Direkter Gene Knock-out von Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung zeit- und raumbeschränkter Gen-Knock-out in Axolotl-Rückenmarksen vorgestellt, indem der CAS9-gRNA-Komplex in den Zentralkanal des Rückenmarks injiziert wird, gefolgt von Elektroporation.

Zusammenfassung

Das Axolotl hat die einzigartige Fähigkeit, sein Rückenmark vollständig zu regenerieren. Dies ist weitgehend auf die ependymalen Zellen zurückzuführen, die im Laufe des Lebens als neuronale Stammzellen (NSCs) verbleiben, die sich vermehren, um die ependymale Röhre zu reformieren und sich nach einer Rückenmarksverletzung in verlorene Neuronen zu differenzieren. Die Entschlüsselung, wie diese NSCs die Pluripotenz nach der Entwicklung beibehalten und sich bei Rückenmarksverletzungen vermehren, um die exakte Vorverletzungsstruktur zu reformieren, kann wertvolle Einblicke in die Art und Weise liefern, wie sich das Rückenmark von Säugetieren regenerieren kann, sowie mögliche Behandlungsmöglichkeiten. Die Durchführung von Gen-Knock-outs in bestimmten Teilmengen von NSCs innerhalb eines begrenzten Zeitraums wird es ermöglichen, die molekularen Mechanismen hinter diesen regenerativen Prozessen zu untersuchen, ohne durch entwicklungsstörende Effekte verwirrt zu werden. Hier wird eine Methode beschrieben, um Gen-Knock-out in Axolotl Rückenmarks-NSCs mit dem CRISPR-Cas9-System durchzuführen. Durch die Injektion des CAS9-gRNA-Komplexes in den Zentralkanal des Rückenmarks, gefolgt von Elektroporation, werden Zielgene in NSCs innerhalb bestimmter Regionen des Rückenmarks zu einem gewünschten Zeitpunkt ausgeschlagen, was molekulare Studien von Rückenmarks-NSCs während erneuerung.

Einleitung

Das Rückenmark der meisten Wirbeltiere kann sich nach verletzungen nicht regenerieren, was zu einer bleibenden Behinderung führt. Mehrere Salamander, wie das Axolotl, sind bemerkenswerte Ausnahmen. Das Axolotl kann ein strukturell identisches Rückenmark vollständig regenerieren und die Funktion des Rückenmarks vollständig wiederherstellen. Ein Großteil der Regenerationsfähigkeit des Axolotl Rückenmarks ist auf ependymale Zellen zurückzuführen. Diese Zellen säumen den zentralen Kanal, und im Gegensatz zu denen bei Säugetieren bleiben Axolotl-Ependymale Zellen als neuronale Stammzellen (NSCs) nach der embryonalen Entwicklung erhalten. Nach einer Rückenmarksverletzung (z.B. durch eine Schwanzamputation) vermehren sich diese NSCs, um die ependymale Röhre nachzuwachsen und sich zu unterscheiden, um verlorene Neuronen^1,2,3zu ersetzen. Die Aufdeckung, wie Axolotl Rückenmarks-NSCs pluripotent bleiben und nach einer Verletzung aktiviert werden, kann wertvolle Informationen über die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für menschliche Patienten liefern.

Aufgrund der Fortschritte in der CRISPR-Cas9-Gen-Knock-out-Technik ist die Durchführung von Knock-outs zur Entschlüsselung der Genfunktion einfacher geworden und hat sich bei verschiedenen Arten, einschließlich Axolotls^{4,5, 6 , 7 , 8}. Die kürzliche Veröffentlichung des vollständigen Axolotl-Genoms und Transkriptoms ermöglicht es nun, jeden genomischen Ort gezielt zu betrachten und die Off-Target-Effekte^9,10,11,12 besser zu bewerten. ^{, 13 , 14}. Optimierte Protokolle wurden für Knock-out und Knock-in in Axolotls mit dem CRISPR-Cas9 System¹⁵entwickelt. Die Lieferung der CRISPR-Cas9-Maschinerie in Form von CAS9-Protein-gRNA-Ribonucleoprotein (RNP) hat sich als effizienter erwiesen als die Verwendung von Cas9- und gRNA-kodierenden Plasmiden⁴. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die RNP kleiner ist als Plasmidvektoren, ihre Fähigkeit, DNA-Brüche sofort zu erstellen, und der Schutz der gRNA vor DEM RNA-Abbau. Darüber hinaus wird die Transkription und Übersetzung durch RNPs umgangen; Somit vermeidet es Probleme wie Diebesstärke und optimale Codon-Nutzung, wenn Plasmidelemente von einer anderen Spezies abgeleitet werden.

Funktionsverluststudien sind eine der allgemeinen Ansätze zur Untersuchung potenzieller Funktionen von Genen von Interesse. Um die Genfunktion während der Regeneration zu untersuchen, sollte idealerweise ein Knock-out kurz vor einer Verletzung durchgeführt werden, um Auswirkungen auf die Entwicklung zu vermeiden. Darüber hinaus sollte der Knock-out sowohl auf die NSCs als auch auf die Region der Regeneration beschränkt werden. Ein Knock-out des Zielgens in allen NSCs (einschließlich der im Gehirn, was bei Cre-LoxP-Systemen der Fall ist), kann Effekte erzeugen, die nicht mit der Regeneration zusammenhängen und die Interpretation der Ergebnisse verwirren können. Glücklicherweise bietet die Struktur des Axolotl Rückenmarks eine einzigartige Möglichkeit für zeit- und raumbeschränkte Knock-out in NSCs. Die meisten Spinalmark NSCs sind in Kontakt mit dem zentralen Kanal und bilden die überwiegende Mehrheit der Zellen in Kontakt mit dem zentralen Kanal^16,17. Daher ermöglicht eine Injektion des CAS9-gRNA-Komplexes in den zentralen Kanal, gefolgt von Elektroporation, die Lieferung an Rückenmarks-NSCs in einem gewünschten Bereich zu einem bestimmten Zeitpunkt^4,18,19. Dieses Protokoll zeigt, wie dies geschieht, was zu einem stark durchdringenden Knock-out in den zielgerichteten Rückenmarks-NSCs führt. Anschließend werden anschließend Analysen durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Regeneration und das NSC-Verhalten zu untersuchen.

Protokoll

Alle Tierversuche müssen in Übereinstimmung mit den lokalen und nationalen Vorschriften über Tierversuche und mit Genehmigung des zuständigen institutionellen Überprüfungsausschusses durchgeführt werden.

1. Vorbereitung des CAS9-gRNA RNP-Mixes

1. Entwerfen und synthetisieren sie gRNAs.
   HINWEIS: Siehe andere Publikationen für das Entwerfen und Synthesisieren von gRNAs, einschließlich einer Publikation, die ausschließlich Axolotls^15,20,21,22betrifft.
2. Erhalten Sie CAS9-NLS-Protein, indem Sie es im eigenen Haus zubereiten oder kommerziell kaufen.
3. Bereiten Sie die CAS9-gRNA-Mischung vor, indem Sie 5 g CAS9-NLS-Protein, 4 gRNA, 0,9 l 10x CAS9-Puffer mischenund das Volumen mit nukleasefreiem H2 O auf 10 l auffüllen. Aliquot das Gemisch und bei -80 °C lagern, wenn es nicht sofort verwendet wird.

2. Herstellung von Agaroseplatten für die Elektroporation

1. Bereiten Sie 200 ml 2% (wt/vol) Agaroselösung in 1x DPBS vor. Lösen Sie die Lösung durch Erhitzen in einer Mikrowelle auf und gießen Sie sie auf 10 cm Petrischalen in eine Tiefe von ca. 10 mm (tief genug, um das ganze Tier zu bedecken).
2. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur erstarren. Platten bei 4 °C lagern, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
3. Schneiden Sie mit chirurgischen Skalpellen die Agaroseplatte, um einen Schlitz zum Halten des Schwanzes gerade zu machen, einen Brunnen für die Passform in den Körper des Tieres und zwei zusätzliche Brunnen für die Platzierung der Elektroden (Abbildung1E).
4. Legen Sie die Platte auf Eis und füllen Sie sie bis zum Rand mit eiskalten 1x DPBS. Verwenden Sie die gleiche DPBS-Lösung, um die Platten herzustellen, um eine konsistente elektrische Leitfähigkeit im Setup zu gewährleisten.

3. Konfiguration des Elektroporators

1. Konfigurieren Sie den Elektroporator. Richten Sie den Poring-Impuls so ein, dass er aus einem bipolaren Impuls von 70 V mit einer Dauer von 5 ms, einem Intervall von 50 ms und keinem Spannungsabfall besteht. Richten Sie den Übertragungsimpuls so ein, dass vier bipolare Impulse von 40 V mit einer Dauer von 50 ms, einem Intervall von 999 ms und 10 % Spannungsabfall aufweisen.
2. Schließen Sie die Elektroden an den Elektroporator an und stellen Sie die Pinzette auf 7 mm Abstand ein. Untertauchen Sie die Elektroden in einem Becher von DPBS vor und zwischen Elektroporation.

4. Vorbereiten und Beladen von Mikroinjektionsglaskapillaren

1. Führen Sie einen Rampentest an einem flammenden/braunen Mikropipette-Zieher gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um den Wärmewert zu bestimmen.
2. Ziehen Sie Injektionskapillaren mit verjüngten Enden mit den folgenden Parametern: Hitze = Rampentestwert, Ziehen = 100, Geschwindigkeit = 100, Zeit = 100.
3. Beobachten Sie die Nadel unter einem Stereomikroskop. Mit feinen Zangen, brechen Sie die Kapillare in einem Winkel, so dass es eine schräge Spitze hat. Brechen Sie an einer Stelle, wo es dünn genug ist, um den zentralen Kanal anzugreifen, während sie stark genug ist, um die Haut zu durchbohren.
   HINWEIS: Der Punkt, an dem der Durchmesser bei etwa 20 m oder etwa 50% des Rückenmarksdurchmessers liegt, ist ein guter Ausgangspunkt. Möglicherweise sind mehrere Versuche erforderlich, um eine optimale Bretung zu erzielen.
4. Fügen Sie die Fast Green FCF-Lösung im Verhältnis 1:30 in die RNP-Mischung ein und laden Sie mit einer Microloader-Pipettespitze ca. 5 l Injektionsmischung in die Kapillare.
5. Montieren Sie die Kapillare an der pneumatischen Pumpe, wobei die schräge Spitze nach unten zeigt.

5. Konfiguration der pneumatischen Pumpe

1. Konfigurieren Sie die pneumatische Pumpe. Stellen Sie den Haltepunkt auf 0,5 Pfund pro Quadratzoll (psi), ausgeworfen auf 2 psi-Halten und Die Dauer auf Gated.
2. Testen Sie die Kapillar- und pneumatischen Pumpeneinstellungen, indem Sie die Kapillare in einen Tropfen Wasser tauchen und das Fußpedal drücken, um es zu injizieren. Stellen Sie sicher, dass die Injektionsmischung in einem langsamen, aber stetigen Strom auskommt.
3. Stellen Sie den Haltedruck ein, wenn die Injektionsmischung spontan austreten oder Wasser die Kapillare aufsaugt. Erhöhen Sie den Auswurfdruck oder brechen Sie mehr von der Kapillare, wenn die Injektionsmischung zu langsam herauskommt. Verringern Sie den Auswurfdruck, wenn die Injektion zu schnell auskommt.

6. Injektion von RNP-Mix in das Rückenmark

1. Anästhetisieren Sie Axolotls in 0,03% Benzocain-Lösung für mindestens 10 min. Überprüfen Sie, ob die Tiere nicht ansprechbar sind, indem Sie sie im Wasser auf den Kopf stellen.
2. Nehmen Sie ein Tier mit Ringzange und legen Sie es auf ein Bett aus Silizium, mit der linken Seite des Tieres nach oben und der Schwanz nach rechts zeigen. Positionieren Sie die Injektionsstelle in der Mitte des Sichtfeldes des Stereomikroskops (Abbildung 1A).
3. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Kapillare bei 60° von der rechten Seite des Sichtfeldes hereinkommt (Abbildung 1B).
4. Identifizieren Sie das Rückenmark und den zentralkanal (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Das Rückenmark ist die röhrenförmige Struktur über dem Notochord.
5. Mit Blick auf den zentralen Kanal, bewegen Sie die Kapillare nach vorne, um sanft die Haut und Denk in den zentralen Kanal des Rückenmarks zu durchbohren. Beschränken Sie die Bewegung der Kapillare auf kleine Schritte, da sich das Rückenmark direkt unter den Schwanzmuskeln befindet.
6. Halten Sie das Fußpedal gedrückt, um die Mischung in den zentralen Kanal zu injizieren. Beobachten Sie, ob sich der RNP-Mix entlang des zentralen Kanals als blaue Linie in beide Richtungen ausbreitet, was zeigt, dass die Kapillare korrekt positioniert wurde (Abbildung 1D).
7. Wenn dies nicht der Fall ist, halten Sie das Fußpedal gedrückt, während Sie die Kapillare leicht ein- und ausbewegen, bis die RNP-Mischung ein- und ausgeht. Wenn die Kapillare durch Gewebe verstopft wird, löschen Sie sie, indem Sie bei höheren Drücken in Wasser ausstoßen.
8. Stellen Sie den Auswurfdruck so ein, dass er gerade ausreicht, um die RNP-Mischung im zentralen Kanal auszubreiten, aber nicht so sehr, dass sie die Struktur in die Luft sprengt.
9. Halten Sie das Fußpedal so gedrückt, dass sich die Injektionsmischung weiter entlang des zentralen Kanals ausbreitet, bis sie das Terminalvesikel am Ende des Rückenmarks und die Ventrikel im Gehirn erreicht.
   HINWEIS: Dies kann je nach Größe des Tieres bis zu 2 min dauern. Es kann notwendig sein, den Druck nach einiger Zeit zu erhöhen, um die RNP-Mischung in die Hirnkammern zu gelangen.
10. Nach erfolgreicher Injektion so schnell wie möglich mit der Elektroporation fortfahren.

7. Elektroporation

1. Das Tier mit Ringzangen auf die vorbereitete Agarose-Elektroporationsplatte (Abbildung 1E) auf Eis geben. Legen Sie den Schwanz in den Schlitz, so dass er von Agarose eingeklemmt wird (Abbildung 1F).
2. Legen Sie die Elektroden in die Brunnen auf beiden Seiten des Schwanzes. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Tier und die Elektroden mit eiskaltem PBS abgedeckt sind.
3. Drücken Sie den Fußschalter, um die Elektroporation zu starten.
4. Nachdem die Elektroporation abgeschlossen ist, geben Sie das Tier ins Wasser zurück.
5. Bei Bedarf weitere Tiere injizieren.
6. Überprüfen Sie, ob die elektropolierten Tiere nach dem Ableben der Anästhesie gesund sind und dass keine Schäden am Schwanz angerichtet werden.

8. Bewertung der Knock-out-Effizienz

1. Fixieren Sie den Schwanz des elektropolierten Tieres. Machen Sie Querschnitte des Schwanzes gefolgt von immunhistochemischen Färbung, um die Effizienz des Knock-out auf Proteinebene zu beurteilen.
   HINWEIS: Wenn nach der Elektroporation eine Schwanzamputation durchgeführt werden soll, könnte der abgeschnittene Schwanz zu diesem Zweck verwendet werden. Tiere, die mit gRNAs gegen Gfp oder Tyrosinase elektropoiert sind, können beispielsweise als Negativkontrolle verwendet werden⁴.
2. Alternativ könnte das elektroporated Rückenmark extrahiert und für DNA lysiert werden. Führen Sie genotypisierende PCR durch, gefolgt von Sanger-Sequenzierung oder Sequenzierung der nächsten Generation, um den Prozentsatz der bearbeiteten genetischen Loci¹⁵zu bewerten.
   HINWEIS: Die resultierende Bearbeitungseffizienz wird die tatsächliche Bearbeitungseffizienz für NSCs unterschätzen, da nicht-elektroporated Zellen und Neuronen enthalten sind, die keinen apikalen Kontakt zum zentralen Lumen haben und daher den RNP-Mix nicht erhalten.

Ergebnisse

Die Injektion und Elektroporation des CAS9-gRNA-Komplexes gegen Sox2 in den Axolotl-Rückenmarks-Zentralkanal führte zu einem massiven Verlust der SOX2-Immunreaktivität bei der Mehrheit der Spinalband-NSCs, wobei gRNA gegen Tyrosinase (Tyr) als Kontrolle fungierte (Abbildung 2 A). B3-Tubulin (mit TUJ1 gefärbt) ist ein Marker für Neuronen und wurde nicht in NSCs exprimiert, und SOX2- TUJ1-Zellen, die den zentralen Kanal umgeben, wurden als Zellen betrachtet, die ...

Diskussion

Das beschriebene Protokoll ermöglicht zeit- und raumbeschränkte Gen-Knock-out in den NSCs im Axolotl-Rückenmark. Das aktuelle Protokoll ermöglicht eine spezifische Ausrichtung von NSCs zu einem definierten Zeitpunkt und Ort mit hoher Penetranz. Es vermeidet mögliche unerwünschte Effekte, die durch Gen-Knock-out in NSCs in anderen Regionen wie dem Gehirn entstehen, die bei der Verwendung des Cre-LoxP-Systems auftreten. Es vermeidet auch Entwicklungseffekte, die von einem anhaltenden Knock-out ausgehen, so dass die U...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501-100G
Benzocaine 0.03 % (wt/vol)	Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Benzocaine 10 % (wt/vol)	Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.
Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.	Stutter Instrument	BF120-94-8
CaCl2·2H2O	Merck	102382
CAS9 buffer, 10x	Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months
CAS9-NLS protein	PNA Bio	CP03
Cell culture dishes, 10cm	Falcon	351029
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Scientific Instruments	11254-20
Electroporator	Nepa Gene	NEPA21
	BEX	Pulse Generator CUY21EDIT II
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5x	Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS.
Flaming/Brown Micropipette Puller	Stutter Instrument	P-97
Holtfreter’s solution 400% (wt/vol)	Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
KCl	Merck	104936
MgSO4·7H2O	Merck	105886
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MN-153
NaCl	Merck	106404
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV830
Ring Forceps	Fine Scientific Instruments	11103-09
Stereomicroscope	Olympus	SZX10
Tris base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-buffered saline, 10x	Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter	Nepa Gene	CUY650P10