Gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal Axolotl via eletroporação de complexos de proteína-gRNA CAS9

Resumo

É apresentado aqui um protocolo para executar a batida-para fora do gene tempo-e espaço-restrito em cordas espinais do Axolotl injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation.

Resumo

O Axolotl tem a habilidade original de regenerar inteiramente sua medula espinal. Isto é pela maior parte devido às pilhas ependymal permanecendo como pilhas de haste neural (NSCS) durante todo a vida, que proliferar para reformar o tubo ependymal e para diferenciar-se em neurônios perdidos após ferimento da medula espinal. Deciphering como estes NSCS mantêm o borne-desenvolvimento do pluripotência e proliferar em cima da lesão da medula espinal para reformar a estrutura exata do pre-ferimento pode fornecer a introspecção valiosa em como os cabos espinais mamíferos podem regenerar assim como opções potenciais do tratamento. Executar knock-outs do gene em subconjuntos específicos de NSCS dentro de um período de tempo restrito permitirá o estudo dos mecanismos moleculars atrás destes processos regenerativa, sem ser confundidos pelo desenvolvimento que perturbam efeitos. Descrito aqui é um método para realizar o knock-out do gene no NSCs da medula espinal de Axolotl usando o sistema de CRISPR-Cas9. Injetando o complexo de CAS9-gRNA no canal central da medula espinal seguido pelo Electroporation, os genes do alvo são nocauteados para fora em NSCs dentro das regiões específicas da medula espinal em um timepoint desejado, permitindo estudos moleculars de NSCs da medula espinal durante Regeneração.

Introdução

A medula espinal da maioria de vertebrados é incapaz de regenerar depois da lesão, conduzindo à inabilidade permanente. Várias salamandras, como o Axolotl, são exceções notáveis. O Axolotl pode regenerar inteiramente uma medula espinal estruturalmente idêntica e restaurar completamente a função da medula espinal. Grande parte da capacidade regenerativa da medula espinhal Axolotl é devida a células ependímicas. Estas células alinham o canal central, e ao contrário daquelas em mamíferos, as pilhas ependymal de Axolotl permanecem como pilhas de haste neural (NSCs) desenvolvimento borne-Embryonic. Após ferimento da medula espinal (por exemplo, de uma amputação da cauda), estes NSCS proliferar para Regrow o tubo ependymal e para diferenciar-se para substituir os neurônios perdidos^1,2,3. Descobrindo como Axolotl medula espinhal NSCs permanecem pluripotentes e tornam-se ativados após a lesão pode fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para pacientes humanos.

Devido aos avanços na técnica de knock-out do gene crispr-Cas9, a realização de knock-outs para decifrar a função gênica tornou-se mais fácil e demonstrou ter ampla aplicabilidade em várias espécies, incluindo axolotls^{4,5, 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 8}. a liberação recente do genoma completo do Axolotl e do transcriptoma agora permite que qualquer Locus genómico seja direcionado e para melhor avaliar os efeitos fora do alvo^{9,10,11,12 , 13} anos de ^{, 14}. protocolos otimizados foram desenvolvidos para knock-out e knock-in em axolotls usando o sistema Crispr-Cas9¹⁵. A entrega da maquinaria de crispr-CAS9 a forma do ribonucleoprotein de proteína-grna de CAS9 (RNP) foi mostrada para ser mais eficiente do que usando plasmídeos da codificação de CAS9 e de grna-⁴. Isto é provável devido ao RNP que é menor no tamanho do que vetores do plasmídeo, sua habilidade de criar rupturas do ADN imediatamente, e protegendo do gRNA da degradação do RNA. Além disso, o uso de RNPs ignora a transcrição e a tradução; assim, evita edições tais como a força do promotor e o uso óptimo do Codon quando os elementos do plasmídeo são derivados de uma espécie diferente.

Os estudos da perda--função são uma das aproximações gerais a investigar funções potenciais dos genes do interesse. A fim estudar a função do gene durante a regeneração, um knock-out deve idealmente ser executado apenas antes de um ferimento para evitar efeitos no desenvolvimento. Além disso, o knock-out deve ser restrito às NSCs e região de regeneração. Um knock-out do gene alvo em todos os NSCs (incluindo aqueles no cérebro, que é o caso em sistemas CRE-LoxP), pode produzir efeitos não relacionados com a regeneração que pode confundir a interpretação dos resultados. Felizmente, a estrutura da medula espinhal Axolotl fornece uma oportunidade única para o tempo e espaço restrito knock-out em NSCs. A maioria das NSCS da medula espinhal estão em contato com o canal central e constituem a grande maioria das células em contato com o canal central^16,17. Portanto, uma injeção do complexo CAS9-grna no canal central, seguida de eletroporação, permite a entrega às NSCS da medula espinhal em uma região desejada em um tempo específico^4,18,19. Este protocolo demonstra como isto é executado, conduzindo ao knock-out altamente penetrante nos NSCs alvejados da medula espinal. posteriormente, são realizadas análises subsequentes para estudar os efeitos sobre a regeneração e o comportamento do NSC.

Protocolo

Todos os experimentos com animais devem ser realizados de acordo com as regulamentações locais e nacionais sobre experimentação animal e com a aprovação do quadro de revisão institucional pertinente.

1. preparando a mistura de CAS9-gRNA RNP

1. Projetar e sintetizar gRNAs.
   Nota: refira outras publicações para projetar e sintetizar grnas, incluindo um exclusivamente a respeito dos axolotls^15,20,21,22.
2. Obtenha proteína CAS9-NLS preparando-se em casa ou comprando-a comercialmente.
3. Prepare a mistura de CAS9-gRNA misturando 5 μg de proteína de CAS9-NLS, 4 μg de gRNA, 0,9 μL de tampão de 10x CAS9, e encha acima o volume a 10 μL com H₂o. alíquota-livre de nuclease a mistura e armazene em-80 ° c se não for usado imediatamente.

2. preparando placas do agarose para o electroporation

1. Prepare 200 mL de solução de agarose a 2% (WT/vol) em 1x DPBS. Dissolva-se aquecendo a solução num microondas e despeje-a em 10 cm de placas de Petri até uma profundidade de cerca de 10 mm (suficientemente profunda para cobrir todo o animal).
2. Permita que as placas se solidificem à temperatura ambiente. Guarde as placas a 4 ° c se não forem utilizadas imediatamente.
3. Usando Bisturis cirúrgicos, corte a placa de agarose para fazer uma fenda para segurar a cauda reta, um poço para caber no corpo do animal, e dois poços extra para colocar os eletrodos (Figura 1e).
4. Coloque a placa no gelo e encha-a até a borda com gelo-frio 1x DPBS. Use a mesma solução de DPBS para fazer as placas para assegurar a condutibilidade elétrica consistente na instalação.

3. Configurando o electroporator

1. Configure o electroporator. Configurar o pulso poring para consistir de um pulso bipolar de 70 V, com uma duração de 5 ms, intervalo de 50 ms, e nenhuma deterioração da tensão. Configurar o pulso de transferência para ter quatro pulsos bipolares de 40 V, com uma duração de 50 ms, intervalo de 999 MS, e 10% de deterioração da tensão.
2. Conecte os eletrodos ao electroporator e ajuste a pinça para 7 mm de distância. Submergir os eletrodos em uma taça de DPBS antes e entre Electroporation.

4. preparando e carregando capilares de vidro da microinjecção

1. Realize um teste de rampa em um extrator de micropipeta flamejante/marrom de acordo com as instruções do fabricante para determinar o valor do calor.
2. Puxe capilares de injeção com extremidades cônicas usando os seguintes parâmetros: calor = valor do teste de rampa, puxar = 100, velocidade = 100, tempo = 100.
3. Observe a agulha um estereomicroscópio. Usando o fórceps fino, quebre o capilar em um ângulo de modo que tenha uma ponta inclinada. Quebre em uma posição onde é fino bastante para alvejar o canal central, ao ser forte bastante furar a pele.
   Nota: o ponto em que o diâmetro é de cerca de 20 μm ou cerca de 50% do diâmetro da medula espinhal é um bom ponto de partida. Várias tentativas podem ser necessárias para obter uma quebra ideal.
4. Adicione a solução Fast Green FCF à mistura RNP numa proporção de 1:30 e carregue cerca de 5 μL de mistura de injecção no capilar com uma ponteira de pipeta Microloader.
5. Monte o capilar na bomba pneumática, com a ponta inclinada voltada para baixo.

5. Configurando a bomba pneumática

1. Configurar a bomba pneumática. Ajuste a preensão a 0,5 libras por a polegada quadrada (libra por polegada quadrada), ejetar à preensão de 2 libras por polegada quadrada, e a duração ao gated.
2. Teste os ajustes capilares e pneumáticos da bomba mergulhando o capilar em uma gota da água e pressionando o pedal do pé para injetar. Certifique-se de que a mistura de injeção sai em um fluxo lento, mas constante.
3. Ajuste a pressão de preensão se o começo da mistura da injeção que escapa para fora espontâneamente ou a água sugam acima o capilar. Aumente a pressão de ejeção ou quebre mais do capilar se a mistura da injeção está saindo demasiado lenta. Diminua a pressão de ejeção se a injecção estiver a sair demasiado depressa.

6. injetar RNP misturar na medula espinhal

1. Anestesiar axolotls em 0, 3% de solução de benzocaína por pelo menos 10 min. Verifique se os animais não são responsivos lançando-os de cabeça para baixo na água.
2. Pegar um animal com fórceps anel e colocá-lo em uma cama de silício, com o lado esquerdo do animal virado para cima ea cauda apontando para a direita. Posicione o local de injeção no meio do campo de visão do estereomicroscópio (Figura 1a).
3. Ajuste o micromanipulador para que o capilar esteja chegando a 60 ° do lado direito do campo de visão (Figura 1B).
4. Identifique a medula espinhal e o canal central (Figura 1C).
   Nota: a medula espinhal é a estrutura tubular acima do Notochord.
5. Visando o canal central, mova o capilar para a frente para perfurar suavemente a pele e o músculo no canal central da medula espinhal. Limitar o movimento do capilar para pequenos passos, como a medula espinhal está bem abaixo dos músculos da cauda.
6. Pressione e segure o pedal do pé para injetar a mistura no canal central. Observe se a mistura RNP se espalha ao longo do canal central como uma linha azul em ambas as direções, o que mostra que o capilar foi posicionado corretamente (Figura 1D).
7. Se isso não ocorrer, mantenha o pedal pressionado enquanto move o capilar levemente para dentro e para fora até que a mistura RNP comece a entrar. Se o capilar ficar entupido por tecido, limpe-o ejectando-o em água a pressões mais elevadas.
8. Ajuste a pressão de ejeção de modo que seja apenas bastante para fazer com que a mistura de RNP espalhe no canal central, mas não tanto que funde acima a estrutura.
9. Continue a segurar o pedal do pé assim que a mistura da injeção se espalha mais ao longo do canal central, até que alcangue o vesícula terminal na extremidade da medula espinal e dos ventrículos no cérebro.
   Nota: isto pode demorar até 2 min, dependendo do tamanho do animal. Pode ser necessário aumentar a pressão após algum tempo para causar a mistura de RNP para entrar nos ventrículos cerebrais.
10. Proceder o mais rapidamente possível ao Electroporation após a injeção bem sucedida.

7. electroporação

1. Transfira o animal com o fórceps do anel na placa preparada do Electroporation do agarose (Figura 1E) no gelo. Coloque a cauda dentro da fenda por isso é colada por agarose (Figura 1F).
2. Coloque os eletrodos nos poços de ambos os lados da cauda. Assegure-se de que o animal e os eléctrodos inteiros estejam cobertos por PBS gelado.
3. Pressione o interruptor do pé para começar o electroporation.
4. Depois que o electroporation é completo, retorne o animal à água.
5. Proceder para injetar mais animais, se necessário.
6. Verifique se os animais electroporados são saudáveis após a anestesia desaparece e que não há nenhum dano causado à cauda.

8. avaliando a eficiência de knock-out

1. Fixar a cauda do animal em. Faça secções transversais da cauda seguidas de coloração imuno-histoquímica para avaliar a eficiência do knock-out no nível da proteína.
   Nota: se uma amputação da cauda deve ser executada após o electroporation, a cauda cortada poderia ser usada para esta finalidade. Animais eletroporados com gRNAs contra GFP ou tirosinase, por exemplo, podem ser usados como um controle negativo⁴.
2. Alternativamente, a medula espinal em podia ser extraída e lysed para o ADN. Realize a PCR genotipagem seguida de sequenciamento de Sanger ou sequenciamento de próxima geração para avaliar a porcentagem de loci genético editado¹⁵.
   Nota: a eficiência de edição resultante irá subestimar a eficiência de edição real para as NSCs, devido à inclusão de células não eletroporadas e neurônios que não têm contato apical com o lúmen central e, portanto, não receberão a mistura de RNP.

Resultados

A injeção e o electroporation do complexo de CAS9-gRNA de encontro a Sox2 no canal central da medula espinal do Axolotl conduziram a uma perda maciça de immunoreactivity Sox2 em uma maioria de NSCS da medula espinal, com o grna de encontro ao tyrosinase (Tyr) como um controle (Figura 2 A). B3-tubulin (manchado com TUJ1) é um marcador para neurônios e não foi expressa em NSCS, e SOX2-TUJ1-células que cercam o canal central foram consideradas células abrigando...

Discussão

O protocolo descrito permite que o tempo e o espaço restringidos o gene knock-out nos NSCs na medula espinal do Axolotl. O protocolo atual permite direcionamento específico de NSCs em um tempo definido e local com alta penetrância. Evita potenciais efeitos indesejáveis originários de nocaute genético em NSCs em outras regiões, como o cérebro que ocorrem ao usar o sistema CRE-LoxP. Também evita efeitos de desenvolvimento originados de um knock-out persistente, permitindo o estudo da função gênica focada na reg...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501-100G
Benzocaine 0.03 % (wt/vol)	Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Benzocaine 10 % (wt/vol)	Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.
Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.	Stutter Instrument	BF120-94-8
CaCl2·2H2O	Merck	102382
CAS9 buffer, 10x	Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months
CAS9-NLS protein	PNA Bio	CP03
Cell culture dishes, 10cm	Falcon	351029
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Scientific Instruments	11254-20
Electroporator	Nepa Gene	NEPA21
	BEX	Pulse Generator CUY21EDIT II
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5x	Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS.
Flaming/Brown Micropipette Puller	Stutter Instrument	P-97
Holtfreter’s solution 400% (wt/vol)	Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
KCl	Merck	104936
MgSO4·7H2O	Merck	105886
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MN-153
NaCl	Merck	106404
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV830
Ring Forceps	Fine Scientific Instruments	11103-09
Stereomicroscope	Olympus	SZX10
Tris base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-buffered saline, 10x	Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter	Nepa Gene	CUY650P10