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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui sono descritti tre approcci sperimentali per studiare la dinamica dell'infezione da HIV nei topi umanizzati. Il primo consente lo studio di eventi di infezione cronica, mentre i due ultimi consentono lo studio di eventi acuti dopo l'infezione primaria o la riattivazione virale.

Abstract

I topinulli umanizzati NOD/SCID/IL-2 ricapitolano alcune caratteristiche dell'immunità umana, che possono essere sfruttate nella ricerca di base e pre-clinica sulle malattie infettive. Qui sono descritti tre modelli di topi immunodeficienti umanizzati per studiare la dinamica dell'infezione da HIV. Il primo si basa sull'iniezione intraepatica di CD34- cellule staminali ematopoietiche nei topi neonati, che consente la ricostituzione di diverse cellule confinate nel sangue e nel linfoide, seguita da infezione con un ceppo HIV di riferimento. Questo modello consente il monitoraggio fino a 36 settimane dopo l'infezione ed è quindi chiamato il modello cronico. Il secondo e il terzo modello sono indicati come modelli acuti e di riattivazione, in cui le cellule mononucleari del sangue periferico vengono iniettate intraperitonealmente nei topi adulti. Nel modello acuto, le cellule di un donatore sano vengono innestate attraverso il percorso intraperitoneale, seguito da infezione con un ceppo HIV di riferimento. Infine, nel modello di riattivazione, le cellule di un donatore infetto dall'HIV sottoposto a terapia antiretrovirale vengono innestate attraverso il percorso intraperitoneale. In questo caso, un ambiente privo di farmaci nel mouse consente la riattivazione del virus e un aumento del carico virale. I protocolli qui forniti descrivono l'approccio sperimentale convenzionale per i modelli murini umanizzati e immunodeficienti dell'infezione da HIV.

Introduzione

Il modello murino umorizzato NOD/SCID/interleukin (IL)-2 receptor-chainnull (qui di seguito indicato come huNS-chainnull) è stato ampiamente utilizzato per studiare la patogenesi delle infezioni, l'autoimmunità e il cancro, così come per gli studi preclinici di farmaci e terapie basate su cellule umane1,2. Questi topi sono basati su un background non obeso diabetico (NOD), con la mutazione scid e mutazione mirata al locus a catena del recettore IL-2 (comune catena z per IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), che provocano una grave compromissione nello sviluppo delle cellule T-, B-, naturali e (NK killer)1. Così, essi sostengono l'innesto di tessuto umano, il CD34 umano- cellule staminali ematopoietiche (HSC) e le cellule mononucleari periferiche umane (PBMC)3,4,5. Inoltre, l'espressione transgenica di fattori ematopoietici umani, come il fattore delle cellule staminali (SCF), il fattore di stimolazione della colonia di granulociti/macrofasi (GM-CSF) e IL-3 promuove l'innesto delle popolazioni mieloidi umane6,7,8.

Per gli studi sull'HIV, sono stati descritti diversi modelli di toponull huNS a catena, che differiscono nel ceppo del topo, nel tipo di cellule umane utilizzate, nel tipo di tessuti per l'innesto e nell'origine delle cellule (cioè sane vs. donatore infetto dall'HIV)9,10. Il ceppo originale, tuttavia, è ampiamente utilizzato a causa degli alti livelli di innesto di cellule umane e della replicazione virale a seguito di infezione con un ceppo HIV di riferimento11,12,13. Ceppi di topi immunodeficienti simili con espressione transgenica di fattori ematopoietici umani (ad es. NOG-EXL o NSG-SGM3) o con impianti di fegato e timo umano (topogonico osseo-fegato-fegato [BLT]) sono utili per valutare il ruolo delle popolazioni mieloidi nella risposta immunitaria anti-HIV, gli effetti dell'HIV su questi tessuti e la loro partecipazione come serbatoi virali14,15. Inoltre, alcuni ceppi con espressione transgenica di molecole di antigene leucocito umano (HLA), così come topi BLT, possono essere utilizzati per studiare la risposta delle cellule T all'infezione da HIV16,17.

In generale, in questi topi, l'umanizzazione dipende dall'origine cellulare, dal percorso di consegna (intraperitonetale, intraepatico, endovenoso, intracardiaco) e dall'età del topo al momento dell'innesto18,19,20. Per quanto riguarda l'origine cellulare, l'uomo CD34- HSC derivato dal sangue cordonale, dal fegato fetale o dal sangue periferico mobilitato può essere iniettato nei neonati o nei giovani topi3,21. Inoltre, i topinulli adulti a catena possono essere umanizzati con l'iniezione di PBMC (qui, indicati come hu-PBL-NS-catena zz), permettendo la circolazione temporale di queste cellule nel sangue, organi linfoidi secondari e tessuti infiammati22,23,24.

Descritto qui è un protocollo dettagliato per la creazione di modelli di toponull huNS -catena per lo studio dell'infezione da HIV. Il primo è il modello cronico, in cui i CD34umani - HSC derivati dal sangue cordonale da un donatore sano vengono iniettati nei topi neonati, seguito da infezione con un ceppo HIV di riferimento dopo 14 settimane di ricostituzione del sistema immunitario umano. Questo modello permette il monitoraggio dei topi fino a 36 settimane dopo l'infezione. Il secondo modello è un modello acuto, in cui i PbMC derivati da un donatore sano vengono iniettati in topinull adulti NS , seguiti da infezione con un ceppo HIV di riferimento dopo 3 settimane di espansione delle cellule T umane nel topo. Infine, il terzo modello è il modello di riattivazione, in cui i PMC derivati da un donatore infetto dall'HIV sottoposto a terapia antiretrovirale soppressiva (ART) vengono iniettati nei topinulli adulti NS - catena. In questo caso, un ambiente privo di farmaci consente la riattivazione virale e l'aumento del carico virale. Questi due ultimi modelli consentono il monitoraggio fino a 9 settimane dopo l'innesto.

Nel complesso, questi tre modelli sono utili per studi virologici, studi preclinici su nuovi farmaci e valutazione degli effetti dell'infezione da HIV sulla risposta immunitaria globale. È inoltre importante considerare che l'uso di topi umanizzati affetti da HIV richiede la revisione e l'approvazione da parte del Comitato di Biosicurezza Istituzionale (IBC) e dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) prima di qualsiasi esperimento. Ciò garantisce che lo studio segua tutte le normative istituzionali interne ed esterne per l'uso di materiale biologico pericoloso e la manipolazione umana di animali sperimentali.

Protocollo

In questo lavoro, tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite secondo protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la University of Maryland School of Medicine (numeri di protocollo 1018017, 1018018 e 0318009).

1. Human CD34- Innesto HSC di topi neonati

  1. Utilizzare sempre attrezzature di protezione personale usa e getta (PPE), tra cui scrub sterili, guanti, scarpe dedicate, copriscarpe, maschera, occhiali, capelli / barba cofano, e cappotti da laboratorio sterili.
  2. Sospendere nuovamente 1 x 106 dei CD34congelati - HSC (vedi Tabella dei materiali)in 10 mL di supporti RPMI 1640 10% FBS sotto un armadio di biosicurezza certificato e mantenere condizioni sterili.
  3. Utilizzare 10 l della sospensione per contare (per assicurare la presenza del numero previsto di cellule) e controllare la vitalità delle cellule digitando l'esclusione blu trypan in un emocitometro.
  4. Centrifuga a 400 x g per 15 min a temperatura ambiente (RT). Scartare il supernatante e risospendere a freddo 1x PBS alla concentrazione richiesta (1,4 x 105 di CD34- HSC in 50 . Tenere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione.
  5. Collocare i cuccioli (NS - acatenanulli di entrambi i sessi da 1 a 4 giorni) in un piatto sterile di 100 mm2 Petri insieme a una piccola quantità di materiale da letto dalla gabbia dell'allevatore. Inoltre, strofinare biancheria da letto pulita tra le mani per mascherare ulteriormente eventuali odori stranieri sui cuccioli destinatario.
    NOTA: Questo riduce al minimo gli odori estranei che vengono impregnati sui cuccioli, migliorando così le possibilità che le madri accettino i loro cuccioli di nuovo in gabbie dopo la procedura.
  6. Mettere il piatto Petri in una gabbia di trasporto pulita e mettere la gabbia in una gabbia pulita di microisolatore di topo per proteggere i cuccioli dall'ambiente. Coprire la gabbia di trasporto con un coverpad per evitare l'esposizione degli animali alla luce esterna durante il transito verso la sala di irradiazione.
  7. Irradia cuccioli con 100 cGy irradiazione dell'intero corpo (WBI) per esposizione a una fonte di 137 C. Pulire l'interno dell'irradiatore con soluzione disinfettante, posizionare i topi nell'irradiatore e accendere il giradischi in modo che tutti i cuccioli siano irradiati in modo omogeneo. Chiudere l'irradiatore e premere l'interruttore di alimentazione per avviare il processo di irradiazione. Attendere il completamento del tempo di irradiazione e rimuovere immediatamente i topi.
    NOTA: Poiché l'irradiazione non genera stress nei topi, non è necessaria l'anestesia precedente.
  8. 2–4 h dopo la procedura di irradiazione, mettere i cuccioli in un armadio di biosicurezza all'interno di un piatto Petri sterile refrigerato coperto di garza sterile sul ghiaccio, fino ad anestesizzare (5-10 min). Si ottiene un'anestesia sufficiente quando i movimenti lordi cessano.
  9. Caricare la siringa con un ago attaccato (29 G, 0,5") con 50 gradi l della sospensione cellulare e 1,4 x 105 di CD34: HSC sotto l'armadietto di biosicurezza certificato.
  10. Per l'innesto tramite iniezione epatica, restringere i cuccioli con il pollice e le dita indice. Per ridurre al minimo il sistema di ritenuta del topo (30-45 s), lasciare che uno sperimentatore tenga il cucciolo e somministra l'iniezione e che il secondo sperimentatore carichi la siringa con le sospensioni HSC. Pulire il sito di iniezione con il 70% di alcol e fornire 50 -L di cellule direttamente nel fegato. Utilizzare un angolo di ago poco profondo durante l'iniezione per evitare completamente perforare il fegato. Come controllo, iniettare i topi con 50 -L di 1x PBS nel fegato.
  11. Disporre i cuccioli su un piatto Petri sterile preriscaldato ricoperto di garza sterile per 1-5 min per consentire il recupero. Preriscaldare il piatto utilizzando un pad di riscaldamento a infrarossi per i roditori a 20 gradi centigradi per garantire che i cuccioli non siano surriscaldati.
  12. Immediatamente prima di restituire i cuccioli ai loro genitori, applicare una piccola quantità di unguento a base di mentolo ed eucalipto, usando il pollice e le dita indice, al muso di entrambi i genitori per evitare il cannibalismo o il rifiuto dei cuccioli.
  13. Controllare le gabbie ogni giorno, alla ricerca di eventuali segni di malattia innesto-ospite (GVHD) nei cuccioli come pelle secca, nessuna alimentazione, eruzione cutanea, ealopecia. Eutanasia gli animali se si osserva uno di questi segni.
  14. Topi di svasare a 3 settimane di età, raggruppandoli per sesso. Non mettere più di 5 animali per gabbia. Verificare l'innesto nel sangue periferico da citometria di flusso a 14 settimane di età.
    NOTA: il tasso di successo dell'innesto è compreso tra l'80%-100%.

2. Innesto di pGRI umani di topi giovani

  1. Per i modelli acuti e di riattivazione, iniettare 6-8 topi NS - a catenanulla intraperitonealmente con PCR umani derivati da un donatore sano o da un paziente infetto da HIV che era sotto ART, rispettivamente. In entrambi i modelli, includere i topi iniettati con pCSV da un donatore sano senza infezione da HIV (sham) come controlli.
  2. Strato 15 mL di sangue intero in 5 mL di grado di gradiente di densità sterile in un tubo conico da 50 mL.
  3. Centrifuga a 400 x g per 30 min a RT, senza freni, per evitare che il buffy coat venga mescolato con il mezzo di pendenza densità di densità.
  4. Raccogliere con attenzione la frazione di celle mononucleari (tra il gradiente di densità medio e supernatante) e trasferire il pelo di bufala in un tubo di centrifuga di 15 mL contenente 10 mL di 1x PBS. Centrifuga a 300 x g per 10 min a RT.
  5. Eliminare il supernatante e rimuovere i globuli rossi rimanenti eseguendo il lising con 5 mL di tampone ACK aggiunti alle cellule pellettate. Incubare per 4 min a RT.
  6. Centrifuga a 300 x g per 10 min a RT. Scartare il supernatante e risospendere in 10 mL di 1x PBS o RPMI 1640 medio.
  7. Utilizzare 10 l della sospensione cellulare per contare le cellule e verificare la vitalità digitando l'esclusione blu trypan in un emocitometro. Tipicamente, 1–2 x 106 cellule si ottengono per ogni 1 mL di sangue, con più di 95% vitalità.
  8. Centrifuga a 300 x g per 10 min a RT. Scartare il supernatante e regolare il numero di cellulare alla concentrazione richiesta (in questo caso, 3,5 x 106 cellule in 200 - L di 1x PBS).
  9. Caricare la siringa con un ago annesso (28 G, 0,5") con 3,5 x 106 di PBMC in 200 - L di 1x PBS sotto un armadio di biosicurezza certificato.
  10. Togliere il mouse dalla gabbia e tenerlo per la coda in modo che possa afferrare la maglia, applicando una leggera trazione all'indietro. Quindi, posiziona l'indice e le dita del pollice sulle spalle dell'animale, afferrando la pelle sciolta del collo e usando il dito medio per stabilizzare la schiena.
  11. Far scorrere la testa del mouse indietro in modo che la sua schiena è sopra la testa. Questo permette di spostare i visceri nella cavità addominale all'indietro e riduce il rischio di forare gli organi interni durante l'iniezione.
  12. Pulire il sito di iniezione con il 70% di alcol.
  13. Penetrare la siringa utilizzata nel passaggio 2.9 attraverso la parete addominale e aspirare prima di iniettare le cellule, se viene aspirato del materiale, rimuovere la siringa e scartarla. In caso contrario, iniettare lentamente le cellule nella cavità intraperitoneale, rimuovere la siringa e scartarla. Iniettare 1x PBS per controllare i topi.
  14. Riportare l'animale alla sua gabbia.
  15. Verificare l'innesto nel sangue periferico da citometria di flusso a 3 settimane dopo l'iniezione.

3. Assistenza post-innesto

  1. Identificare i topi mediante l'etichettatura dell'orecchio.
  2. Osservare i topi utilizzati in questi esperimenti da vicino 2 volte al giorno dopo ogni procedura per i segni clinici di disagio.
  3. Dopo il trapianto di cellule umane, monitorare i topi per il GVHD. Per monitorare i sintomi di GVHD nei topi neonati, giovani e adulti, valutare gli animali per la comparsa di malattie della pelle (ad esempio, colore, secchezza, eruzione cutanea, alopecia), oltre alla misura del peso corporeo. Valutare gli animali che mostrano questi segni da un veterinario per considerare l'eutanasia precoce.

4. procedura di infezione da HIV e procedura di infezione fittizia

NOTA: Per i modelli cronici e acuti, i topi sono infettati dal ceppo di riferimento HIV BaL rispettivamente alla settimana 14 e alla settimana 3 dopo l'innesto. Le iniezioni con HIV vengono somministrate per via intraperitaneiale nei quadranti addominali inferiori.

  1. Eseguire il processo di caricamento del virus/PBS in siringhe, utilizzando un ago da 28 G 0,5", negli armadi BSL2 seguendo le procedure ABSL2. La quantità totale di virus iniettato è 15.000 dose infettiva di coltura mediana (TCID50) in 200 - L di RPMI sterile 1640.
  2. Togliere il mouse dalla gabbia e tenerlo per la coda in modo che possa afferrare la maglia, applicando una leggera trazione all'indietro. Quindi, posiziona l'indice e il pollice sulle spalle dell'animale, afferrando la pelle sciolta del collo e usando il dito medio per stabilizzare la schiena.
  3. Far scorrere la testa del mouse indietro in modo che la sua schiena è sopra la sua testa. Questo permette di spostare i visceri nella cavità addominale all'indietro e riduce il rischio di foratura degli organi interni durante l'iniezione.
  4. Pulire i topi con un'alcol tampone pre-bagnata nel quadrante inferiore sinistro/destro dell'addome. Iniettare 15.000 TCID50 del virus HIV BaL contenuto in 200 - L di RPMI sterile 1640.
  5. Dopo l'iniezione, riportare il topo alla sua gabbia di casa.

5. Raccolta di sangue per puntura retroorbitale

NOTA: Il sanguinamento retroorbitale consente la rapida raccolta di sangue, riducendo così il tempo complessivo di raccolta e aumentando la stabilità dei marcatori linfociti umani. Utilizzare tubi EDTA per raccogliere il sangue dei topi.

  1. Nel modello cronico, a 14 settimane dopo l'iniezione HSC, raccogliere il sangue tramite vena retroorbitale. Nei modelli acuti e di riattivazione, eseguire questa procedura a 3 settimane dopo l'iniezione PBMC.
  2. Anestesizzagli gli animali usando 250 l di inalazione di isofilurano prima della raccolta del sangue in una cappa di biosicurezza di classe B2 che viene dotti esternamente.
  3. Distribuisci l'Isoflurane in batuffoli di cotone sotto una rete metallica in un barattolo trasparente da 1 L in un armadio di biosicurezza ventilato all'esterno dell'edificio. L'uso della rete assicura che gli animali non contattino il cuscinetto imbevuto di isoflurane, che può causare irritazione cutanea e potenziale sovradosamento poiché l'ioflurane viene assorbito anche attraverso la pelle. Inoltre, mettere un asciugamano di carta morbida tra la maglia e l'animale per evitare lesioni agli arti.
  4. Una volta che il barattolo è saturo di isoflurane (circa 1 min dopo l'aggiunta), introdurre l'animale e osservare la frequenza respiratoria, che aumenterà quindi diminuire. Controllare l'indicazione clinica di un piano profondo di anestesia, che include la mancanza di un riflesso di raddorziamento (su barattolo ribaltamento delicatamente) e la mancanza di movimenti grossolani. Avviare la procedura di sanguinamento non appena l'animale è completamente rilassato e manca il riflesso pizzico della dita dei impideli.
    NOTA: Poiché l'Isoflurane evapora, dispensa più droga se non si osservano segni di anestesia.
  5. Per il sanguinamento retroorbitale, premere la vena giugulare esterna del topo caudal alla mandiboriera con il pollice e, con la stessa mano, elevare delicatamente la palpebra superiore con l'indice.
  6. Inserire un tubo ematocrato nel canto mediale dell'occhio e dirigerlo in direzione ventrolaterale fino a quando il sangue inizia a fluxare.
  7. Raccogliere almeno 100 l di sangue. Una volta ottenuto il volume di sangue desiderato (un volume non superiore all'1% del peso corporeo dell'animale), interrompere la pressione giugulare esterna e rimuovere il tubo di ematocrit.
  8. Assicurarsi che l'emostasi sia completa applicando la pressione diretta sull'occhio utilizzando una garza sterile per un minimo di 30 s.
  9. Applicare gocce di tetracaina nell'occhio. Monitorare l'animale fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia e rimetterlo nella gabbia.
    NOTA: Il 100 L di sangue raccolto viene utilizzato per la valutazione del livello di innesto delle popolazioni umane CD45e di altre cellule del sangue, nonché per la valutazione del carico virale al plasma.

6. Screening del livello di innesto e dell'analisi della citometria di flusso

  1. Seguire un protocollo di colorazione della citometria di flusso convenzionale per il sangue intero, che include l'incubazione di anticorpi anti-umani con etichetta fluorocro (per il pannello di flusso suggerito, vedi Tabella dei materiali), seguito dalla lisi dei globuli rossi e dai passaggi di lavaggio13,15.
    NOTA: Per lo screening del livello di innesto, includere un anticorpo CD45 anti-umano. Per il confronto, può essere utilizzato anche un anticorpo CD45 anti-topo. Includere controlli di compensazione e un campione di sangue umano macchiato con la stessa miscela di anticorpi, campioni di topo e sangue umano incontaminati e controllo non umanizzato per testare la reattività incrociata dei reagenti. Dopo la colorazione, c'è sempre qualche segnale di fondo; tuttavia, tutti i segnali positivi sono chiaramente distinti dai controlli negativi e interreattivi.
  2. In un citometro di flusso appropriato, acquisire almeno 10.000 eventi sulla porta dei linfociti (FSC-A contro SSC-A). Per l'analisi della citometria di flusso, dopo l'esclusione duplicata, determinare la percentuale di cellule CD45 umanee altre popolazioni di cellule di interesse.

7. Valutazione del carico virale al plasma

  1. Valutare il carico virale negli animali infetti da HIV 1x a settimana dopo l'infezione.
  2. Dopo l'emorragia retroorbitale (circa 100 o L), ottenere il plasma raccogliendo il supernatore dopo la centrifugazione del sangue anticoagulato a 3.500 x g per 3 min in una microcentrifuga. Il pellet viene utilizzato per la fenotipizzazione delle cellule del sangue.
  3. Utilizzare un kit di estrazione dell'RNA virale commerciale (vedi Tabella dei materiali)per ottenere RNA da 40 - L di plasma.
  4. Convertire l'RNA in cDNA utilizzando il primo mix di sintesi di deformazione (vedi Tabella dei materiali)e il primer del bavaglio dell'HIV SK431.
  5. Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale utilizzando I primer HIV Gag SK38/SK39 e i coloranti verdi fluorescenti (ad esempio, verde SYBR) come descritto negli studi precedenti13,25.

8. Somministrazione di terapia antiretrovirale

  1. Somministrare l'ART orale almeno 3 settimane dopo l'infezione, quando si osserva un alto carico virale, nei modelli cronici, acuti e di riattivazione.
  2. Calcolare le dosi di tenofovir disoproxil fumarate (TDF), emtricitabine (FTC) e raltegravir (RAL), in base ai valori Km di 37 e 3 per gli esseri umani e topi, rispettivamente26. Tipicamente, le dosi umane equivalenti di TDF, FTC e RAL sono rispettivamente 61,7 mg/kg/giorno, 40,7 mg/kg/giorno e 164 mg/kg/giorno, rispettivamente.
  3. Per la somministrazione in acqua potabile, schiacciare le compresse di droga e aggiungere la rispettiva quantità nella bottiglia d'acqua, assicurando che ogni topo nella gabbia acquisisca la sua dose giornaliera. Dal momento che la polvere di farmaco può formare sedimenti nella bottiglia, scuotere periodicamente la bottiglia d'acqua per ottenere sospensioni omogenee.
  4. Cambiare la bottiglia d'acqua ogni settimana con farmaci appena disciolti.
  5. Raccogliere il sangue tramite vena retroorbitale ogni settimana o ogni 2 settimane dopo l'inizio ART per valutare i cambiamenti nel carico virale e rapporto CD4:CD8.

9. Eutanasia dei topi, raccolta di organi linfoidi secondari e isolamento di cellule mononucleari

  1. L'eutanasia viene eseguita nei tre modelli murini umanizzati, periodicamente lungo il tempo dell'infezione o alla fine dell'esperimento.
  2. Eseguire l'eutanasia dei topi adulti mediante asfissiaco2, seguita dalla lussazione cervicale. Per l'asfissia, utilizzare una camera non precaricata, erogare CO2 da un cilindro commerciale con regolatore a pressione fissa e in linea che controlla il flusso di gas entro il 20%-30% del volume della camera/minuto per rispettare le linee guida AVMA 2013.
  3. Mantenere il flusso di CO2 per >60 s monitoraggio arresto respiratorio (che può richiedere fino a 5 min), seguito dalla lussazione cervicale per assicurare l'eutanasia.
  4. I neonati eutanasi <7 giorni fa con un metodo fisico (ad esempio, utilizzando forbici affilate).
  5. Visualizza i linfonodi ascellari, mediastinali e mestenei (che sono tipicamente osservati) ed estrali con una pinzetta e forbici affilate. Estrarre anche la milza, situata nella parte superiore sinistra della cavità peritoneale.
  6. Depositare i tessuti linfoidi in tubi di centrifuga da 1,5 ml contenenti mezzi RPMI 1640 sterili.
  7. Immediatamente elaborare i tessuti linfoidi in un colino di dimensioni 70 mm colicella di nylon, raccogliendo le cellule in un tubo da 50 mL. Non aspirare i tessuti.
  8. Lavare le cellule con 5 mL di RPMI 1640 medio integrato con 1% FBS per facilitare il filtraggio delle cellule.
  9. Dopo la disaggregazione del tessuto, centrifugare la sospensione delle cellule a 3.500 x g per 10 min in una microcentrifuga.
  10. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule con 500 L di 1x PBS.
  11. Trasferire le sospensioni delle cellule in un tubo di centrifuga di 1,5 mL contenente 500 -L di mezzo di gradiente di densità sterile.
  12. Centrifuga a 3.500 x g per 3 min in una microcentrifuga, senza freno, per evitare che il buffy coat si mescoli con il gradiente di densità medio
  13. Raccogliere con attenzione la frazione di celle mononucleari (tra il gradiente di densità medio e supernatale) e trasferire il pelo di bufala in un tubo di centrifuga di 1,5 mL contenente 500 .L di 1x PBS. Centrifuga a 3.000 x g per 3 min.
  14. Rimuovere i globuli rossi rimanenti lising con 500 l di Tampone ACK, incubando per 4 minuti a RT.
  15. Centrifuga a 3.000 x g per 3 min. Scartare il supernatante e ripartire in 1 mL di 1x PBS o medio.

Risultati

Come descritto in precedenza, a 14 settimane dopo l'iniezione HSC (modello cronico) o a 3 settimane dopo l'iniezione pb-POMC (modelli acuti e di riattivazione), i topi vengono dissanguati per lo screening del livello di innesto di cellule umane mediante citometria di flusso. Nella figura 1Aè riportata una strategia rappresentativa di gating per la valutazione di 1) CD45 umano- la ricostituzione delle cellule e 2) di CD4e le celluleT. Tipicam...

Discussione

Importanti progressi sono stati raggiunti nello sviluppo di ceppi di topi immunodeficienti per l'umanizzazione, con una serie di diverse opzioni che possono essere utilizzate in base all'interesse della ricerca1. Fornito qui è un protocollo generale per l'umanizzazione dei topinulli NS -catena-catena e ceppi geneticamente simili da impiegare in tre diversi modelli per studiare l'infezione da HIV. Nel primo approccio sperimentale, i topi appena nati irradiati vengono iniettati con CD34 ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dai fondi interni della divisione clinica IHV a JC .

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3745.S.X
10 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0010
15 ml conical tubesStellar scientificT15-600
25 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0025
5 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0005
50 ml conical tubesStellar scientificT50-600
ACK lysis bufferQuality biological118-156-101
Alcohol prep padsFisher scientific06-669-62Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1Biolegend300439APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4Biolegend317420AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1Biolegend368522BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
BonnetFisher scientific17-100-900Single use cap for basic protection
CavicideMetrex13-1000Surface desinfectant
CD34+ cellsLonza2C-101As many vials available from a single donor
CentrifugeBeckman65-6KR
Clear jarAmazon77977
Cotton gauze padFisher scientific22-415-468Sterile
Disposable lab coatsFisher scientific19-472-422
EDTA micro tubesGreiner bio-one450480
Face MaskFisher scientific17-100-897
FACS lysing solutionBD340202
FBS premium HIAtlanta biologicalsS1115OH
FicollGE health one17-1440-02
Flow cytometerWe used FACS Aria II
Flow cytometry tubesFalcon3520545 ml polystyrene and round bottom
HIV BaLPrepared in our uQUANT core facility
Human PBMCsHIV positive and negative volunteers
Infrared warming padVenet scientificDCT-25Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I irradiatorEquipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
MicrocentrifugeEppendorf
Mouse ear tagsNational Band & Tag company1005-1L1
Natelson blood collection tubesFisher scientific02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
NSG miceJackson5557Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3Jackson13062
Paraformaldehyde 16%Electron microscopy sciences15710
PBS 1X pH 7.4Gibco100-10-023
Petri dishesFisher scientific08-757-28
Quantistudio qPCR machineThermoQS3
Reagent reservoirsCostar4870
RPMI media 1640 1XGibco11875-093
Shoe coversFisher scientific17-100-911
Sterile disposable GlovesMicroflexSUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMixInvitrogen10080-400cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2BD329-461
Syringes 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabine and TenofovirGileadNDC 61958-0701-1Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blueSigmaT8154Cell count and viability
Vick VaporubSchool health43214Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology gradeQuality biological351-029-131

Riferimenti

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