CAS9 protein-gRNA kompleksleri Electroporation yoluyla Axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen Knock-Out

Özet

Burada sunulan, CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, akolotl spinal tellerinde zaman ve uzaya kısıtlı gen vuruş yapmak için bir protokoldür ve ardından Electroporation.

Özet

Axolotl, omuriliği tamamen yeniden üretebilmek için eşsiz bir yetenektir. Bu büyük ölçüde, ependim tüp reform ve spinal kord yaralanmasından sonra kayıp nöronlar ayırt çoğalırlar yaşam boyunca nöral kök hücreleri (nscs) olarak kalan ependim hücreler kaynaklanmaktadır. Bu nscs 'nin pluripotkans sonrası gelişimini nasıl koruyacağı ve spinal kord yaralanması üzerine çoğalırlar tam ön yaralanma yapısının yeniden çözülmesi, memelinin spinal tellerinin nasıl rejenere olduğu ve potansiyel tedavi seçeneklerinin nasıl ortaya çıktığı konusunda değerli bilgiler sunabilir. Kısıtlı bir süre içinde nscs 'nin belirli alt kümelerinde gen çarpması gerçekleştirme, kalkınma müdahaleci etkileri ile şaşırtmadan bu rejeneratif süreçlerin arkasındaki moleküler mekanizmaların incelenmesi sağlayacaktır. Burada açıklanan, CRISPR-Cas9 sistemi kullanılarak Axolotl omurilik NSCs içinde gen knock-out gerçekleştirmek için bir yöntemdir. CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, Elektroporasyon sonrasında, hedef genler, NSCs 'de omuriliğin belirli bölgelerinde istenen bir zaman noktasında yıkıldı, spinal kord NSCs 'de Moleküler çalışmalar için izin Rejenerasyon.

Giriş

Çoğu omurgasının omuriliği, kalıcı sakatlığa yol açan yaralanma sonrasında yeniden üretilemiyor. Axolotl gibi birçok Salamanders önemli istisnalar içindedir. Axolotl tamamen yapısal olarak özdeş bir omurilik yeniden üretebilir ve tamamen omurilik fonksiyonunu geri. Axolotl omurilik rejeneratif kapasitinin çoğunu ependim hücrelerden kaynaklanmaktadır. Bu hücreler merkezi kanalı hizalar ve memelilerin aksine, Axolotl ependim hücreler nöral kök hücreler (nscs) sonrası embriyonik gelişim olarak kalır. Omurilik yaralanması (örneğin, bir kuyruk amputasyonu) sonra, bu nscs ependim tüp regrow çoğalırlar ve kayıp nöronların yerine ayırt^1,2,3. Axolotl omurilik NSCs 'lerin pluripotent olarak kaldığı ve yaralanma sonrasında aktif hale getirilmesinde, insan hastaları için yeni terapötik stratejiler geliştirme konusunda değerli bilgiler temin edilebilir.

Crispr-Cas9 gen knock-out tekniğinde yapılan ilerlemeler nedeniyle, deşifre gen fonksiyonunun çökmesini gerçekleştirmek daha kolay hale gelmiştir ve semenderlerin^4,5 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin geniş uygulanabilirliğini göstermiştir. ^{6 , 7 , 8}. tam Axolotl genom ve transkriptom son sürümü şimdi herhangi bir genomik Locus hedeflenmesini sağlar ve off-hedef etkileri için daha iyi değerlendirmek için^{9,10,11,12 , 13} ' ü ^{, 14}. Crispr-Cas9 sistemi¹⁵kullanarak aksiyolotlar içinde knock-out ve knock-in için iyileştirilmiş protokoller geliştirilmiştir. Cas9 protein-Grna ribonukleoprotein (RNP) şeklinde Crispr-Cas9 makinenin teslimi, Cas9 ve Grna-kodlama plazmids⁴kullanarak daha verimli olduğu gösterilmiştir. Bu büyük olasılıkla RNP Plasmid vektörler daha küçük olması nedeniyle, onun yeteneği hemen DNA tatili oluşturmak ve RNA bozulması gRNA koruma. Buna ek olarak, RNPs kullanarak transkripsiyon ve çeviri atlar; Böylece, Plasmid elemanları farklı bir türden türetildiği zaman Organizatör gücü ve optimum kodon kullanımı gibi sorunları önler.

Fonksiyon kaybı çalışmaları, ilgi genlerinin potansiyel işlevlerini araştırmak için genel yaklaşımlardan biridir. Rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu incelemek için, bir vuruş ideal gelişim üzerindeki etkileri önlemek için bir yaralanma hemen önce yapılmalıdır. Ayrıca, knock-out hem NSCs hem de rejenerasyon bölgesi ile sınırlandırılmalıdır. Tüm NSCs 'deki hedef geni (CRE-LoxP sistemlerinde bulunan beyinde de dahil olmak üzere) bir vuruş, sonuçların yorumlanmasında bulunabilen rejenerasyona bağlı olmayan efektler üretebilir. Neyse ki, Axolotl omuriliğin yapısı NSCs 'de zaman ve boşluk kısıtlanması için benzersiz bir fırsat sağlar. Omurilik nscs çoğu merkezi kanal ile temas halinde ve merkezi kanal ile temas hücrelerin büyük çoğunluğu teşkil^16,17. Bu nedenle, CAS9-Grna kompleksinin merkezi kanala enjekte edilmesi, ardından Elektroporasyon, belirli bir zamanda istenilen bölgede omurilik nscs 'ye teslim edilmesini sağlar^4,18,19. Bu protokol, bunun nasıl gerçekleştirileceğini, hedeflenen omurilik NSCs 'de son derece penetran bir vuruş yapmaya neden olduğunu gösterir. daha sonra rejenerasyon ve NSC davranışı üzerindeki etkileri incelemek için sonraki analiz gerçekleştirilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Hayvan deneylerinde yerel ve ulusal düzenlemelere uygun olarak ve ilgili kurumsal İnceleme Kurulu onayı ile yapılmalıdır.

1. CAS9-gRNA RNP karışımı hazırlama

1. GRNAs 'ı tasarlama ve sentezlemek.
   Not: sadece semenderlerin^15,20,21,22ile ilgili biri dahil olmak üzere grnas tasarlama ve synthesizer için diğer yayınlara bakın.
2. CAS9-NLS proteini ev içinde hazırlayarak veya ticari olarak satın alarak edinin.
3. CAS9-gRNA karışımı 5 μg CAS9-NLS proteini, 4 μg gRNA, 0,9 μL 10X CAS9 tamponu karıştırarak hazırlayın ve hacmi 10 μL 'ye kadar doldurun-80 °C ' de hemen kullanılmamalıdır.

2. Elektroporasyon için agaroz plakaları hazırlama

1. 1x dpbs 'de% 2 (WT/Vol) agaroz çözeltisi 200 ml hazırlayın. Bir mikrodalga içinde solüsyonu ısıtarak çözülür ve yaklaşık 10 mm derinliğe 10 cm Petri yemekleri üzerine dökün (tüm hayvanı kapsayacak kadar derin).
2. Plakaların oda sıcaklığında katılaşma izni verin. Hemen kullanılmadı ise 4 °C ' de depo plakaları.
3. Cerrahi neşter kullanarak, kuyruk düz tutmak için bir yarık yapmak için agaroz plaka kesme, hayvan gövdesinde uygun bir iyi, ve elektrotlar yerleştirmek için iki ekstra kuyular (Şekil 1E).
4. Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve buz gibi soğuk 1x DPBS ile doldurun. Ayarda tutarlı elektrik iletkenlik sağlamak için plakaları yapmak için aynı DPBS çözümünü kullanın.

3. elektroporator konfigürasyonu

1. Elektroporatörü yapılandırın. 5 ms, 50 MS aralığı ve hiçbir voltaj çürüme süresi ile 70 V bir Bipolar nabız oluşur Poring darbe ayarlayın. 50 MS süresi, 999 MS aralığı ve% 10 voltaj çürümesi ile 40 V dört Bipolar darbe için transfer nabız ayarlayın.
2. Elektrotları elektroporator 'a bağlayın ve cımbların 7 mm dışında olmasını ayarlayın. Elektroporasyon arasında önce ve içinde dpbs bir kabı elektrotlar Submerge.

4. mikroenjeksiyon cam kapillaries hazırlama ve yükleme

1. Isı değerini belirlemek için üreticinin talimatlarına göre bir alev/kahverengi mikropipet çektirme üzerinde bir rampa testi gerçekleştirin.
2. Aşağıdaki parametreleri kullanarak konik uçları ile enjeksiyon kapillaries çekin: ısı = rampa test değeri, çekme = 100, hız = 100, zaman = 100.
3. Stereomikoskop altında iğne gözlemlemek. İnce forseps kullanarak, eğri bir ucu var, böylece kapiller bir açı kırın. Cilt delmek için yeterince güçlü iken, merkezi kanal hedeflemek için yeterince ince bir pozisyonda break.
   Not: çapı yaklaşık 20 μm veya omurilik çapının yaklaşık% 50 olan nokta iyi bir başlangıç noktasıdır. Optimum kırma elde etmek için birden çok deneme gerekebilir.
4. 1:30 oranındaki RNP karışımlarına hızlı yeşil FCF solüsyonu ekleyin ve Microloader pipet ucu ile kapiller içine 5 μL enjeksiyon karışımı yükleyin.
5. Pnömatik pompanın üzerine kapiller monte edin, eğimli ucu aşağı doğru bakacak şekilde.

5. Pnömatik pompanın yapılandırılması

1. Pnömatik pompası yapılandırın. 0,5 inç kare başına pound (psi), 2 psi tutun ve süre Gated için çıkarmak için tutun ayarlayın.
2. Kapiller bir damla su içine daldırma ve enjekte etmek için Ayak pedalına basarak kapiller ve pnömatik pompa ayarlarını test edin. Enjeksiyon karışımı yavaş ama sabit bir akışta çıkıyor emin olun.
3. Enjeksiyon karışımı kendiliğinden sızmaya başlar veya su kapiller kadar emdi Eğer basılı tutun basıncı ayarlayın. Enjeksiyon karışımı çok yavaş çıkıyor Eğer ejeksiyon basıncı artırın veya kapiller daha fazla kırmak. Enjeksiyon çok hızlı çıkıyor Eğer ejeksiyon basıncı azaltın.

6. omurilik içine RNP karışımı enjekte

1. % 0,03 Benzocain çözeltisi içinde en az 10 dk. içinde anestezize semenderlerin hayvanların su içinde ters onları saygısız tarafından duyarlı değildir kontrol edin.
2. Yüzük forseps ile bir hayvan pick up ve silikon bir yatağa, hayvanın sol tarafı yukarı bakacak ve kuyruk sağa doğru işaret ile yatıyordu. Enjeksiyon alanını stereomikorkop görüş alanının ortasına konumlandırın (Şekil 1A).
3. Mikromanipülatörü, kapiller görünüm alanının sağ tarafındaki 60 ° ' de gelecek şekilde ayarlayın (Şekil 1B).
4. Omuriliği ve merkezi kanalı belirleyin (Şekil 1C).
   Not: omurilik notoakor üzerinde tübüler yapısı.
5. Merkezi kanal hedefleyen, yavaşça omurilik merkezi kanala cilt ve kas delmek için kapiller ileriye taşıyın. Omurilik kuyruk kaslarının hemen altında olduğu için, kapiller hareketini küçük adımlarla sınırlandırın.
6. Karışımı merkezi kanala enjekte etmek için ayak pedalını basılı tutun. RNP karışımı merkezi kanal boyunca her iki yönde mavi bir çizgi olarak yayılır olup olmadığını gözlemleyin, bu da kapiller doğru konumlandırılmış olduğunu gösterir (Şekil 1D).
7. Bu gerçekleşmezse, RNP karışımı başlayana kadar kapiller hafifçe içeri ve dışarı hareket ettirirken ayak pedalını basılı tutun. Kapiller doku tarafından tıkanmış hale gelirse, yüksek basınçlarda suya fırlatarak temizleyin.
8. Fırlatma basıncını, RNP karışımının merkezi kanalda yayılmasına neden olacak şekilde ayarlayın, ancak yapıyı havaya uçuracak kadar değil.
9. İğne karışımı merkezi kanal boyunca daha da yayılır böylece ayak pedalı basılı tutmaya devam, beyin omurilik ve ventrikül sonunda Terminal vezikül ulaşır kadar.
   Not: Bu, hayvanın boyutuna bağlı olarak 2 dakikaya kadar sürebilir. RNP karışımı beyin ventrikül girmek için neden bir süre sonra basıncı artırmak için gerekli olabilir.
10. Başarılı enjeksiyondan sonra Elektroporasyon mümkün olan en kısa sürede devam edin.

7. Elektroporasyon

1. Hayvanları halka forseps ile hazırlanan agaroz Elektroporasyon plakasına (Şekil 1E) buz üzerinde aktarın. Kuyruğunu yarık içine yerleştirin, böylece agaroz (Şekil 1F) ile sandviç yapın.
2. Elektrotları kuyruğun her iki tarafındaki kuyulara yerleştirin. Tüm hayvan ve elektrotlar buz-soğuk PBS ile kaplıdır emin olun.
3. Electroporation başlatmak için ayak düğmesine basın.
4. Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, hayvan suya geri dönün.
5. Gerekirse daha fazla hayvan enjekte etmeye devam edin.
6. Anestezi kapalı giydikten sonra electroporated hayvanların sağlıklı olup olmadığını kontrol edin ve kuyruğuna yapılan herhangi bir hasar yoktur.

8. vuruş verimliliğini değerlendirmek

1. Electroporated hayvanın kuyruğunu düzelt. Kuyruk çapraz bölümler yapmak immünohistokimyasal boyama tarafından takip protein düzeyinde knock-out verimliliğini değerlendirmek için.
   Not: Eğer bir kuyruk amputasyonu Electroporation sonra gerçekleştirilecek ise, kesme kuyruğu bu amaçla kullanılabilir. GFP veya tyrosinase karşı gRNAs ile electroporated hayvanlar, Örneğin, negatif kontrol olarak kullanılabilir⁴.
2. Alternatif olarak, electroporated omurilik çıkarılan ve DNA için lysed olabilir. Düzenlenmiş genetik loci¹⁵yüzdesini değerlendirmek Için Sanger sıralamayı veya yeni nesil sıralamanın ardından Genotipleme PCR gerçekleştirin.
   Not: sonuç düzenleme verimliliği nscs için gerçek düzenleme verimliliği hafife, non-electroporated hücrelerin ve merkezi lümene apikal temas eksikliği ve böylece RNP karışımı almazsınız nöronlar dahil nedeniyle.

Sonuçlar

Sox2 karşı CAS9-Grna kompleksinin enjeksiyonu ve electroporasyonu, Axolotl omurilik merkezi kanalına, spinal kord nscs çoğunluğu IÇINDE büyük Sox2 immünoreactivity kaybına yol açtı, Grna, Tyrosinaz (TYR) karşı bir kontrol olarak (Şekil 2 A). B3-tubulin (TUJ1 ile lekelenmiş), nöronlar için bir Işarettir ve nscs 'de ifade edilmedi ve merkezi kanalı çevreleyen SOX2-TUJ1-hücreler SOX2 silmeleri barındıran hücreler olarak kabul edildi. ...

Tartışmalar

Açıklanan protokol, Axolotl omuriliğinde NSCs 'de zaman ve uzaya kısıtlı gen çarpmasına olanak sağlar. Geçerli protokol, NSCs 'nin belirli bir zaman ve konumda yüksek penetrance ile belirli hedeflemesini sağlar. CRE-LoxP sistemini kullanırken ortaya çıkan beyin gibi diğer bölgelerde NSCs 'deki gen knock-out ' d a n kaynaklanan potansiyel istenmeyen efektleri önler. Aynı zamanda kalıcı bir knock-out kaynaklanan gelişimsel etkileri önler, gen fonksiyonu rejenerasyon odaklı çalışma izin. Buna ek o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501-100G
Benzocaine 0.03 % (wt/vol)	Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Benzocaine 10 % (wt/vol)	Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.
Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.	Stutter Instrument	BF120-94-8
CaCl2·2H2O	Merck	102382
CAS9 buffer, 10x	Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months
CAS9-NLS protein	PNA Bio	CP03
Cell culture dishes, 10cm	Falcon	351029
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Scientific Instruments	11254-20
Electroporator	Nepa Gene	NEPA21
	BEX	Pulse Generator CUY21EDIT II
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5x	Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS.
Flaming/Brown Micropipette Puller	Stutter Instrument	P-97
Holtfreter’s solution 400% (wt/vol)	Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
KCl	Merck	104936
MgSO4·7H2O	Merck	105886
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MN-153
NaCl	Merck	106404
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV830
Ring Forceps	Fine Scientific Instruments	11103-09
Stereomicroscope	Olympus	SZX10
Tris base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-buffered saline, 10x	Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter	Nepa Gene	CUY650P10