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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

On décrit ici trois approches expérimentales pour étudier la dynamique de l'infection par le VIH chez les souris humanisées. Le premier permet l'étude des événements d'infection chronique, tandis que les deux derniers permettent l'étude des événements aigus après l'infection primaire ou la réactivation virale.

Résumé

Les sourisnulles humanisées de NOD/SCID/IL-2 de récepteur de chaîne de NOD/SCID/IL-2 récapitulent certaines caractéristiques de l'immunité humaine, qui peuvent être exploitées dans la recherche fondamentale et préclinique sur des maladies infectieuses. Décrit ici sont trois modèles de souris immunodéficientes humanisées pour étudier la dynamique de l'infection par le VIH. La première est basée sur l'injection intrahépatique de cellules souches hématopoïétiques CD34chez les souris nouveau-nées, ce qui permet la reconstitution de plusieurs cellules confinées dans le sang et les lymphoïdes, suivies d'une infection par une souche de référence du VIH. Ce modèle permet de surveiller jusqu'à 36 semaines après l'infection et est donc appelé le modèle chronique. Les deuxième et troisième modèles sont appelés modèles aigus et de réactivation, dans lesquels les cellules mononucléaires périphériques de sang sont injectées par voie intrapéritone chez les souris adultes. Dans le modèle aigu, les cellules d'un donneur sain sont greffées par la voie intrapéritonéale, suivies d'une infection par une souche de référence du VIH. Enfin, dans le modèle de réactivation, les cellules d'un donneur infecté par le VIH sous traitement antirétroviral sont greffées par voie intrapéritonéale. Dans ce cas, un environnement sans drogue chez la souris permet la réactivation du virus et une augmentation de la charge virale. Les protocoles fournis ici décrivent l'approche expérimentale conventionnelle pour les modèles humains et immunodéficients de souris de l'infection par le VIH.

Introduction

Le modèle humanisé de souris NOD/SCID/interleukin (IL)-2 récepteur (ci-après appelé huNS -chaînenulle)modèle de souris a été largement utilisé pour étudier la pathogénie des infections, l'auto-immunité, et le cancer, ainsi que pour les études précliniques des médicaments et des thérapies à base de cellules humaines1,2. Ces souris sont basées sur un fond diabétique non-obèse (NOD), avec la mutation cid et la mutation ciblée au locus de chaîne de récepteur d'IL-2 (chaîne commune pour IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, et IL-21), qui induisent une altération grave dans le développement des cellules de t-, b-, et de tueur naturel (NK) de souris1. Ainsi, ils soutiennent l'engraftment des tissus humains, des cellules souches hématopoïétiques (HSC) humaines CD34 et humaines, et des cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines (PBMC)3,4,5. En outre, l'expression transgénique des facteurs hématopoïétiques humains, tels que le facteur de cellules souches (SCF), le facteur de stimulation de colonie de granulocyte/macrophage (GM-CSF), et IL-3 favorise l'engraftment des populations myéloïdes humaines6,7,8.

Pour les études sur le VIH, plusieurs modèles de sourisnulles à chaîne huNS ont été décrits, qui diffèrent dans la souche de souris, le type de cellules humaines utilisées, le type de tissus pour l'engraftment, et l'origine des cellules (c.-à-d., sain vs. donneur infecté par le VIH)9,10. La souche originale, cependant, est largement utilisée en raison des niveaux élevés de greffe de cellules humaines et de réplication virale après l'infection avec une souche de référence du VIH11,12,13. Souches de souris immunodéficientes similaires avec expression transgénique de facteurs hématopoïétiques humains (p. ex., NOG-EXL ou NSG-SGM3) ou avec des implants de foie humain et de tissus thymus (souris de moelle-foie-thymus [BLT]) sont utiles pour évaluer le rôle des populations myéloïdes dans la réponse immunitaire anti-VIH, les effets du VIH sur ces tissus, et leur participation en tant que réservoirs viraux14,15. En outre, certaines souches avec l'expression transgénique des molécules humaines d'antigène de leucocyte (HLA), aussi bien que des souris de BLT, peuvent être employées pour étudier la réponse de T-cell à l'infection de HIV16,17.

En général, chez ces souris, l'humanisation dépend de l'origine cellulaire, de la voie d'accouchement (intrapéritonéal, intrahépatique, intraveineuse, intracardiaque) et de l'âge de la souris au moment de l'engraftment18,19,20. En ce qui concerne l'origine cellulaire, l'homme CD34- HSC dérivé du sang de cordon, du foie foetal, ou du sang périphérique mobilisé peut être injecté chez les souris nouveau-nées ou jeunes3,21. En outre, les sourisnulles adultes en chaîne de chaîne peuvent être humanisées par l'injection de PBMC (ici, appelée sourisnulles de la chaîne hu-PBL-NS), permettant la circulation temporelle de ces cellules dans le sang, les organes lymphoïdes secondaires et les tissus enflammés22,23,24.

Décrit ici est un protocole détaillé pour l'établissement de huNS -chaîne des modèles de sourisnulles pour l'étude de l'infection par le VIH. Le premier est le modèle chronique, dans lequel les CD34humains et les HSC dérivés du sang de cordon ombilical d'un donneur sain sont injectés chez des souris nouveau-nées, suivis d'une infection par une souche de référence du VIH après 14 semaines de reconstitution du système immunitaire humain. Ce modèle permet de surveiller les souris jusqu'à 36 semaines après l'infection. Le deuxième modèle est un modèle aigu, dans lequel les PBMC dérivés d'un donneur sain sont injectés chez des sourisnulles adultes de la chaîne NS, suivies d'une infection par une souche de référence du VIH après 3 semaines d'expansion des lymphocytes T humains chez la souris. Enfin, le troisième modèle est le modèle de réactivation, dans lequel les PBMC dérivés d'un donneur infecté par le VIH sous traitement antirétroviral suppressif (TAR) sont injectés chez des sourisadultes à chaîne NS. Dans ce cas, un environnement sans drogue permet la réactivation virale et l'augmentation de la charge virale. Les deux derniers modèles permettent une surveillance jusqu'à 9 semaines après l'engraftment.

Dans l'ensemble, ces trois modèles sont utiles pour les études virologiques, les études précliniques de nouveaux médicaments et l'évaluation des effets de l'infection par le VIH sur la réponse immunitaire mondiale. Il est également important de considérer que l'utilisation de souris infectées par le VIH doit être examinée et approuvée par le Comité institutionnel de biosécurité (BAC) ainsi que par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) avant toute expérience. Cela garantit que l'étude suit toutes les réglementations institutionnelles internes et externes pour l'utilisation de matières biologiques dangereuses et la manipulation humaine d'animaux expérimentaux.

Protocole

Dans le cadre de ce travail, tous les soins et procédures pour animaux ont été exécutés selon des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'École de médecine de l'Université du Maryland (numéros de protocole 1018017, 1018018 et 0318009).

1. L'engraftment humain de CD34et de HSC des souris nouveau-nées

  1. Utilisez toujours de l'équipement de protection personnelle jetable (EPI), y compris des gommages stériles, des gants, des chaussures dédiées, des couvre-chaussures, un masque, des lunettes, un bonnet de cheveux et de barbe et des blouses de laboratoire stériles.
  2. Resuspendre 1 x 106 de CD34 congeléset HSC (voir Tableau des matériaux) dans 10 mL de RPMI 1640 médias 10 % FBS sous une armoire de biosécurité certifiée et maintenir des conditions stériles.
  3. Utilisez 10 L de la suspension pour compter (pour assurer la présence du nombre prévu de cellules) et vérifier la viabilité des cellules en tactant l'exclusion bleue trypan dans un hémocytomètre.
  4. Centrifugeuse à 400 x g pendant 15 min à température ambiante (RT). Jeter le supernatant et le resuspendre dans le FROID 1x PBS à la concentration requise (1,4 x 105 de CD34et HSC s'en50 L). Gardez les cellules sur la glace jusqu'à l'injection.
  5. Placer les chiots (nS-chaîne des chiotsnull des deux sexes à partir de 1 à 4 jours) dans un plat stérile de 100 mm2 Petri ainsi qu'une petite quantité de matériel de literie de la cage d'éleveur. En outre, frottez la literie propre entre les mains pour masquer davantage toutes les odeurs étrangères sur les chiots receveurs.
    REMARQUE: Cela minimise les odeurs étrangères étant imprégnés sur les chiots, améliorant ainsi les chances des mères d'accepter leurs chiots de nouveau dans les cages après la procédure.
  6. Placez le plat Petri dans une cage de transport propre et placez la cage dans une cage de microisolateur propre de souris pour protéger des chiots de l'environnement. Couvrir la cage de transport d'un coussin de couverture pour éviter l'exposition des animaux à la lumière extérieure pendant le transport vers la salle d'irradiation.
  7. Irradier les chiots avec 100 cGy irradiation du corps entier (WBI) par l'exposition à une source de 137 Cs. Nettoyez l'intérieur de l'irradiateur avec une solution désinfectante, placez les souris dans l'irradiateur et allumez la plaque tournante afin que tous les chiots soient irradiés de façon homogène. Fermez l'irradiateur et appuyez sur le commutateur d'alimentation pour initier le processus d'irradiation. Attendez que le temps d'irradiation soit terminé et retirez immédiatement les souris.
    REMARQUE : Comme l'irradiation ne génère pas de stress chez les souris, l'anesthésie préalable n'est pas nécessaire.
  8. 2 à 4 h après la procédure d'irradiation, placer les chiots dans une armoire de biosécurité à l'intérieur d'un plat petri stérile réfrigéré recouvert de gaze stérile sur la glace, jusqu'à ce qu'ils soient anesthésiés (5 à 10 min). Une anesthésie suffisante est obtenue lorsque les mouvements bruts cessent.
  9. Chargez la seringue avec une aiguille attachée (29 G, 0,5 po) avec 50 l de la suspension cellulaire et 1,4 x 105 de CD34et hSC sous l'armoire de biosécurité certifiée.
  10. Pour l'engraftment par injection hépatique, retenir les chiots avec le pouce et les index. Pour réduire au minimum la retenue de la souris (30 à 45 s), laissez un enquêteur tenir le chiot et administrer l'injection, et demandez au deuxième enquêteur de charger la seringue avec la suspension HSC. Nettoyez le site d'injection avec 70 % d'alcool et livrez 50 L de cellules directement dans le foie. Utilisez un angle d'aiguille peu profond lors de l'injection pour éviter de percer complètement le foie. En tant que contrôle, injecter des souris avec 50 oL de 1x PBS dans le foie.
  11. Déposer les chiots sur un plat Petri stérile préréchauffé recouvert de gaze stérile pendant 1 à 5 min pour permettre la récupération. Préchauffez le plat à l'aide d'un tampon de réchauffement infrarouge pour les rongeurs à 20 oC afin de vous assurer que les petits ne seront pas trop réchauffés.
  12. Immédiatement avant de retourner les chiots à leurs parents, appliquez une petite quantité d'onduleur à base de menthol et d'eucalyptus, à l'aide du pouce et des index, au museau des deux parents pour éviter le cannibalisme ou le rejet des chiots.
  13. Vérifiez les cages tous les jours, à la recherche de tout signe de maladie de greffe contre hôte (GVHD) chez les chiots tels que la peau sèche, pas d'alimentation, éruption cutanée, et l'alopécie. Euthanasier les animaux si l'un de ces signes est observé.
  14. Souris de soulement à 3 semaines d'âge, les regroupant par sexe. Ne mettez pas plus de 5 animaux par cage. Vérifier l'engraftment dans le sang périphérique par cytométrie de flux à 14 semaines d'âge.
    REMARQUE : Le taux de réussite de l'engraftment se situe entre 80 % et 100 %.

2. Engraftment humain de PBMC des souris juvéniles

  1. Pour les modèles aigus et de réactivation, injectez des sourisnulles de 6 à 8 semaines à la chaîne NS par voie intrapéritone avec des PBMC humains provenant d'un donneur en bonne santé ou d'un patient infecté par le VIH qui était sous multithérapie, respectivement. Dans les deux modèles, inclure des souris injectées avec des PBMC d'un donneur en bonne santé sans infection par le VIH (faux) comme témoins.
  2. Couche 15 ml de sang entier dans 5 ml de gradient de densité stérile dans un tube conique de 50 ml.
  3. Centrifugeuse à 400 x g pendant 30 min à RT, sans freins, pour éviter que le pelage bouffi ne se mélange au milieu de gradient de densité.
  4. Recueillir soigneusement la fraction de cellules mononucléaires (entre le milieu de gradient de densité et le supernatant) et transférer la couche bouffie dans un tube de centrifugeuse de 15 ml contenant 10 ml de 1x PBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à RT.
  5. Jeter le supernatant et enlever les globules rouges restants en lysing avec 5 ml de tampon ACK ajouté aux cellules granulées. Incuber pendant 4 min à RT.
  6. Centrifugeà euretuge à 300 x g pendant 10 min à RT. Jeter le supernatant et le resuspendre dans 10 ml de 1x PBS ou RPMI 1640 milieu.
  7. Utilisez 10 L de la suspension cellulaire pour compter les cellules et vérifier la viabilité en tactant l'exclusion bleue trypan dans un hémocytomètre. Typiquement, 1/2 x 106 cellules sont obtenues pour chaque 1 ml de sang, avec plus de 95% de viabilité.
  8. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à RT. Jetez le supernatant et ajustez le nombre de cellules à la concentration requise (dans ce cas, 3,5 x 106 cellules dans 200 'L de 1x PBS).
  9. Chargez la seringue avec une aiguille attachée (28 G, 0,5 po) avec 3,5 x 106 de PBMC dans 200 L de 1x PBS sous une armoire de biosécurité certifiée.
  10. Retirez la souris de la cage et tenez-la par la queue afin qu'elle puisse saisir le maillage, en appliquant une traction douce vers l'arrière. Ensuite, placez l'index et les doigts du pouce sur les épaules de l'animal, saisissant la peau lâche du cou et en utilisant le majeur pour stabiliser son dos.
  11. Faites glisser la tête de la souris vers l'arrière de sorte que son dos est au-dessus de la tête. Cela permet aux viscères de la cavité abdominale d'être déplacés vers l'arrière et réduit le risque de perforation des organes internes pendant l'injection.
  12. Nettoyer le site d'injection avec 70% d'alcool.
  13. Pénétrer la seringue utilisée à l'étape 2.9 à travers la paroi abdominale et aspirer avant d'injecter les cellules, si un matériau est aspiré, retirez la seringue et jetez-la. Sinon, injectez les cellules lentement dans la cavité intrapéritonéale, retirez la seringue et jetez-la. Injecter 1x PBS pour contrôler les souris.
  14. Remettre l'animal dans sa cage.
  15. Vérifier l'engraftment dans le sang périphérique par cytométrie de flux à 3 semaines après injection.

3. Soins post-greffe

  1. Identifiez les souris par marquage des oreilles.
  2. Observez les souris utilisées dans ces expériences de près 2x par jour après chaque procédure pour les signes cliniques de détresse.
  3. Après la transplantation de cellules humaines, surveillez des souris pour GVHD. Pour surveiller les symptômes du GVHD chez les souris nouveau-nées, juvéniles et adultes, évaluez les animaux pour l'apparence de la maladie de peau (c.-à-d. couleur, sécheresse, éruption cutanée, alopécie), en plus de la mesure du poids corporel. Évaluer les animaux qui montrent ces signes par un vétérinaire pour envisager l'euthanasie précoce.

4. Procédure d'infection par le VIH et procédure d'infection fictive

REMARQUE : Pour les modèles chroniques et aigus, les souris sont infectées par la souche de référence du VIH BaL à la semaine 14 et à la semaine 3 après l'engraftment, respectivement. Les injections avec le VIH sont administrées par voie intrapéritone dans les quadrants abdominaux inférieurs.

  1. Effectuer le processus de chargement du virus/PBS dans des seringues, à l'aide d'une aiguille de 28 G 0,5 po, dans des armoires BSL2 suivant les procédures ABSL2. La quantité totale de virus injecté est de 15 000 dose infectieuse médiane de culture tissulaire (TCID50) dans 200 L de RPMI stérile 1640.
  2. Retirez la souris de la cage et tenez-la par sa queue afin qu'elle puisse saisir le maillage, en appliquant une traction douce vers l'arrière. Ensuite, placez l'index et le pouce sur les épaules de l'animal, saisissant la peau lâche du cou et en utilisant le majeur pour stabiliser le dos.
  3. Faites glisser la tête de la souris vers l'arrière de sorte que son dos est au-dessus de sa tête. Cela permet aux viscères de la cavité abdominale d'être déplacés vers l'arrière et réduit le risque de perforation des organes internes pendant l'injection.
  4. Nettoyez les souris avec un tampon d'alcool pré-humide dans le quadrant inférieur gauche/droit de l'abdomen. Injecter 15 000 TCID50 du virus DU VIH BaL contenu dans 200 L de RPMI 1640 stérile.
  5. Après l'injection, retournez la souris dans sa cage d'origine.

5. Collecte de sang par ponction rétroorbitale

REMARQUE : Le saignement rétroorbital permet la collecte rapide du sang, réduisant de ce fait le temps global de collecte et augmentant la stabilité des marqueurs humains de lymphocyte. Utilisez des tubes EDTA pour recueillir le sang des souris.

  1. Dans le modèle chronique, à 14 semaines après l'injection de HSC, recueillir le sang par l'intermédiaire de la veine rétroorbitale. Dans les modèles aigus et de réactivation, effectuer cette procédure à 3 semaines après l'injection PBMC.
  2. Anesthésiez les animaux à l'aide de 250 l d'inhalation d'isoflurane avant la collecte de sang dans une classe B2 de hotte de biosécurité qui est conduit à l'extérieur.
  3. Distribuer l'Isoflurane dans des tampons de coton sous un treillis métallique dans un bocal clair de 1 L dans une armoire de biosécurité ventilée à l'extérieur du bâtiment. L'utilisation de la maille assure que les animaux ne contactent pas le tampon imbibé d'isoflurane, ce qui peut causer une irritation de la peau et une surdose potentielle puisque l'isoflurane est également absorbé par la peau. En outre, mettez une serviette en papier doux entre le maillage et l'animal pour éviter des dommages de membre.
  4. Une fois que le pot est saturé d'isoflurane (environ 1 min après l'avoir ajouté), introduire l'animal et observer le taux respiratoire, qui augmentera puis diminuera. Vérifiez l'indication clinique d'un plan profond d'anesthésie, qui comprend l'absence d'un réflexe de redressement (sur le pot de basculement doucement) et l'absence de mouvements bruts. Commencez la procédure de saignement dès que l'animal est complètement détendu et manque du réflexe de pincement de l'orteil.
    REMARQUE : Puisque l'isoflurane s'évapore, distribuez plus de drogue si aucun signe d'anesthésie n'est observé.
  5. Pour le saignement rétroorbital, appuyez sur la caudale de veine jugulaire externe de souris à la mandibule avec le pouce, et avec la même main, élever doucement la paupière supérieure avec l'index.
  6. Insérez un tube hématocrit dans le canthus médial de l'œil et dirigez-le dans une direction ventrolatérale jusqu'à ce que le sang commence à fluctuer.
  7. Recueillir au moins 100 l de sang. Une fois que le volume désiré de sang est obtenu (un volume ne plus que le 1% du poids corporel de l'animal), arrêter la pression jugulaire externe et enlever le tube hématocrit.
  8. Assurez-vous que l'hémostase est complète en appliquant la pression directe sur l'œil à l'aide d'une gaze stérile pour un minimum de 30 s.
  9. Appliquer des gouttes de tétraïne dans l'œil. Surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il soit complètement remis de l'anesthésie et placez-le dans la cage.
    REMARQUE : Les 100 L de sang recueilli sont utilisés pour l'évaluation du niveau d'engraftment des CD45 humains et d'autres populations de cellules sanguines, ainsi que pour l'évaluation de la charge virale plasmatique.

6. Dépistage de l'analyse du niveau d'engraftment et de la cytométrie du débit

  1. Suivez un protocole de coloration classique de cytométrie de flux pour le sang entier, qui inclut l'incubation des anticorps anti-humains fluorochrome-étiquetés (pour le panneau suggéré de flux, voir tableau des matériaux),suivi par la lyse des globules rouges et les étapes de lavage13,15.
    REMARQUE : Pour le dépistage du niveau d'engraftment, inclure un anticorps cD45 anti-humain. Pour la comparaison, un anticorps anti-souris CD45 peut également être utilisé. Inclure des contrôles de compensation ainsi qu'un échantillon de sang humain taché du même mélange d'anticorps, des échantillons de sang non tachés de souris et d'humains, et un contrôle non humanisé pour tester la réactivité croisée des réactifs. Après la coloration, il y a toujours un certain signal de fond ; cependant, tous les signaux positifs sont clairement distingués des contrôles négatifs et interactifs.
  2. Dans un cytomètre de débit approprié, acquérez au moins 10 000 événements sur la porte des lymphocytes (FSC-A vs SSC-A). Pour l'analyse de cytométrie de flux, après l'exclusion en double, déterminez le pourcentage de cellules CD45et d'autres cellules d'intérêt.

7. Évaluation de la charge virale plasmatique

  1. Évaluer la charge virale chez les animaux infectés par le VIH 1 fois par semaine après l'infection.
  2. Après le saignement rétroorbital (environ 100 l), obtenir du plasma en recueillant le supernatant après centrifugation du sang anticoagulé à 3 500 x g pendant 3 min dans un microcentrifugeur. La pastille est utilisée pour le phénotypage des cellules sanguines.
  3. Utilisez un kit commercial d'extraction d'ARN viral (voir Tableau des matériaux) pour obtenir de l'ARN à partir de 40 l de plasma.
  4. Convertir l'ARN en aDNc à l'aide du premier mélange de synthèse des souches (voir Tableau des matériaux)et de l'amorce de bâillon vih SK431.
  5. Effectuer des PCR quantitatifs en temps réel à l'aide d'amorces séropositives SK38/SK39 et de colorants verts fluorescents (p. ex., vert SYBR) tels que décrits dans les études précédentes13,25.

8. Administration d'un traitement antirétroviral

  1. Administrer la multithérapie orale au moins 3 semaines après l'infection, lorsqu'une charge virale élevée est observée, dans les modèles chroniques, aigus et de réactivation.
  2. Calculer les doses de ténofovir disoproxil fumarate (TDF), emtricitabine (FTC), et raltegravir (RAL), selon les valeurs Km de 37 et 3 pour les humains et les souris, respectivement26. Typiquement, les doses équivalentes humaines de TDF, FTC, et RAL sont 61.7 mg/kg/jour, 40.7 mg/kg/jour, et 164 mg/kg/jour, respectivement.
  3. Pour l'administration dans l'eau potable, écraser les comprimés de drogue et ajouter la quantité respective dans la bouteille d'eau, en veillant à ce que chaque souris dans la cage acquiert sa dose quotidienne. Puisque la poudre de drogue peut former des sédiments dans la bouteille, secouez périodiquement la bouteille d'eau pour obtenir une suspension homogène.
  4. Changez la bouteille d'eau chaque semaine avec des médicaments fraîchement dissous.
  5. Recueillir le sang par veine rétroorbitale chaque semaine ou toutes les 2 semaines après l'initiation de la multithérapie pour évaluer les changements dans la charge virale et le ratio CD4:CD8.

9. Euthanasie de souris, collecte des organes lymphoïdes secondaires, et isolement des cellules mononucléaires

  1. L'euthanasie est pratiquée dans les trois modèles de souris humanisés, périodiquement le long du temps d'infection, ou à la fin de l'expérience.
  2. Effectuer l'euthanasie des souris adultes par asphyxie au CO2, suivie de la luxation cervicale. Pour l'asphyxie, utilisez une chambre non préchargée, distribuez le CO2 d'un cylindre commercial avec régulateur à pression fixe et le limiteur de ligne contrôlant le flux de gaz dans un délai de 20 % à 30 % du volume de la chambre/minute pour se conformer aux lignes directrices de l'AVMA de 2013.
  3. Maintenir le débit de CO2 pour l'arrêt respiratoire de surveillance de la catégorie des 'gt;60's (qui peut prendre jusqu'à 5 min), suivi de la dislocation cervicale pour assurer l'euthanasie.
  4. Euthanasier les nouveau-nés de 7 jours par une méthode physique (c.-à-d. à l'aide de ciseaux pointus).
  5. Visualisez les ganglions lymphatiques axillaires, mediastinal et mésentériques (qui sont généralement observés) et extrayez-les avec des pinces à épiler et des ciseaux pointus. Extraire également la rate, située dans le côté supérieur gauche de la cavité péritonéale.
  6. Déposer les tissus lymphoïdes dans des tubes centrifugeurs de 1,5 ml contenant un milieu prieur stérile de RPMI 1640.
  7. Traiter immédiatement les tissus lymphoïdes dans une passoire à cellules en nylon de la taille d'un pore de 70 mm, en recueillant les cellules dans un tube de 50 ml. N'aspirez pas les tissus.
  8. Laver les cellules avec 5 ml de RPMI 1640 milieu complété par 1% FBS pour faciliter le filtrage des cellules.
  9. Après la désagrégation des tissus, centrifuger la suspension des cellules à 3 500 x g pendant 10 min dans un microcentrifugeur.
  10. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules avec 500 OL de 1x PBS.
  11. Transférer la suspension des cellules dans un tube centrifugeur de 1,5 ml contenant 500 l de milieu de gradient de densité stérile.
  12. Centrifugeuse à 3 500 x g pendant 3 min dans un microcentrifuge, sans frein, pour empêcher la couche bouffie de se mélanger avec le milieu de gradient de densité
  13. Recueillir soigneusement la fraction de cellules mononucléaires (entre le milieu de gradient de densité et le supernatant) et transférer la couche bouffie dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml contenant 500 l de 1x PBS. Centrifugeuse à 3 000 x g pendant 3 min.
  14. Enlever les globules rouges restants en lysing avec 500 L de tampon ACK, en couve pendant 4 min à RT.
  15. Centrifugeàeur à 3 000 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant et le resuspendre dans 1 ml de 1x PBS ou moyen.

Résultats

Comme décrit ci-dessus, à 14 semaines après l'injection de HSC (modèle chronique) ou à 3 semaines d'injection post-PBMC (modèles aigus et de réactivation), les souris sont saignées pour le dépistage du niveau d'engraftment des cellules humaines par cytométrie de flux. Une stratégie de gating représentative pour l'évaluation de 1) CD45 humainet la reconstitution des cellules et 2) le pourcentage de CD4 et de CD8et les lymphocytes T est indiqué dans la figure

Discussion

D'importants progrès ont été réalisés dans le développement de souches de souris immunodéficientes pour l'humanisation, avec un certain nombre d'options différentes qui peuvent être utilisées selon l'intérêt de la recherche1. Fourni ici est un protocole général pour l'humanisation des sourisnulles n.-chaîne NS et souches génétiquement similaires à employer dans trois modèles différents pour étudier l'infection par le VIH. Dans la première approche expérimentale, l...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des fonds internes de la division clinique IHV à JCZ.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubesNeptune3745.S.X
10 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0010
15 ml conical tubesStellar scientificT15-600
25 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0025
5 ml Serologial pipetesstellar sceintificVL-4090-0005
50 ml conical tubesStellar scientificT50-600
ACK lysis bufferQuality biological118-156-101
Alcohol prep padsFisher scientific06-669-62Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1Biolegend300439APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4Biolegend317420AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1Biolegend368522BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
BonnetFisher scientific17-100-900Single use cap for basic protection
CavicideMetrex13-1000Surface desinfectant
CD34+ cellsLonza2C-101As many vials available from a single donor
CentrifugeBeckman65-6KR
Clear jarAmazon77977
Cotton gauze padFisher scientific22-415-468Sterile
Disposable lab coatsFisher scientific19-472-422
EDTA micro tubesGreiner bio-one450480
Face MaskFisher scientific17-100-897
FACS lysing solutionBD340202
FBS premium HIAtlanta biologicalsS1115OH
FicollGE health one17-1440-02
Flow cytometerWe used FACS Aria II
Flow cytometry tubesFalcon3520545 ml polystyrene and round bottom
HIV BaLPrepared in our uQUANT core facility
Human PBMCsHIV positive and negative volunteers
Infrared warming padVenet scientificDCT-25Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I irradiatorEquipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
MicrocentrifugeEppendorf
Mouse ear tagsNational Band & Tag company1005-1L1
Natelson blood collection tubesFisher scientific02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
NSG miceJackson5557Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3Jackson13062
Paraformaldehyde 16%Electron microscopy sciences15710
PBS 1X pH 7.4Gibco100-10-023
Petri dishesFisher scientific08-757-28
Quantistudio qPCR machineThermoQS3
Reagent reservoirsCostar4870
RPMI media 1640 1XGibco11875-093
Shoe coversFisher scientific17-100-911
Sterile disposable GlovesMicroflexSUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMixInvitrogen10080-400cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2BD329-461
Syringes 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabine and TenofovirGileadNDC 61958-0701-1Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blueSigmaT8154Cell count and viability
Vick VaporubSchool health43214Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology gradeQuality biological351-029-131

Références

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