JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada insanlaşmış farelerde HIV enfeksiyonu dinamikleri incelenmesi için üç deneysel yaklaşımlar açıklanmıştır. İlk ivedi kronik enfeksiyon olaylarının incelenmesine izin vererken, ikincisi primer enfeksiyon veya viral reaktivasyon sonrası akut olayların incelenmesine izin verir.

Özet

Humanized NOD/SCID/IL-2 reseptör γ-chainnull fareler bulaşıcı hastalıklar üzerinde temel ve klinik öncesi araştırmalarda yararlanılabilir insan bağışıklığı, bazı özellikleri recapitulate. Burada açıklanan HIV enfeksiyonu dinamikleri incelemek için insanlaşmış immüneksik farelerin üç modeli vardır. Bunlardan ilki, yeni doğan farelerde CD34+ hematopoetik kök hücrelerin intrahepatik enjeksiyonuna dayanır, bu da birkaç kan ve lenfoid doku ile sınırlı hücrelerin yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar ve bunu referans HIV türü ile enfeksiyon takip eder. Bu model enfeksiyon sonrası 36 haftaya kadar izlenmesine olanak sağlar ve bu nedenle kronik model olarak adlandırılır. İkinci ve üçüncü modeller, periferik kan mononükleer hücrelerinin erişkin farelere intraperitoneal enjekte edildiği akut ve reaktivasyon modelleri olarak adlandırılır. Akut modelde, sağlıklı bir donörden hücreler intraperitoneal yol ile engrafted, bir referans HIV suşu ile enfeksiyon takip. Son olarak, reaktivasyon modelinde, antiretroviral tedavi altında HIV ile enfekte donör hücreleri intraperitoneal rota ile engrafted. Bu durumda, fare bir ilaç içermeyen ortam virüs reaktivasyonu ve viral yük artışı sağlar. Burada sağlanan protokoller HIV enfeksiyonu insanlaşmış, immüneksik fare modelleri için geleneksel deneysel yaklaşım açıklar.

Giriş

Humanized NOD / SCID / interlökin (IL)-2 reseptör γ-chainnull (bundan böyle huNS γ-chainnullolarak anılacaktır) fare modeli yaygın enfeksiyonların patogenezi incelemek için kullanılmıştır, otoimmünite, ve kanser, yanı sıra ilaçların ve insan hücre tabanlı tedavilerin pre-klinik çalışmalar için1,2. Bu fareler, il-2 reseptör γ-chain locus (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 ve IL-21 için ortak γ-chain) scid mutasyon ve hedeflenen mutasyon ile, obez olmayan bir diyabetik (NOD) arka plan dayanmaktadır, hangi fare T-, B-ve doğal katil gelişiminde ciddi bir bozulmaya neden (NK) hücreleri1. Böylece, insan dokusunun engraftment destek, insan CD34+ hematopoetik kök hücreler (HSCs), ve insan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs)3,4,5. Buna ek olarak, kök hücre faktörü (SCF), granülosit/ makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve IL-3 gibi insan hematopoetik faktörlerin transgenik ekspresyonu6,7,8.

HIV çalışmaları için, fare suş farklı birkaç huNS γ-zincirnull fare modelleri, tanımlanmıştır, kullanılan insan hücrelerinin türü, engraftment için dokuların türü, ve hücrelerin kökeni (yani, sağlıklı vs. HIV bulaşmış donör)9,10. Orijinal suşu, ancak, yaygın bir referans HIV suş11,12,13ile enfeksiyon aşağıdaki insan hücrelerinin engraftment ve viral çoğaltma yüksek düzeyde nedeniyle kullanılır. İnsan hematopoetik faktörlerinin transgenik ekspresyonu ile benzer immünoyfik fare suşları (örn. NOG-EXL veya NSG-SGM3) veya insan karaciğeri ve timus dokularının implantları ile (kemik iliği-karaciğer-timus [BLT] fareler) anti-HIV bağışıklık yanıtı miyeloid popülasyonların rolünü değerlendirmek için yararlıdır, bu dokular üzerinde HIV etkileri, ve viral rezervuarlar olarak katılım14,15. Ayrıca, insan lökosit antijen (HLA) moleküllerinin transgenik ekspresyonu ile bazı suşları, yanı sıra BLT fareler, HIV enfeksiyonu16,17T-hücre yanıtı çalışması için kullanılabilir.

Genel olarak, bu farelerde, insanlaşma hücresel kökenli bağlıdır, doğum güzergahı (intraperitoneal, intrahepatik, intravenöz, intrakardiyak) ve engraftment anda fare yaşı18,19,20. Hücre kökeni ile ilgili olarak, insan CD34+ HSC kordon kanı, fetal karaciğer, ya da seferber periferik kan elde edilen yenidoğan veya gençfarelerdeenjekte edilebilir 3,21. Buna ek olarak, yetişkin γ-zincirnull fareler PBMC enjeksiyonu ile insancıl olabilir (burada, hu-PBL-NS γ-zincirnull fareler olarak anılacaktır), kanda bu hücrelerin zamansal dolaşımını sağlayan, ikincil lenfoid organlar, ve iltihaplı dokular22,23,24.

Burada açıklanan HIV enfeksiyonu çalışması için huNS γ-chainnull fare modelleri kurulması için ayrıntılı bir protokoldür. Bunlardan ilki, sağlıklı bir donörden kordon kanından elde edilen insan CD34+ HSC'lerinin yeni doğan farelere enjekte edildiği, ardından 14 haftalık insan bağışıklık sisteminin yeniden yapılandırılmasından sonra referans HIV türü ile enfeksiyon kapıldığı kronik modeldir. Bu model, farelerin enfeksiyondan sonra ~36 haftaya kadar izlenmesini sağlar. İkinci model akut bir modeldir, hangi PBMCs sağlıklı bir donör elde yetişkin NS γ-chainnull fareler enjekte edilir, fare insan T-hücre genişleme 3 hafta sonra bir referans HIV suşu ile enfeksiyon takip. Son olarak, üçüncü model reaktivasyon modeli, hangi PBMCs baskılayıcı antiretroviral tedavi altında HIV enfekte donör türetilen (ART) yetişkin NS γ-chainnull fareler enjekte edilir. Bu durumda, ilaçsız bir ortam viral reaktivasyon ve viral yük artışı sağlar. İki ikinci model engraftment sonra ~ 9 hafta ya kadar izleme sağlar.

Genel olarak, bu üç model virolojik çalışmalar, yeni ilaçların klinik öncesi çalışmalar ve küresel bağışıklık yanıtı hiv enfeksiyonu etkilerinin değerlendirilmesi için yararlıdır. Ayrıca, HIV'li insanlaşmış farelerin kullanımının herhangi bir deneyden önce Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmesi ve onaylanması gerektiğini de göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu, çalışmanın tehlikeli biyolojik maddelerin kullanımı ve deneysel hayvanların insancıl kullanımı için tüm iç ve dış kurumsal düzenlemeleri takip etmesini sağlar.

Protokol

Bu çalışmada, Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokollere göre tüm hayvan bakımı ve prosedürleri gerçekleştirilmiştir (protokol numaraları 1018017, 1018018 ve 0318009).

1. İnsan CD34+ HSC yenidoğan farelerin engraftment

  1. Steril önlükler, eldivenler, özel ayakkabılar, ayakkabı kılıfları, maske, gözlük, saç/sakal kaputu ve steril laboratuvar önlükleri dahil olmak üzere her zaman tek kullanımlık kişisel koruma ekipmanı (PPE) kullanın.
  2. 1x 106 dondurulmuş CD34+ HSC'yi (malzeme tablosunabakınız) 10 mL RPMI 1640 ortam %10 FBS'yi sertifikalı bir biyogüvenlik kabini altında yeniden askıya alın ve steril koşulları koruyun.
  3. Bir hemositometrede trypan mavisi dışlama boyama ile hücre canlılığını kontrol etmek için (beklenen sayıda hücrenin varlığını sağlamak için) 10 μL süspansiyon kullanın.
  4. Oda sıcaklığında (RT) 15 dakika 400 x g santrifüj. Supernatant atın ve soğuk 1x PBS resuspend gerekli konsantrasyon (1.4 x 105 CD34+ HSCs 50 μL). İğne yenene kadar hücreleri buzda tutun.
  5. Yavruları (1-4 günlük her iki cinsiyetten ns γ-chainnull yavruları) steril 100 mm2 Petri kabına ve yetiştirici kafesinden az miktarda yatak malzemesine yerleştirin. Ayrıca, alıcı yavrular üzerinde herhangi bir yabancı kokuları daha fazla maskelemek için eller arasında temiz yatak ovmak.
    NOT: Bu durum, yavrulara emprenye edilen yabancı kokuları en aza indirir ve böylece annelerin doğumdan sonra yavrularını kafeslere geri kabul etme şansını artırır.
  6. Petri kabını temiz bir taşıma kafesine koyun ve yavruları çevreden korumak için kafesi temiz bir fare mikroizolatör kafesine yerleştirin. Işınlama odasına geçerken hayvanların dış ışığa maruz kalmasını önlemek için taşıma kafesini bir kapak pedi ile kapatın.
  7. 137 Cs kaynağına maruz kalarak 100 cGy tüm vücut ışınlaması (WBI) ile yavruları ışınla. Işınlayıcının içini dezenfektan solüsyonuyla temizleyin, fareleri ışınlayıcıya yerleştirin ve tüm yavruların homojen bir şekilde ışınlanması için pikap'ı açın. Işınlama işlemini başlatmak için ışınlayıcıyı kapatın ve güç düğmesine basın. Işınlama süresi tamamlanana kadar bekleyin ve hemen fareleri çıkarın.
    NOT: Işınlama farelerde stres oluşturmadığından, önceki anestezi gerekli değildir.
  8. 2-4 saat ışınlama işleminden sonra, soğuk steril Petri çanak buz üzerinde steril gazlı bez ile kaplı bir biyogüvenlik kabine yavrusu yerleştirin, anestezi kadar (~ 5-10 dk). Brüt hareketler sona erdiğinde yeterli anestezi sağlanır.
  9. Şırıngayı, hücre süspansiyonunun 50 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 0000 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000
  10. Hepatik enjeksiyon yoluyla engraftment için, başparmak ve işaret parmakları ile yavru dizginlemek. Fare kısıtlamasını en aza indirmek için (~30-45 s), bir araştırmacının yavruyu tutmasına ve enjeksiyonu yönetmesine izin verin ve ikinci araştırmacının şırıngayı HSC süspansiyonuyla yüklemesini bekleyin. Enjeksiyon bölgesini %70 alkolle temizleyin ve 50°L'lik hücreleri doğrudan karaciğere ulaştırın. Tamamen karaciğer piercing önlemek için enjekte ederken sığ bir iğne açısı kullanın. Kontrol olarak, farelere karaciğere 50 μL 1x PBS enjekte edin.
  11. Kurtarma sağlamak için 1-5 dakika steril gazlı bez ile kaplı önceden ısıtılmış steril Petri çanak üzerinde yavru yerleştirin. Yavruların aşırı ısınmamasını sağlamak için 20 °C'de kemirgenler için kızılötesi ısıtma yastığı kullanarak yemeği önceden ısıtın.
  12. Yavruları ebeveynlerine geri vermeden hemen önce, yamyamlık tan kaçınmak veya yavruları reddetmek için başparmak ve işaret parmaklarını kullanarak küçük miktarda mentol ve okaliptüs bazlı merhem uygulayın.
  13. Kuru cilt, beslenme, döküntü ve alopesi gibi yavrularda greft-versus-host hastalığı (GVHD) herhangi bir belirti arıyor, her gün kafesleri kontrol edin. Bu belirtilerden herhangi biri görülürse hayvanları ötenazi.
  14. 3 haftalık wean fareleri cinsiyetlerine göre gruplatmalı. Kafes başına 5'ten fazla hayvan koymayın. 14 haftalıkken kan sitometrisi ile periferik kanda engreftlemayı doğrulayın.
    NOT: Engraftment başarı oranı% 80-100 arasındadır.

2. Juvenil farelerin Insan PBMC engraftment

  1. Akut ve reaktivasyon modelleri için, 6-8 haftalık NS γ-chainnull fareleri, sırasıyla ART altında bulunan sağlıklı bir donör veya HIV enfekte olan hastadan elde edilen insan PBMC'leri ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Her iki modelde de, kontrol olarak HIV enfeksiyonu (sham) olmayan sağlıklı bir donörden PBMC enjekte fareler içerir.
  2. 50 mL konik tüp içine steril yoğunluk gradyan ortamda 5 mL tam kan Tabakası 15 mL.
  3. 400 x g'da 30 dakika boyunca RT'de frensiz, buffy paltonun yoğunluk gradyan ortamıyla karışmasını önleyin.
  4. Mononükleer hücrelerin fraksiyonunu dikkatlice toplayın (yoğunluk gradyan orta ve süpernatant arasında) ve buffy kat 10 mL 1x PBS içeren 15 mL santrifüj tüp aktarın. RT'de 10 dk için 300 x g'da santrifüj.
  5. Supernatant atın ve peletli hücrelere eklenen ACK tampon 5 mL ile lysing tarafından kalan kırmızı kan hücrelerini çıkarın. RT'de 4 dakika kuluçka.
  6. RT'de 10 dk için 300 x g'de santrifüj. 1x PBS veya RPMI 1640 orta 10 mL'de süpernatant'ı atın ve yeniden askıya alın.
  7. Hücreleri saymak ve hemositometrede mavi dışlama boyama ile canlılığı kontrol etmek için hücre süspansiyonunun 10 μL'sini kullanın. Tipik olarak, 1-2 x 106 hücre kan her 1 mL için elde edilir, fazla 95% canlılık ile.
  8. RT'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj atın ve hücre numarasını istenilen konsantrasyona ayarlayın (bu durumda, 200 μL 1x PBS'de 3,5 x 106 hücre).
  9. Şırıngayı, sertifikalı bir biyogüvenlik kabini altında 200 μL 1x PBS'de 3,5 x 106 pbmc'ye bağlı bir iğneyle (28 G, 0,5") yükleyin.
  10. Fareyi kafesten çıkarın ve arka arkaya hafif çekiş uygulayarak kafesi tutabilmesi için kuyruğundan tutun. Daha sonra, boynun gevşek deri kapma ve sırtını stabilize etmek için orta parmak kullanarak, hayvanın omuzlarında indeks ve başparmak parmakları yerleştirin.
  11. Fare başını geriye doğru kaydırın, böylece sırtı başının üzerindedir. Bu karın boşluğunda vissera geriye doğru yerinden olmasını sağlar ve enjeksiyon sırasında iç organları delme riskini azaltır.
  12. Enjeksiyon bölgesini %70 alkolle temizleyin.
  13. Adım 2.9'da kullanılan şırıngaya karın duvarından nüfuz edin ve hücrelere enjekte etmeden önce aspire edin, eğer herhangi bir madde aspire edilirse, şırıngayı çıkarın ve atın. Aksi takdirde, intraperitoneal kavite yavaş yavaş hücreleri enjekte, şırınga çıkarın ve atın. Fareleri kontrol etmek için 1x PBS enjekte edin.
  14. Hayvanı kafesine geri getir.
  15. Enjeksiyon dan sonra 3 hafta da akış sitometrisi ile periferik kanda engreftment doğrulayın.

3. Engraftment sonrası bakım

  1. Fareleri kulak etiketleme ile tanımlayın.
  2. Bu deneylerde kullanılan fareleri klinik sıkıntı belirtileri için her işlemden sonra günde 2 x yakından gözlemleyin.
  3. İnsan hücrelerinin naklinden sonra, GVHD için fareleri izleyin. Yenidoğan, çocuk ve erişkin farelerde GVHD semptomlarını izlemek için, vücut ağırlığı ölçümüne ek olarak, hayvanları deri hastalığının (yani renk, kuruluk, döküntü, alopesi) görünümü ne olursa olsun değerlendirin. Erken ötenazi yi göz önünde bulundurarak bir veteriner tarafından bu belirtileri gösteren hayvanları değerlendirin.

4. HIV enfeksiyonu prosedürü ve sahte enfeksiyon prosedürü

NOT: Kronik ve akut modellerde farelere sırasıyla 14. HIV enjeksiyonları alt karın kadranda intraperitoneally uygulanır.

  1. ABSL2 prosedürlerini takiben BSL2 dolaplarında 28 G 0.5" iğne kullanarak virüsün/PBS'nin şırıngalara yükleme işlemini gerçekleştirin. Enjekte edilen toplam virüs miktarı 15.000 ortanca doku kültürü enfeksiyöz dozudur (TCID50) 200 μL steril RPMI 1640'tadır.
  2. Fareyi kafesten çıkarın ve arka arkaya hafif çekiş uygulayarak kafesi tutabilmesi için kuyruğundan tutun. Daha sonra, işaret parmağı ve başparmak hayvanın omuzlarında yerleştirin, boyun gevşek deri kapma ve geri stabilize etmek için orta parmak kullanarak.
  3. Fare başını geriye doğru kaydırın, böylece sırtı başının üstünde olacak şekilde. Bu karın boşluğunda vissera geriye doğru yerinden sağlar ve enjeksiyon sırasında iç organları delinme riskini azaltır.
  4. Fareleri karın alt sol/sağ kadranında önceden ıslak bir alkol yastığı yla temizleyin. 200 μL steril RPMI 1640'ta bulunan HIV BaL virüsünün 15.000 TCID 50'sini enjekte edin.
  5. Enjeksiyondan sonra fareyi kafesine geri getirin.

5. Retroorbital delinme ile kan toplanması

NOT: Retroorbital kanama kan hızlı toplanması için izin verir, böylece genel toplama süresini azaltarak ve insan lenfosit belirteçleri istikrarını artırarak. Farelerkan toplamak için EDTA tüpleri kullanın.

  1. Kronik modelde, 14 hafta sonrası HSC enjeksiyonu, retroorbital ven yoluyla kan toplamak. Akut ve reaktivasyon modellerinde pbmc enjeksiyonu sonrası 3 hafta bu işlemi gerçekleştirin.
  2. Dıştan kanalize bir biyogüvenlik başlık sınıf B2 kan toplama dan önce isofluran inhalasyon 250 μL kullanarak hayvanları anestezik.
  3. Isoflurane'yi, binanın dışında havalandırmalı bir biyogüvenlik kabininde 1 L'lik berrak bir kavanozda bir tel örgü altında pamuk pedlere dağıtın. Mesh kullanımı hayvanların isoflurane-ıslatılmış ped temas değil sağlar, hangi isoflurane de deri yoluyla emilir beri cilt tahrişi ve potansiyel aşırı dosing neden olabilir. Ayrıca, bacaklar yaralanmaları önlemek için mesh ve hayvan arasında yumuşak bir kağıt havlu koyun.
  4. Kavanoz isoflurane ile doyuncaya (ekledikten yaklaşık 1 dk sonra), hayvanı tanıtın ve solunum hızını gözlemleyin, bu da daha sonra azalacak. Bir düzeltme refleks eksikliği içeren anestezi derin bir düzlem, klinik endikasyonu kontrol edin (yavaşça kavanoz devrilme üzerine) ve brüt hareketlerin eksikliği. Hayvan tamamen rahat ve ayak ucur refleks yoksun en kısa sürede kanama prosedürü başlatın.
    NOT: Isofluran buharlaştığıiçin anestezi bulgusu yoksa daha fazla ilaç dağıtın.
  5. Retroorbital kanama için, fare dış juguler ven kaudal başparmak ile mandibula basın ve aynı el ile, yavaşça işaret parmağı ile üst göz kapağı nı yükseltmek.
  6. Gözün medial kanthus içine bir hematokrit tüp yerleştirin ve kan akı başlayana kadar ventrolateral yönde yönlendirin.
  7. En az 100 μL kan toplayın. İstenilen kan hacmi elde edildikten sonra (hayvanın vücut ağırlığının %1'inden fazla olmayan bir hacim), dış juguler basıncı durdurun ve hematokrit tüpünü çıkarın.
  8. Hemostazın en az 30 s steril gazlı bez kullanarak göze doğrudan basınç uygulayarak tamamlandığından emin olun.
  9. Göze tetrakain damlaları uygulayın. Anesteziden tamamen iyileşene kadar hayvanı izleyin ve kafese geri yerleştirin.
    NOT: Toplanan kanın 100 μL'si insan CD45+ ve diğer kan hücresi popülasyonlarının engreftasyon düzeyinin değerlendirilmesi ve plazma viral yükünün değerlendirilmesi için kullanılır.

6. Engreftment düzeyi ve akış sitometri analizinin taranması

  1. Tam kan için geleneksel bir akış sitometri boyama protokolü izleyin, hangi florokrom etiketli anti-insan antikorların kuluçka içerir (önerilen akış paneli için, Malzemeler Tablosubakınız ), kırmızı kan hücrelerinin lysis takip ve yıkama adımları13,15.
    NOT: Engraftment düzeyinin taranması için, bir anti-insan CD45 antikor içerir. Karşılaştırma için, bir anti-fare CD45 antikor da kullanılabilir. Reaktiflerin çapraz reaktivitesini test etmek için telafi kontrollerinin yanı sıra aynı antikor karışımı, lekesiz fare ve insan kanı örnekleri ve insansız kontrol ile boyanmış bir insan kanı örneği de dahil. Boyama sonra, her zaman bazı arka plan sinyali vardır; ancak, tüm olumlu sinyaller açıkça negatif ve çapraz reaktif kontrollerden ayırt edilir.
  2. Uygun bir akış sitometresinde, lenfosit kapısında en az 10.000 olay elde edin (FSC-A vs. SSC-A). Akış sitometrisi analizi için, yinelenen dışlama dan sonra, insan CD45+ hücrelerinin yanı sıra ilgi diğer hücre popülasyonlarının yüzdesini belirleyin.

7. Plazma viral yükünün değerlendirilmesi

  1. Hiv enfekte hayvanlarda viral yük değerlendirmek 1x enfeksiyon dan sonra haftada.
  2. Retroorbital kanamadan sonra (yaklaşık 100 μL), antikoagüle kanın 3.500 x g'de mikrosentrifuge 3 dk'da santrifüjden sonra süpernatantı toplayarak plazma elde edin. Pelet kan hücresi fenotipleme için kullanılır.
  3. 40 μL plazmadan RNA elde etmek için ticari bir viral RNA ekstraksiyon kiti (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
  4. RNA'yı ilk gerinim sentezi karışımını (Bkz. Malzeme Tablosu)ve HIV gag astarı SK431 kullanarak cDNA'ya dönüştürün.
  5. Önceki çalışmalarda açıklandığı gibi HIV Gag astarSK 38/SK39 ve floresan yeşil boyalar (örneğin, SYBR yeşil) kullanarak kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin13,25.

8. Antiretroviral tedavinin uygulanması

  1. Kronik, akut ve reaktivasyon modellerinde, yüksek viral yük gözlendiğinde, enfeksiyondan en az 3 hafta sonra oral ART uygulayın.
  2. Tenofovir disoproksil fumarate (TDF), emtricitabine (FTC) ve raltegravir (RAL) dozlarını, insanlar ve fareler için 37 ve 3 km değerlerine göre hesaplayın, sırasıyla26. Tipik olarak, TDF, FTC ve RAL'nin insana eşdeğer dozları sırasıyla 61.7 mg/kg/gün, 40.7 mg/kg/gün ve 164 mg/kg/gün'tür.
  3. İçme suyunda uygulama için, ilaç tabletleri ezmek ve kafesher fare günlük doz elde sağlanması, su şişesine ilgili miktarda ekleyin. İlaç tozu şişede tortu oluşturabileceğinden, homojen süspansiyon elde etmek için su şişesini periyodik olarak sallayın.
  4. Taze çözünmüş ilaçlar ile her hafta su şişesini değiştirin.
  5. Viral yük ve CD4:CD8 oranındaki değişiklikleri değerlendirmek için ART inisiyasyonundan sonra her hafta veya 2 haftada bir retroorbital ven yoluyla kan toplayın.

9. Fare ötenazisi, sekonder lenfoid organların toplanması ve mononükleer hücrelerin izolasyonu

  1. Ötenazi üç insanlaşmış fare modelinde, periyodik olarak enfeksiyon süresi boyunca veya deneyin sonunda yapılır.
  2. Yetişkin farelerin ötanazisini CO2 boğulması ile gerçekleştirin, ardından servikal çıkığı. Boğulma için önceden şarjlı olmayan bir oda kullanın, sabit basınç regülatörlü ticari bir silindirden CO2 dağıtın ve 2013 AVMA yönergelerine uymak için oda hacminin /dakikanın %20-30'u içinde gaz akışını kontrol eden çizgi kısıtlayıcı.
  3. >60 s izleme solunum durması için CO2 akışını koruyun (5 dakika kadar sürebilir), ötanazi sağlamak için servikal dislokasyon takip.
  4. Ötenazi neonates <7 gün fiziksel bir yöntemle eski (yani, keskin makas kullanarak).
  5. Aksiller, mediastinal ve mezenterik lenf düğümlerini (tipik olarak gözlenen) görselleştirin ve cımbız ve keskin makasile ayıklayın. Ayrıca, periton boşluğunun sol üst tarafında bulunan dalak ayıklayın.
  6. Lenfoid dokuları steril RPMI 1640 orta içeren 1,5 mL santrifüj tüplerinde tevdi edin.
  7. Lenfoid dokuları hemen 70 mm'lik gözenek büyüklüğünde bir naylon hücresüzde işleyebilir ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Dokuları aspire etmeyin.
  8. Hücreleri filtreleyi kolaylaştırmak için hücreleri %1 FBS ile takviye edilmiş 5 mL RPMI 1640 orta ile yıkayın.
  9. Doku ayrıştırma sonra, bir mikrosantrifüj 10 dakika için 3.500 x g hücreleri süspansiyon santrifüj.
  10. Supernatant atın ve 1x PBS 500 μL ile hücreleri yeniden askıya.
  11. Hücreleri süspansiyonu 500 μL steril yoğunluk gradyan ortam içeren 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  12. 3 dk'da 3500 x g'lık santrifüj, frensiz, buffy paltosunun yoğunluk gradyan orta sıyla karışmasını önlemek için
  13. Mononükleer hücrelerin fraksiyonunu dikkatlice toplayın (yoğunluk gradyan orta ve süpernatant arasında) ve buffy katını 500 μL 1x PBS içeren 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın. 3 dk için 3000 x g santrifüj.
  14. Kalan kırmızı kan hücrelerini 500 μL ACK tamponu ile lysing, RT 4 dakika kuluçka ile çıkarın.
  15. 3 dk. 3 dk. için 3.000 x g santrifüj supernatant atın ve 1 mL 1x PBS veya orta resuspend.

Sonuçlar

Yukarıda açıklandığı gibi, 14 hafta post-HSC enjeksiyon (kronik model) veya 3 hafta post-PBMC enjeksiyon (akut ve reaktivasyon modelleri), fareler akış sitometri ile insan hücrelerinin engraftment düzeyini taramalar için kanayan vardır. 1) insan CD45+ hücrelerin yeniden yapılandırılması ve 2) CD4+ ve CD8+ T-hücrelerinin yüzdesi için temsili bir gating stratejisi Şekil 1A'dagösterilmiştir. Tipik olarak, engraftment düze...

Tartışmalar

İnsanlaşma için immünoeksik fare suşlarının geliştirilmesinde önemli ilerlemeler sağlanmıştır, araştırma ilgi1göre kullanılabilecek farklı seçenekler bir dizi ile. Burada ns γ-zincirnull fareler ve genetik olarak benzer suşları HIV enfeksiyonu eğitimi için üç farklı modelde istihdam edilecek insanlaşma için genel bir protokol sağlanan. İlk deneysel yaklaşımda, ışınlanmış yenidoğan fareler insan CD34ile enjekte edilir + HSCs, hangi kordon...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma JCZ Için IHV klinik bölümü iç fonlar tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3745.S.X
10 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0010
15 ml conical tubesStellar scientificT15-600
25 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0025
5 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0005
50 ml conical tubesStellar scientificT50-600
ACK lysis bufferQuality biological118-156-101
Alcohol prep padsFisher scientific06-669-62Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1Biolegend300439APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4Biolegend317420AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1Biolegend368522BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
BonnetFisher scientific17-100-900Single use cap for basic protection
CavicideMetrex13-1000Surface desinfectant
CD34+ cellsLonza2C-101As many vials available from a single donor
CentrifugeBeckman65-6KR
Clear jarAmazon77977
Cotton gauze padFisher scientific22-415-468Sterile
Disposable lab coatsFisher scientific19-472-422
EDTA micro tubesGreiner bio-one450480
Face MaskFisher scientific17-100-897
FACS lysing solutionBD340202
FBS premium HIAtlanta biologicalsS1115OH
FicollGE health one17-1440-02
Flow cytometerWe used FACS Aria II
Flow cytometry tubesFalcon3520545 ml polystyrene and round bottom
HIV BaLPrepared in our uQUANT core facility
Human PBMCsHIV positive and negative volunteers
Infrared warming padVenet scientificDCT-25Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I irradiatorEquipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
MicrocentrifugeEppendorf
Mouse ear tagsNational Band & Tag company1005-1L1
Natelson blood collection tubesFisher scientific02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
NSG miceJackson5557Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3Jackson13062
Paraformaldehyde 16%Electron microscopy sciences15710
PBS 1X pH 7.4Gibco100-10-023
Petri dishesFisher scientific08-757-28
Quantistudio qPCR machineThermoQS3
Reagent reservoirsCostar4870
RPMI media 1640 1XGibco11875-093
Shoe coversFisher scientific17-100-911
Sterile disposable GlovesMicroflexSUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMixInvitrogen10080-400cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2BD329-461
Syringes 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabine and TenofovirGileadNDC 61958-0701-1Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blueSigmaT8154Cell count and viability
Vick VaporubSchool health43214Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology gradeQuality biological351-029-131

Referanslar

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 154CD34PBMCintrahepatik enjeksiyonlarintraperitoneal enjeksiyonlarretro orbital kanamaHIV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır