Прямой ген knock-out аксолотла спинного мозга нейронных стволовых клеток через Электропорации CAS9 Белковые-gRNA комплексов

Резюме

Представлено здесь протокол для выполнения времени и пространства ограниченного гена нокаут в аксолотль спинного мозга путем введения CAS9-gRNA комплекса в спинной мозг центрального канала с последующим электропорированием.

Аннотация

Аксолотль обладает уникальной способностью полностью регенерировать спинной мозг. Это в значительной степени из-за эпендимальных клеток, оставшихся в качестве нервных стволовых клеток (НСК) на протяжении всей жизни, которые распространяются на реформу эпендимальной трубки и дифференцироваться в потерянные нейроны после травмы спинного мозга. Расшифровка, как эти NSCs сохранить плюрипотентность после развития и размножаться на повреждение спинного мозга для реформирования точной структуры до травмы может обеспечить ценную информацию о том, как млекопитающих спинного мозга может регенерировать, а также потенциальные варианты лечения. Выполнение генных нокаутов в конкретных подмножествах НСК в течение ограниченного периода времени позволит изучать молекулярные механизмы, стоящие за этими регенеративными процессами, не будучи сбит с толку эффектами, возмущающимися развитием. Описано здесь метод для выполнения гена нокаут в аксолоттный спинной мозг NSCs с помощью системы CRISPR-Cas9. Путем впрыскивать комплекс CAS9-gRNA в центральный канал спинного мозга последованного за электропорированием, гены цели постучаны вне в NSCs внутри специфически зоны спинного мозга на познаваемое timepoint, позволяющ для молекулярных изучений NSCs спинного мозга во время Регенерации.

Введение

Спинной мозг большинства позвоночных не может регенерировать после травмы, что приводит к постоянной инвалидности. Некоторые саламандры, такие как аксолотль, являются заметными исключениями. Аксолотл может полностью регенерировать структурно идентичный спинной мозг и полностью восстановить функцию спинного мозга. Большая часть регенеративной способности аксолотов огорожения обусловлена эпендимальными клетками. Эти клетки выстраивались в линию центрального канала, и в отличие от клеток млекопитающих, аксолотальные эпендимальные клетки остаются в виде нервных стволовых клеток (НСК) после эмбрионального развития. После травмы спинного мозга (например, от ампутации хвоста), эти NSCs размножаться, чтобы вырастить эпендимальной трубки и дифференцировать, чтобы заменить потерянные нейроны^1,2,3. Раскрытие того, как аксолотл спинного мозга NSCs остаются плюрипотентными и активировать после травмы может предоставить ценную информацию о разработке новых терапевтических стратегий для пациентов.

В связи с достижениями в CRISPR-Cas9 ген нокаут техники, выполнение нокаутов, чтобы расшифровать функцию гена стало легче и было показано, что широкое применимость в различных видах, в том числе аксолотлы^{4,5, 6 , 7 (г. , 8}. Недавний выпуск полного генома аксолоцла и транскриптома теперь позволяет любой геномный локус быть мишенью и для лучшей оценки вне целевых эффектов^{9,10,11,12 , 13 Год , 14}. Разработаны оптимизированные протоколы для нокаута и стука в аксолотах с использованием системы CRISPR-Cas9^15. Доставка оборудования CRISPR-Cas9 в виде циноворенного рибонуклеопротеина CAS9 (РНП) оказалась более эффективной, чем использование плазмид Cas9 и gRNA-encoding^4. Это, вероятно, из-за RNP быть меньше по размеру, чем плазмидные векторы, его способность создавать ДНК перерывы немедленно, и защита гРНК от деградации РНК. Кроме того, использование RNPs обходит транскрипцию и перевод; Таким образом, он избегает таких вопросов, как прочность промотора и оптимальное использование кодона, когда плазмидные элементы являются производными от различных видов.

Исследования потери функций являются одним из общих подходов к изучению потенциальных функций генов, представляющих интерес. Для того, чтобы изучить функцию генов во время регенерации, нокаут в идеале должны быть выполнены непосредственно перед травмой, чтобы избежать воздействия на развитие. Кроме того, выбивка должна быть ограничена как НСК, так и областью регенерации. Выбив из целевого гена во всех NSCs (в том числе в головном мозге, что имеет место в системах Cre-LoxP), может производить эффекты, не связанные с регенерацией, которые могут сбить с толку интерпретацию результатов. К счастью, структура аксолотового спинного мозга предоставляет уникальную возможность для времени и ограниченного пространства нокаутом в НСК. Большинство спинного мозга NSCs находятся в контакте с центральным каналом и составляют подавляющее большинство клеток в контакте с центральным каналом^16,17. Таким образом, инъекция комплекса CAS9-gRNA в центральный канал, за которым следует электропорация, позволяет доставлять в спинной мозг НСК в нужном регионе в определенное время^4,18,19. Этот протокол демонстрирует, как это выполняется, что приводит к весьма проникающим нокаутом в целевом спинном мозге NSCs. Последующий анализ затем проводится для изучения влияния на регенерацию и поведение НСК.

протокол

Все эксперименты на животных должны проводиться в соответствии с местными и национальными правилами по экспериментам на животных и с одобрения соответствующего институционального совета по обзору.

1. Подготовка смеси CAS9-gRNA RNP

1. Дизайн и синтез гРНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к другим публикациям для проектирования и синтеза gRNA, в том числе один исключительно в отношении акстолотлов^15,20,21,22.
2. Получить белок CAS9-NLS, готовя в доме или приобретая его на коммерческой основе.
3. Подготовка смесь CAS9-gRNA путем смешивания 5 мкг белка CAS9-NLS, 4 мкг гРНК, 0,9 л 10x буфера CAS9, и заполнить объем до 10 qL с нуклеазой без H₂O. Аликот смеси и хранить при -80 градусов по Цельсию, если не использовать сразу.

2. Подготовка агарозных пластин для электропорации

1. Приготовьте 200 мл 2% (wt/vol) агарозного раствора в 1x DPBS. Растворите, нагревая раствор в микроволновой печи и вылейте его на 10 см посуды Петри на глубину около 10 мм (достаточно глубоко, чтобы покрыть все животное).
2. Разрешить пластины затвердеть при комнатной температуре. Храните тарелки при 4 градусах По цельсию, если они не используются немедленно.
3. Используя хирургические скальпели, вырезать агарозную пластину, чтобы сделать щель для проведения хвост прямо, хорошо для установки в теле животного, и два дополнительных скважин для размещения электродов (Рисунок 1E).
4. Поместите тарелку на лед и заполните ее до краев ледяной 1x DPBS. Используйте тот же dPBS решение для изготовления пластин для обеспечения последовательной электрической проводимости в настройке.

3. Настройка электропортора

1. Нареживаните электропоратор. Настройка пульса для того чтобы consist up одного биполярного пульса 70 V, с продолжительностью 5 ms, интервалом 50 ms, и никаком распаде напряжения. Настройка импульса передачи иметь четыре биполярных импульсов 40 В, с продолжительностью 50 мс, интервал 999 мс, и 10% распада напряжения.
2. Подключите электроды к электропореру и отрегулируйте пинцет на части на 7 мм. Погрузите электроды в стакан DPBS до и между электропорированием.

4. Подготовка и загрузка микроинъекционных стеклянных капилляров

1. Выполните тест рампы на пылающий / коричневый микропайпот шкив в зависимости от инструкций производителя, чтобы определить тепловую стоимость.
2. Вытяните инъекционные капилляры с конические концы, используя следующие параметры: тепло - рампа тестное значение, тянуть 100, скорость - 100, время - 100.
3. Наблюдайте за иглой под стереомикроскопом. Используя тонкие щипцы, разорвать капилляр под углом, так что он имеет наклонный кончик. Перерыв в положении, где он достаточно тонкий, чтобы цель центрального канала, будучи достаточно сильным, чтобы проколоть кожу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точка, в которой диаметр составляет около 20 мкм или около 50% от диаметра спинного мозга является хорошей отправной точкой. Несколько попыток могут быть необходимы для получения оптимального нарушения.
4. Добавьте раствор Fast Green FCF в смесь RNP в соотношении 1:30 и загрузите около 5 кЛ смеси инъекций в капилляр с наконечником пипетки Microloader.
5. Установите капилляр на пневматический насос, с наклонной кончик лицом вниз.

5. Настройка пневматического насоса

1. Наверстрими пневматический насос. Установите трюм до 0,5 фунтов на квадратный дюйм (пси), выбрасывать до 2 пси провести, и продолжительность закрытого.
2. Испытать капиллярные и пневматические настройки насоса путем погружения капилляра в каплю воды и нажатия педали ноги, чтобы впрыснуть. Убедитесь, что инъекционная смесь выходит в медленном, но устойчивом потоке.
3. Отрегулируйте давление удержания если смешивание впрыска начинает протекать вне самопроизвольно или вода всасывается вверх по капилляру. Увеличьте давление выброса или сломать больше капилляров, если инъекция смесь выходит слишком медленно. Снижение давления выброса, если инъекция выходит слишком быстро.

6. Инъекция смеси RNP в спинной мозг

1. Анестезия аксолотлов в 0,03% бензокаин раствор, по крайней мере 10 мин. Проверьте, что животные не реагируют, переворачивая их вверх дном в воде.
2. Возьмите животное с кольцом щипцы и положите его на кровать из кремния, с левой стороны животного вверх и хвост, указывая вправо. Расположите место инъекции в середине поля зрения стереомикроскопа(рисунок 1А).
3. Отрегулируйте микроманипулятор так, чтобы капилляр витупил на 60 градусов с правой стороны поля зрения(рисунок 1B).
4. Определите спинной мозг и центральный канал(рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спинной мозг трубчатой структуры выше notochord.
5. Стремясь к центральному каналу, переместите капилляр вперед, чтобы мягко проколоть кожу и мышцу в центральный канал спинного мозга. Ограничьте движение капилляра небольшими шагами, так как спинной мозг находится прямо под хвостовыми мышцами.
6. Нажмите и удерживайте педаль ноги, чтобы придать смесь в центральный канал. Обратите внимание, распространяется ли смесь RNP вдоль центрального канала в виде синей линии в обоих направлениях, что показывает, что капилляр был правильно расположен(рисунок 1D).
7. Если этого не происходит, держать педаль ноги нажата при перемещении капилляра немного в и до RNP смесь начинает происходит дюйма Если капилляр засоряется тканью, очистите его, выбрасывая в воду при более высоком давлении.
8. Отрегулируйте давление выброса так, чтобы это было достаточно, чтобы вызвать RNP смесь распространяться в центральном канале, но не так много, что он взрывает структуру.
9. Продолжайте удерживать педаль ноги, чтобы инъекционная смесь распространяется дальше вдоль центрального канала, пока не достигнет терминала везикулы в конце спинного мозга и желудочков в головном мозге.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять до 2 минут в зависимости от размера животного. Это может быть необходимо, чтобы увеличить давление через некоторое время, чтобы вызвать RNP смесь войти в желудочки мозга.
10. Приступить как можно скорее к электропорации после успешной инъекции.

7. Электропорация

1. Перенесите животное с щипцов кольцами на подготовленную агарозную электропорацию пластины(рисунок 1E) на льду. Поместите хвост внутри щели, чтобы он зажат агарозой(рисунок 1F).
2. Поместите электроды в колодцы по обе стороны хвоста. Убедитесь, что все животное и электроды покрыты ледяной PBS.
3. Нажмите на выключатель ноги, чтобы начать электропорацию.
4. После завершения электропорации верните животное в воду.
5. При необходимости приступить к введению большего количества животных.
6. Убедитесь, что электропоранные животные здоровы после анестезии и что нет никакого ущерба, нанесенного хвосту.

8. Оценка эффективности нокаута

1. Закрепите хвост электропора. Сделайте поперечные сечения хвоста с последующим иммуногистохимическим окрашиванием для оценки эффективности нокаута на уровне белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если ампутация хвоста должна быть выполнена после электропорации, отрезанный хвост может быть использован для этой цели. В качестве отрицательного контроля⁴можно использовать животных с помощью гРНК против Gfp или tyrosinase.
2. Кроме того, электропоранный спинной мозг может быть извлечен и лисичен для ДНК. Выполните генотипирование ПЦР с последующим секвенированием Sanger или секвенированием следующего поколения для оценки процента отредактированных генетических локутов^15.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В результате эффективность редактирования будет недооценивать фактическую эффективность редактирования для NSCs, в связи с включением неэлектропорированных клеток и нейронов, которые не имеют apical контакт с центральным просветом и, таким образом, не будет получать RNP смеси.

Результаты

Инъекции и электропорации комплекса CAS9-gRNA против Sox2 в аксолоттальный спинной мозг центрального канала привело к массовой потере SOX2 иммунореактивности в большинстве спинного мозга NSCs, с гРНК против тиросинезы (Тир) в качестве контроля (Рисунок 2 A).B3-tubulin (ок?...

Обсуждение

Описанный протокол позволяет времени и пространства ограниченного гена нокаут в NSCs в аксолотель спинного мозга. Текущий протокол позволяет конкретно таргетинга НСК в определенное время и место с высоким penetrance. Он позволяет избежать потенциальных нежелательных эффектов, происходящих...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501-100G
Benzocaine 0.03 % (wt/vol)	Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Benzocaine 10 % (wt/vol)	Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.
Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.	Stutter Instrument	BF120-94-8
CaCl2·2H2O	Merck	102382
CAS9 buffer, 10x	Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months
CAS9-NLS protein	PNA Bio	CP03
Cell culture dishes, 10cm	Falcon	351029
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Scientific Instruments	11254-20
Electroporator	Nepa Gene	NEPA21
	BEX	Pulse Generator CUY21EDIT II
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5x	Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS.
Flaming/Brown Micropipette Puller	Stutter Instrument	P-97
Holtfreter’s solution 400% (wt/vol)	Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
KCl	Merck	104936
MgSO4·7H2O	Merck	105886
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MN-153
NaCl	Merck	106404
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV830
Ring Forceps	Fine Scientific Instruments	11103-09
Stereomicroscope	Olympus	SZX10
Tris base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-buffered saline, 10x	Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter	Nepa Gene	CUY650P10