonutıklayarak bir dağıtım simülasyonu gerçekleştirin, ya da (10) Runtıklayarak programlanmış dağıtım başlatın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

2. "Seçim listesi" sekmesini seçin, ithalattıklayın, DNA-Picklist. csv dosyasını seçin. Oynat 'a tıklayın ve Protokolü kaydedin. Seçim listesinin beklenen deneysel tasarımla eşleştiğinden emin olmak için programlanmış dispensasyonların simülasyonunu gerçekleştirmek için simüle et üzerine tıklayın. Tamamlandığında, Kapat'ı tıklatın.
3. Oynat'a tıklayın ve ardından çalıştırın, dağıtım programını başlatmak için: sorulduğunda, istenen kaynak plakasını (manuel olarak doldurulmuş DNA çözümleri) ve nanodispenser 'de hedef plakayı (seyreltilmeli) yerleştirin.
   Not: dağıtım süresi, seçilen hacimlere ve deneysel tasarımdan toplam dispensasyon sayısına bağlı olarak tam 384-kuyu plakası için yaklaşık 5-20 dk 'dir.
4. Alternatif olarak, seyreltilmeli ve DNA dolu plakaları 7 güne kadar kuru veya dondurulmuş depolama işleyebilir burada protokol duraklatın. Kuru depolama için, plaka oda sıcaklığında bankta kuru ve sonra onları aynı şekilde saklamak sağlar. Transfeksiyon adımında (Bölüm 7) kullanmadan önce çözünen ve santrifüjün (2 dk için 1.500 x g 'de) dondurulmuş saklanan plakalar.
    

7. ADE Driven transfeksiyon reaktifin dağıtımı

1. Biyo-Güvenlik kabininde, serum içermeyen orta ölçekli, 1 adet final konsantrasyonuna kadar olan lipopolyplex transfeksiyon reaktörünü seyreltmeli. Vortex ve hemen bu transfeksiyon reakajının karışımı, makro tarafından tasarlanan önceden tanımlanmış kaynak plakasına (s) göre ve 3,4 adımda açıklandığı gibi önceden kalibre edilmiş 384-Well pipetleme Kılavuzu uygulamasını kullanarak dağıtabilirsiniz.
   Not: santrifüj işleminden sonra hiçbir transfeksiyon fark edildiğinden, reaktif ile birlikte yüklendikten sonra kaynak plakayı santrifüjleme.
2. 12 μL 'yi aşan birimler nedeniyle hataları dağıtmamak için kaynak plakalarının tüm manuel olarak doldurulmuş tr Wells hacimlerini kontrol etmek amacıyla, Bölüm 5 ' te açıklandığı gibi bir "anket" gerçekleştirmek için nanodispenser programını çalıştırın.
3. Seçim listesi yazılımındaki DNA seçim listesinin örnek listesini temizlemek için Sıfırla 'ya tıklayın ve aygıt parametrelerinin hala sulu arabelleklere ve 6,1 adımda olduğu gibi kullanılan kaynak ve hedef plaka türlerine ayarlandığını doğrulayın.
4. İthalat tıklayın ve tr-Picklist. csv dosyasını seçin. Oynat 'a tıklayın ve istendiğinde Protokolü kaydedin ve (Bu isteğe bağlı ama şiddetle tavsiye edilir), programlanabilir transfeksiyon reaktif karışımı dispensasyonların bir simülasyonunu kullanarak dispensasyonların uygun şekilde tasarlanması için Simüle düğmesi. Tamamlandığında, Kapat'ı tıklatın.
5. Tıklayın Play, ve sonra Çalıştır düğmesini dağıtma programı başlatmak için: istenilen şekilde, kaynak plaka (ler) (tr-karışım dolu) ve hedef plaka (seyreltilme-ve DNA-dolu) nanodispenser yerleştirin.
   Not: 500 nL TR karışımı dağıtırken, dağıtım süresi tam 384-kuyu plakası için 20 dakikadan az.
6. Üretici protokol tarafından belirtildiği gibi TR DNA 'ya ekledikten sonra oda sıcaklığında 15-30 dk inküye.

8. peristaltik sıvı işleyici tabanlı hücre dağıtımı

1. Hücreleri dağıtmak için peristaltik sıvı işleyicisini hazırlayın. 10 μL kaset kafasını Aniospray Surf 29 dezenfektan ile püskürterek ve kalıntıları kağıda emici olarak dezenfekte edin. Kasedi peristaltik sıvı işleyici cihazına monte edin, kaset tipi ayarını 10 μL olarak değiştirin ve plaka biçiminin 384 kuyu olarak ayarlandığından emin olun.
2. 10 μL kaset tüpünü, 4,2 adımda daha önce açıklandığı gibi dezenfekte edin. Steril bir gemi içinde tüp Organizatör dalış ve 5 ml 70% alkol ile tüp floş, sonra 5 ml distile su, ve son olarak, 5 mL serum-ücretsiz orta, sürekli aynı gemi içinde dolu ve her tüp boş kadar.
3. Hücre süspansiyonunu dağıtmak için hazırlayın. Bir confluent HeLa hücresinden B10-kültür çanak, 1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile hücreleri 1x yıkayın ve daha sonra 37 °C ' de 5 dakika için Trypsin/EDTA ile hücreleri ayırmak.
4. Mikroskop altında hücre kesilmesini doğrulayın ve 10 mL tam orta ekleyerek tripsin/EDTA eylemini durdurun (DMEM 10% fetal sığır serumu ve 100 U/mL penisilin-Streptomycin ile tamamlayıcı; malzeme tablosunabakın) kültür çanak. Bir 50 mL tüp içinde hasat hücreleri ve mikroskop altında hücreleri saymak, bir Malassez hücre veya otomatik hücre sayacı kullanarak.
5. En az 25 mL HeLa hücre süspansiyonu 37.500 hücre/mL tam orta (yani, 1.500 Cells/40 μL) tam bir 384-Well plaka için, tüp astar ve 40 μL/Well dağıtımı sağlamak için bir konsantrasyonda hazırlayın.
6. Hücreleri dağıtmak için, hazırlanmış hücre süspansiyon ile yeni bir steril gemi doldurun ve dağıtım hücre yoğunluğunda indoğruluk yol sedimantasyon önlemek için karıştırın. Bu çözüme tüp düzenleyicisini takın ve hücre süspansiyonu dağıtım kafasından boşaltmaya başlayana kadar Prime düğmesine basın. İpin hiçbirinin, tüm bunların sıvı akışını görsel olarak incelediğinden ve her tüpün hücre süspansiyon ile birlikte yüklendiğinden emin olun.
7. DNA ve TR dolu 384-kuyu hedef plakasını peristaltik sıvı iþleyici plaka taşıyıcısına yükleyin ve kapağını çıkarın. Tam 384-kuyu plakasında (örn., 1.500 hücreler/iyi) hücre süspansiyonunun 40 μL 'i dağıtmak için ön kalibre programı çalıştırın. Dağıtım süresi yaklaşık 8 s. 384-kuyu plakasının kapağını değiştirin.
   Not: Alternatif olarak, 40 μL hücreli süspansiyon, çok kanallı bir mikropipet kullanılarak el ile dağıtılabilir.

9. özel biyolojik tahlil (hücre transfeksiyon verimliliği izleme)

Not: deneysel ayarları ve denemenin amacını Izleyerek, Işıksaçan, floresan, yüksek içerik taraması ve Ters transkripsiyon niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) için gerekli yöntemleri kullanın. Protokol bu bölümünde, hücre transfeksiyon verimliliği otomatik floresan mikroskobu ve görüntü analizi ile değerlendirilir.

1. Plakayı 37 °C ' de, su doymuş bir atmosferde ve uygun protein ifadesine kadar% 5 CO₂ ile kulbe etme.
   Not: burada, bir 48 h inkübasyon süresi HeLa hücreleri için kullanılır transfeksiyon verimliliği izlemek için, kullanarak tdTomato-ve mVenus-ifade plazmids.
2. Kültür ortamını çıkarın 48 h sonrası transfeksiyon plakayı tersine çevirerek, peristaltik sıvı işleyici (10 μL kaset) kullanarak 30 μL/kuyu% 10 formalin ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküye edin.
3. Plakayı tersine çevirme yoluyla formalin çıkarın; sonra, 0,1 ng/mL Hoechst 1x PBS çözeltisi ile seyreltilmiş ile Oda sıcaklığında 15 dakika hücreleri inküt.
4. Formalin çözelti inkübasyon adımının 6,9 pH 'Sı ile kaybolan yüksek floresan sinyalini kurtarmak için pH = 8 ' e ayarlanmış 1x PBS 80 μL ile 15 dakika için 3x hücrelerini yıkayın.
5. Otomatik bir floresan mikroskop kullanarak, iki veya üç floresan kanalları (Hoechst, tdTomato ve mVenus) görüntüleri elde etmek için sırayla 10X hedefleri ve uygun bir emisyon filtre seti (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], dsRed ve fluorcein ısothiocyanate [FITC], sırasıyla).
6. Transfeksiyon verimliliklerini değerlendirmek için, çekirdekler boyama tabanlı komut dosyası analizini kullanarak transfeksiyon verimliliğini belirlemek için görüntü analiz yazılımını kullanın.

Sonuçlar

ADE teknolojisi otomatik bir ters transfeksiyon protokolü için kullanılabilir olup olmadığını belirlemek için fIn sipariş, biz floresan microkopi ile hücre transfeksiyon verimliliği izlenen, kırmızı floresan tdTomato plazmid ifade kullanarak. İlk olarak en iyi transfeksiyon parametrelerinin belirlenmesine yönelik olarak, farklı seyreltme hacimleri ve toplam DNA miktarı çapraz test edildi. Seyreltme hacmi, bir kez dispensed DNA damlacıkları izin için kullanılan, ön ...

Tartışmalar

Belirli bir hücre hattı için doğru bir yüksek verimlilik transfeksiyon yönteminin kurulması ve optimizasyonu, bilim adamlarının bu bölümde açıklanan bazı anahtar parametreleri takip etmesini gerektirir. HeLa hücreleri için en iyi duruma getirilmiş bu ayarlar da HEK hücreleri için verimli olduğu kanıtlanmıştır gibi protokol boyunca önerilen değerlerle başlayarak şiddetle teşvik ediyoruz. Ancak, en iyi parametreler hücre hatları ve transfeksiyon reaktifler bağlı olabilir, optimum koşullar,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
384LDV Microplate	Labcyte	LP-0200
384-well Microplate μClear Black	Greiner	781906
Ampicilin	Sigma	A9393-5G	Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet	Samsung	Galaxy Note 8	used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29	Anios	2421073	disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software	Perkin Elmer		image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10566032	cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software	Labcyte		Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550	Labcyte		ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	to fix cell
HeLa cells	ATCC	HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570	10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000	GE Healthcare	29043323	automated laser-based confocal imaging platform
LB medium	Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder	12780052	culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)	Macherey-Nagel	740912.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette	Biotek Instruments Inc	7170013	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette	Biotek Instruments Inc	7170012	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser	Biotek Instruments Inc	7171000	peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer	Denovix	DS-11 Spectrophotometer	Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid	mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid		Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)	Macherey-Nagel	740913.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey-Nagel	740588.50	used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4)	Macherey-Nagel	740914.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker	incubated large capacity shaker	444-7084	Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010001
Plasmid mini-columns	Macherey-Nagel	740499.250	Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)	Macherey-Nagel	740911.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A	Macherey-Nagel	740505	Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid	Addgene	Plasmid #54642	Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato
TransIT-X2 Dynamic Delivery System	Mirus Bio	MIR 6000
Wash Buffer (AW)	Macherey-Nagel	740916.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer	Creality	CR10S	used to print the plate adapter
Blender Software	https://www.blender.org/ Free software under GNU General Public License (GPL).	version 2.79b	used to design the plate adapter