Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Tiyorbitürik asit reaktif madde tahlilinin amacı, 532 nm'de görünür dalga boyu spektrofotometrisi kullanarak, öncelikle malondialdehit olmak üzere lipid peroksidasyon ürünlerinin üretimini ölçerek biyolojik numunelerdeki oksidatif stresi değerlendirmektir. Burada açıklanan yöntem insan serumu, hücre lysates ve düşük yoğunluklu lipoproteinlere uygulanabilir.

Özet

Sınırlı analitik özgüllüğüne ve sağlamlığına rağmen, tiyobakroturik asit reaktif maddeleri (TBARS) tahlili, biyolojik sıvılarda lipid peroksidasyonunun jenerik ölçümü olarak yaygın olarak kullanılmıştır. Genellikle, numunenin düzgün bir şekilde ele alınması ve depolanmış olması koşuluyla, biyolojik bir numune içindeki oksidatif stres seviyelerinin iyi bir göstergesi olarak kabul edilir. Test, lipid peroksidasyon ürünlerinin, özellikle malondialdehitin (MDA), TBARS adı verilen MDA-TBA2 adducts oluşumuna yol açan tiyorbitürik asit (TBA) ile reaksiyonunu içerir. TBARS, spektrofotometrik olarak 532 nm'de ölçülebilen kırmızı-pembe bir renk verir. TBARS tahlili asidik koşullar altında (pH = 4) ve 95 °C'de gerçekleştirilir. Saf MDA kararsızdır, ancak bu koşullar, bu yöntemde analitik standart olarak kullanılan MDA bis'ten (dimetil asetal) MDA'nın serbest bırakılmasına izin verir. TBARS tahlil, yaklaşık 2 saat içinde tamamlanabilen basit bir yöntemdir. Test reaktiflerinin hazırlanması burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bütçe bilincine sahip araştırmacılar, bu reaktifleri yalnızca tek bir standart eğrinin inşasına izin veren pahalı bir TBARS test kiti satın almak yerine düşük maliyetle birden fazla deney için kullanabilirler (ve bu nedenle yalnızca bir deney için kullanılabilir). Bu TBARS testinin uygulanabilirliği insan serumunda, düşük yoğunluklu lipoproteinlerde ve hücre lysates'lerinde gösterilmiştir. Test tutarlı ve tekrarlanabilir ve 1.1 μM algılama sınırlarına ulaşılabilir. Spektrofotometrik TBARS testinin kullanımı ve yorumlanması için öneriler sunulmaktadır.

Giriş

Lipid peroksidasyonu, reaktif oksijen türleri ve reaktif azot türleri gibi serbest radikallerin lipitlerdeki karbon-karbon çift bağlarına saldırdığı, bir hidrojenin karbondan soyutlanması ve bir oksijen molekülünün yerleştirilmesini içeren bir süreçtir. Bu işlem, birincil ürünler olarak lipid peroksil radikalleri ve hidroperoksitlerin yanı sıra malondialdehit (MDA) ve baskın ikincil ürünler olarak 4-hidroksinononal dahil olmak üzere karmaşık ürünlerin bir karışımına yol açar1.

MDA, tiaobarbitürik asit (TBA) ile olan facile reaksiyonu nedeniyle lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olarak biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Reaksiyon, 532 nm'de görünür spektrumda emilen ve kırmızı-pembe bir renk2 üreten bir konjuge olan MDA-TBA2 oluşumuna yol açar. MDA'nın yanı sıra lipid peroksidasyonundan elde edilen diğer moleküller de TBA ile reaksiyona alabilir ve 532 nm'de ışığı emerek ölçülen genel emilim sinyaline katkıda bulunabilir. Benzer şekilde, MDA diğer ana biyomolekül sınıflarının çoğuyla reaksiyona girerek TBA3,4 ile reaksiyona erişilebilirliğini potansiyel olarak sınırlayabilir. Bu nedenle, bu geleneksel test sadece "tiyobakroturik asit reaktif maddeleri" veya TBARS5'i ölçmek için kabul edilir.

Doğru uygulandığında ve yorumlandığında, TBARS tahlili genellikle biyolojik bir örnekteki genel oksidatif stres seviyelerinin iyi bir göstergesi olarak kabul edilir6. Ne yazık ki, Khoubnasabjafari ve diğerleri tarafından belgelenen TBARS tahlilleri genellikle şüpheli sonuçları kolaylaştıracak şekilde yürütülür ve yorumlanır3,4,7,8,9,10,11. Bunun nedenleri öncelikle örnekle ilgili ön analitik değişkenlere ve tahlil sonuçlarında önemli değişiklikler olmadan test protokolünde görünüşte küçük varyasyonları yasaklayan test sağlamlığı eksikliğine dayanır1,7,12,13.

Biyospepsimen elleçleme ve depolama ile ilgili preanalitik değişkenler (örneğin, geçici olarak -20 °C'de tutulan kan plazması)14,15 TBARS tahlil sonuçları üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir16,17; öyle ki, TBARS test sonuçları, açık detaylandırıcı analitik doğrulama verileri tarafından garanti edilmediği sürece farklı laboratuvarlarda karşılaştırılmamalıdır. Bu öneri, batı lekelerinin yaygın olarak nasıl kullanıldığına ve yorumlandırıldığına benzer. Bant yoğunluklarının karşılaştırılması leke içi ve belki de laboratuvar içi çalışmalar için geçerlidir, ancak laboratuvarlar arasındaki bant yoğunluklarının karşılaştırılması genellikle geçersiz bir uygulama olarak kabul edilir.

Bazı araştırmacılar, TBARS testi tarafından ölçülen MDA'nın kabul edilebilir bir biyobelirteç3,9,10,18,19'un gerektirdiği analitik veya klinik kriterleri karşılamadığını öne sürmektedir. Nitekim, tahlil 50 yıl önce geliştirilmeseydi, muhtemelen bugünkü yaygın kullanım ve zımni kabul edilebilirliği kazanamayacaktı. Oksidatif stresin belirlenmesinde kullanılan daha fazla analitik hassasiyet, özgüllük ve sağlamlığa sahip başka tahliller olmasına rağmen, 532 nm'deki absorbansa dayanan TBARS tahlilleri, lipid peroksidasyon20'nin belirlenmesi ve böylece oksidatif stresin değerlendirilmesi için açık ara en sık kullanılan tahlillerden biri olarak kalmaktadır.

TBARS tahlilleri sadece, talimatların kullanılan reaktiflerin çoğu konsantrasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlamadığı pahalı bir kit (400 ABD dolarının üzerinde) olarak bulunabilir. Ayrıca, sağlanan reaktifler yalnızca bir deneme için kullanılabilir, çünkü kit başına yalnızca bir kolorimetrik standart eğri yapılabilir. Bu, farklı zaman noktalarında birkaç örnek içinde oksidasyon seviyelerini belirlemeyi amaçlayan araştırmacılar için sorunlu olabilir, çünkü aynı standart eğri birden çok kez kullanılamaz. Bu nedenle, birden fazla deney için birden fazla kit satın alınması gerekir. Şu anda, pahalı bir kit satın alınmadığı sürece, TBARS testini nasıl gerçekleştireceklerine dair ayrıntılı bir protokol yoktur. Geçmişte bazı araştırmacılar bir TBARS tahlilinin nasıl gerçekleştirildiğini belirsiz bir şekilde tanımlamıştır21,22, ancak TBARS tahlilinin pahalı bir kit olmadan nasıl yürütüleceklerine dair tam ayrıntılı bir protokol veya kapsamlı bir video literatürde mevcut değildir.

Burada, TBARS testlerinin basit, tekrarlanabilir ve ucuz bir şekilde nasıl gerçekleştirilacağı hakkında ayrıntılı, analitik olarak doğrulanmış bir amaç için metodoloji rapor ediyoruz. Cu(II) iyonları ile tedavi üzerine insan serumu, HepG2 lisates ve düşük yoğunluklu lipoproteinlerin lipid peroksidasyonundaki değişiklikler TBARS testi için açıklayıcı uygulamalar olarak gösterilmiştir. Sonuçlar, bu TBARS tahlilinin günlük olarak tutarlı ve tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir.

Protokol

İnsan serum örnekleri, IRB onayı altında ve Helsinki Bildirgesi'nde ifade edilen ilkelere göre rıza gösteren gönüllülerden elde edilmiştir. Numuneler analitik laboratuvara transferden önce kodlandı ve kimliksiz bırakıldı.

1. Numune hazırlama

  1. HepG2 hücreli lysates
    1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 14 mL EMEM ortamlı 16 T75 şişede şişe başına yaklaşık 10 x 106 HepG2 hücresi tohum ve 2 gün boyunca hücre yetiştirin.
    2. RIPA tamponu hazırlayın: 50 mL'lik bir tüpte, 1,5 mL 5 M NaCl, 2,5 mL 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL NP-40 reaktif ekleyin, ardından di suyu ile son hacmi 50 mL'ye getirin.
    3. Lizis tamponu hazırlayın: 50 mL'lik bir tüpe 20 mL RIPA tamponu aliquot ve protein ve lipid bozulmasını inhibe etmek için 100x proteaz inhibitör çözeltisinin 200 μL'si ekleyin. 4 °C'de saklayın.
      NOT: Lizis tamponu TBARS reaktifleri ile uyumludur ve 532 nm'de emiciliği engellemez. Farklı bir lizis tamponu kullanmayı veya lizis arabelleğine ek bileşenler eklemeyi planlıyorsanız, lizis tampon bileşenlerinin TBARS test ile uyumlu olduğunu doğrulamak için ön doğrulama çalışmalarının yapılması gerekir.
    4. %10 FBS içeren ortamı çıkarın ve hücreleri 5 mL soğuk, steril 1x PBS ile 2x yıkayın.
    5. Hücreleri içeren T75 şişelerine 1 mL lizis tamponu ekleyin ve tamponun iyi dağıtıldığından emin olmak için oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca sürekli girdapla kuluçkaya yatırın.
    6. Lysates'i uygun şekilde etiketlenmiş 2 mL snap-cap polipropilen tüplere toplayın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    7. Hücre kalıntılarını toplamak için RT'de 10 dakika boyunca 5.000 x g'da lilaları döndürün ve süpernatantları tek bir 15 mL tüpe emişli.
    8. 50 °C ve 3 mbar'da bir Speed Vac kullanarak hücre lisat süpernatant dört kat konsantre edin ve her biri 94 μL'lik aliquot'ları 2 mL snap-cap polipropilen tüpler haline getirin. Numuneleri in vitro oksidasyon ve/veya TBARS tahlilinde kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.
      NOT: Hücre lisat süpernatantının konsantre olmasını önlemek için, hücreler ayrıca 3 mL 1x tripsin kullanılarak ayrılabilir, 6 mL ortamla nötralize edilebilir ve 5 mL soğuk PBS ile 2x yıkanabilir. Hücre peletleri daha sonra 250 μL lizis tamponunda yeniden inşa edilebilir ve 1.1.6 ve 1.1.7 adımları gerçekleştirilebilir.
    9. Asetik asitte 35 mM CuCl2 stok çözeltisi hazırlayın (pH = 4).
      1. Asetik asit çözeltisi hazırlayın (pH = 4): 100 mL DI suda 1 μL buzul asetik asetik asidi seyreltin (pH yaklaşık 4 olmalıdır, ancak bunu bir pH metre ile onaylayın). pH'ı 4'e ayarlamak için daha fazla su veya asetik asit ekleyin.
      2. Yaklaşık 0.1936 g bakır II klorür ağırlığı ve 144 mM CuCl2 stoğu yapmak için asetik asit çözeltisinin (pH = 4) 10 mL'sinde çözünür. Bu çözeltiden Aliquot 490 μL ve 35 mM CuCl2 çözeltisi yapmak için 1.510 μL asetik aside (pH = 4) ekleyin.
    10. 35 mM CuCl2 stok çözeltisinden Aliquot 6 μL ve yaklaşık 2 mM'lik son bir CuCl2 konsantrasyonu yapmak için 94 μL hücre lisat içeren altı örneğe ekleyin. Kontrol olarak kullanmak için 94 μL hücrelysates içeren altı örneğe CuCl2 içermeyen 6 μL asetik asit çözeltisi (pH = 4) ekleyin. Hücre lisatının son hacmi 100 μL olmalıdır, bu da TBARS tahlilinde kullanılacak olandır.
      NOT: Bakır hidroksit çökeltisini önlemek için 35 mM CuCl2 stok çözeltisinin asetik asitte (pH = 4) yapılması gereklidir.
    11. Numuneleri 37 °C'deki bir fırında 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve her numunede 100 μL'lik son bir hacim içeren bir TBARS tahlil işlemi gerçekleştirin.
    12. HepG2 hücreli elysatlar için TBARS testinin tekrarlanabilirliğini kontrol etmek için ayrı günlerde 1.1.9 ve 1.1.11 2x adımlarını yineleyin.
  2. Düşük yoğunluklu lipoproteinler
    NOT: Tipik olarak, önceden saflaştırılmış düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) bir miktar EDTA içerir. Burada kullanılan LDL örnekleri %0.01 EDTA içerir. EDTA, LDL'nin in vitro Cu(II) aracılı oksidasyonunu engelleyebilir. Bu nedenle, deneylerden veya analizlerden önce LDL örneklerinden EDTA'yı çıkarmak gerekebilir. Adım 1.2.1–1.2.5 bu işlemi açıklar.
    DİkKAT: Sodyum hidroksit aşındırıcıdır ve ciltte ve gözlerde tahrişe neden olur. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
    1. 5,51 mg/mL LDL stoktan Aliquot 24 μL (standart olarak BSA kullanılarak modifiye Lowry yöntemiyle belirlenen protein konsantrasyonu) uygun şekilde etiketlenmiş 1 mL snap-cap polipropilen tüplere. Gerektiği kadar aliquot yapın ve oksidasyon ve/veya TBARS testinde kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
    2. 0,15 M NaCl'de 10 mM HEPES tamponu hazırlayın, naoh boncuklarla pH = 7'ye ayarlanmış: 4,39 g NaCl'yi 0,49 L suda çözün, ardından 1,19 g HEPES ekleyin. Bir karıştırma çubuğu ile iyice çözün. pH 7 olana kadar sodyum hidroksit boncukları ekleyin. Su ile 0,5 L'ye seyreltin. Tamponu 4 °C'de saklayın ve 3 ay içinde kullanın.
    3. Son hacmi 500 μL'ye getirmek için aliquoted LDL örneklerine 0,15 M NaCl (pH = 7) içinde 10 mM HEPES tamponunun 476 μL'sini ekleyin. Seyreltilmiş LDL örneğini 100K moleküler ağırlık kesmeli 0,5 mL santrifüj dönüş filtresi cihazına ekleyin.
    4. RT'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da dönüş örnekleri, yaklaşık 30 μL'lik son bir retentate hacmi bırakır. Örnekleri 0,15 M NaCl (pH = 7) 10 mM HEPES arabelleğin 480 μL'sinde yeniden inşa edin ve RT'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da tekrar döndürün.
    5. Filtre cihazını baş aşağı yeni bir 2 mL snap-cap polipropilen tüpüne yerleştirin ve LDL örneğini toplamak için 2 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüj (son hacim = yaklaşık 30 μL).
    6. Aliquot numunesi uygun şekilde etiketlenmiş 1 mL tüpe ve 50 μL'lik son bir hacim elde etmek için her numuneye 20 μL su ekleyin.
    7. Asetik asitte 200 μM CuCl2 stok çözeltisinin hazırlanması (pH = 4)
      1. Asetik asit çözeltisi hazırlayın (pH = 4): bkz. adım 1.1.9.1.
      2. 144 mM CuCl2 stok çözeltisi hazırlayın (bkz. adım 1.1.9.2), ardından 144 mM CuCl2 stoğundan aliquot 5.5 μL ve 200 μM çözeltisini yapmak için 4 mL asetik asit (pH = 4) son hacimde çözün.
    8. 200 μM CuCl2 stok çözeltisinden Aliquot 2.7 μL ve ~10 μM'lik son bir CuCl2 konsantrasyonu elde etmek için 50 μL LDL içeren altı numuneye ekleyin. Kontroller için kullanılacak 50 μL LDL içeren altı numuneye CuCl2 içermeyen bir asetik asit çözeltisinden (pH = 4) 2,7 μL ekleyin.
    9. LDL örneklerini 37 °C'deki bir fırında 2 saat boyunca kuluçkaya yatırın. 2 saat sonra, 0,15 M NaCl'de (pH = 7) 10 mM HEPES tamponu olan her numune için son hacmi 100 μL'ye getirin. Hemen bir TBARS tahlil gerçekleştirin.
    10. TBARS testinin yeniden üretilme yeteneğini test etmek için iki farklı günde 1.2.3–1.2.9 2x adımlarını yineleyin.
  3. İnsan serumu
    1. Bir insan serum örneğinden, her biri 94 μL'lik aliquot'ları 2 mL snap-cap polipropilen tüpler haline getirin ve örnekleri -80 °C'de saklayın.
    2. Asetik asitte (pH = 4) 35 mM CuCl2 stok çözeltisi hazırlayın: bkz.
    3. CuCl2 stok çözeltisinden Aliquot 6 μL ve yaklaşık 2 mM'lik son bir CuCl2 konsantrasyonu yapmak için 94 μL insan serumu içeren altı örneğe ekleyin. Kontrol olarak kullanmak için 94 μL insan serumu içeren altı örneğe CuCl2 içermeyen 6 μL asetik asit çözeltisi (pH = 4) ekleyin.
    4. İnsan serumu örneklerini 37 °C'de bir fırında 24 saat kuluçkaya yatırın ve TBARS tahlil ile oksidasyon seviyelerini belirleyin (bölüm 4).
    5. TBARS testinin tekrarlanabilirliğini belirlemek için 1.3.2–1.3.4 2x adımlarını iki ayrı günde yineleyin.

2. Reaktif hazırlama

DİkKAT: Tiobarbitürik asit cilt ve göz tahrişi neden olur ve belki de inhalasyon veya cilt emilimi ile zararlıdır. Asetik asit solunursa iç organlara zarar verebilir. Tüm asit çözeltilerini bir duman kaputunda hazırlayın.

  1. %8,1 sodyum dodecylsulfate (SDS) çözeltisinin hazırlanması
    1. 32,4 g SDS ağırlığı ve bir beherde 350 mL DI suyunda çözün. SDS'yi nazikçe çözmek ve kabarcık yapmaktan kaçınmak için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. DI suyu ile son hacmi 400 mL'ye getirin ve SDS çözümünü RT'de saklayın.
      NOT: Burada% 8,1'lik fazla SDS çözeltisi hazırlanır; ancak, 96 numune için% 8.1 SDS çözümünün sadece yaklaşık 20 mL'sına ihtiyaç vardır. Bu çözümü analiz edilen numune sayısına göre hazırlayın.
  2. 3,5 M sodyum asetat tamponunun hazırlanması (pH = 4)
    1. 100 mL buzul asetik asetikini bir beherde 350 mL DI suda seyreltin. Hafifçe çözmek için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın.
    2. Suda sodyum hidroksit boncukları kullanarak 6,5 M NaOH çözeltisi hazırlayın. 13 g NaOH boncuklarını 40 mL DI suda çözün ve DI suyu ile 50 mL'lik son hacme getirin.
    3. Karıştırma çubuğuyla karıştırırken asetik asit çözeltisine 6,5 M NaOH çözeltisinin yaklaşık 46 mL'lik kısmını yavaşça ekleyin (bu pH'ı 4'e yükseltmelidir, ancak bir pH ölçer kullanarak ölçüm yaparken NaOH çözeltisini yavaşça ekleyerek onaylayın).
    4. DI su ile son hacmi 500 mL'ye getirin ve RT'de sodyum asetat tamponu depolayın.
  3. Tikobarbitürik asidin % 0.8 sulu çözeltisinin hazırlanması (pH = 4'e göre ayarlanır)
    NOT: Bu adımda, tiyobakroturik asit hazırlanması büyük hacimler için optimize edilmiştir, çünkü çok sayıda numune analiz edilecektir (standartlar dahil olmayan 108 örnek). Analiz için planlanan numune sayısına bağlı olarak bu çözümü hazırlayın.
    1. Sodyum hidroksit boncukları ve su kullanarak 5 M sodyum hidroksit çözeltisi hazırlayın: 4 g sodyum hidroksit boncuklarını 20 mL su hacminde çözün. Plastik bir kapta saklayın. Bu çözelti her parti için taze olarak hazırlanmalıdır.
    2. Ağırlık 4 g tiobarbitürik asit ve 450 mL DI suyu ekleyin. Hafifçe çözmek için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın.
      NOT: Bu çözüm sonunda 500 mL toplam hacme getirilecektir.
    3. Tiyobakrotik asidi bir karıştırma çubuğuyla çözerken, 5 M NaOH çözeltisinin yaklaşık 3 mL'lik kısmını 100 μL'lik artışlarla ekleyin (yavaşça ve damla gibi). NaOH çözeltisini ekledikten sonra, tiyobakrotürik asit parçacıkları çözülmeye başlayacaktır.
    4. Tiyobakrolik asit parçacıkları hala tam olarak çözülmemişse, tüm tiyobakürik asit parçacıkları tamamen çözünene kadar 100 μL artışlarla 5 M NaOH çözeltisinin daha fazlasını ekleyin. Bu özel çözelti hacmi için, tiyobakürik asit parçacıklarını tamamen çözmek için 5 M NaOH çözeltisinin toplam 4 mL'si eklenir.
      NOT: Bu konsantrasyonda, pH neredeyse 4 olmadıkça tiyobakroturik asit tam olarak çözülmez.
    5. Tüm tiyobakürik asit tamamen çözüldükten sonra NaOH eklemeyi bırakın. pH'ı 4'e aşmaktan kaçının. Son pH, karıştırma tiyorbitürik asit çözeltisinden 1 μL alınarak ve pH kağıdına yerleştirilerek doğrulanabilir.
    6. DI suyu ile son hacmi 500 mL'ye getirin ve sulu% 0,8 tiobarbitürik asit çözeltisini RT'de saklayın.

3. Malondialdehit bis (dimetil asetal) standart numune hazırlama

NOT: Malondialdehit (MDA) kararsızdır ve ticari olarak mevcut değildir. Bununla birlikte, MDA tetrabutylammonium tuzu, MDA bis (dimetil asetal) ve MDA bis (dietil asetal) gibi ticari olarak mevcut olan farklı kimyasal MDA formları vardır. Bu üç kimyasal formdan MDA bis (dimetil asetal) burada kullanılır, çünkü çalışmaların çoğunluğu aynı standardı kullanır21,22. MDA'nın diğer iki kimyasal formunu kullanmayı seçerseniz, uygunluklarının önceden doğrulanması yapılmalıdır.

  1. 1 L DI suda 92 μL saf MDA bis (dimetil asetal) seyrelterek 550 μM MDA bis (dimetil asetal) stok çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 10 dakika boyunca iyice karıştırmak için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın ve 1 ay içinde kullanın.
  2. 1274 μL DI suyundaki 550 μM MDA bis (dimetil asetal) stoktan 726 μL seyrelterek 200 μM MDA bis (dimetil asetal) hazırlayın. Bu 200 μM MDA bis (dimetil asetal) çözeltisi her TBARS tahlili gerçekleştirişlerinde taze olarak hazırlanmalıdır.
  3. Standart eğri hazırlığı: sekiz 2 mL snap-cap polipropilen tüpü alın ve A'dan H'ye kadar harflerle etiketleyin 200 μM stoktan MDA bis (dimetil asetal) ekleyin ve Tablo 1'de açıklandığı gibi suda seyreltin.
  4. Sekiz cam tüp (13 mm x 100 mm) alın ve A-H olarak etiketleyin, ardından ilgili tüplere 100 μL standart ekleyin. TBARS testinin algılama sınırlarını hesaplamak için boş standart (örnek A) için altı çoğaltma gerçekleştirin.
    NOT: Protokol burada en fazla 1 saat duraklatılabilir.

4. TBARS tahlil

NOT: TBARS teste başlandıktan sonra durmaksızın bitirilmelidir.

  1. Analiz edilecek numune sayısı için gerektiği kadar cam tüp alın ve örneklerin isimleriyle etiketleyin. Ardından, her cam tüpe hazırlanan her numuneden (yukarıda açıklandığı gibi) 100 μL ekleyin.
  2. Her numuneye ve standarda 200 μL% 8,1 SDS ekleyin ve numuneyi karıştırmak için cam tüpü dairesel bir hareketle hafifçe döndürün.
  3. Her numuneye ve standarda 3,5 M sodyum asetat tamponunun (pH = 4) 1,5 mL'lik kısmını ekleyin.
  4. Her numuneye ve standarda sulu %0,8 tiobarbitürik asit çözeltisinin (pH = 4) 1,5 mL'sini ekleyin.
  5. 700 μL DI su ekleyerek her numune ve standart için son hacmi 4 mL'ye getirin.
  6. Her bir cam tüpü sıkıca kaplayıp 1 saat boyunca 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda kuluçkaya yaslanın. Tüplerin üst kısımlarında yoğuşma olmaması için cam tüpleri alüminyum folyo ile örtün.
  7. Cam tüpleri ısıtma bloğundan çıkarın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  8. 4 °C'de 10 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüj numuneleri ve standartları. Santrifüjlemeden sonra, numuneleri ve standartları içeren cam tüpleri RT'de tutun.
    NOT: Numunelerin buzda veya 4 °C'de tutulması, numunenin veya standardın tamamının çökeltme yapmasına neden olur.
  9. Santrifüjlemeden hemen sonra, her tüpten 150 μL süpernatant aliquot ve 96 kuyu plakasının ayrı bir kuyusuna yerleştirin.
  10. Pipet ucu kullanarak her kuyudan kabarcıkları çıkarın.
    NOT: Kabarcıkların varlığı tutarsız absorbans okumaları verecek ve yüksek tahlil imprecision yol açacaktır.
  11. Absorbansları 532 nm'de okuyun. Diğer tüm absorbans okumalarından boş örneklerin ortalama absorbans okumasını çıkarın.
  12. Her standardın bilinen konsantrasyonuna karşılık 532 nm'de boş çıkarılan absorbans okumalarını çizerek standart bir eğri oluşturun. Doğrusal regresyon kullanarak veri noktalarını sığdırın. Standart eğriden elde edilen doğrusal regresyon çizgisinin denklemini kullanarak bilinmeyen örnek konsantrasyonlarını hesaplayın.

Sonuçlar

Asidik koşullar altında (pH = 4) ve 95 °C'de malondialdehit (MDA) bis (dimetil asetal) MDA23 verir. MDA ve yakından ilişkili kimyasal konjenerler, kırmızı-pembe bir renk veren ve 532 nm'de emilme φmax'a sahip olan tiyobakrbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) adı verilen bileşikler üretmek için iki tiyorbitürik asit (TBA) molekülü ile reaksiyona sahiptir (Şekil 1, Şekil 2). Standart olarak MDA bis (dimetil as...

Tartışmalar

Sınırlamalarına rağmen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 ve laboratuvarlar arasında karşılaştırmaya uygunluk eksikliği, TBARS tahlil en

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak rakip finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Burada bildirilen araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından ödül no altında desteklendi. R33 CA217702 ve Öğrenci Gelişimini En Üst Düzeye Çıkarma Girişimi (IMSD) programı. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşünü temsil etmek zorunda değildir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 LVWR, PA101642--262cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tubeCorning, NYCLS430897General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterileThermo Fisher Scientific, MA280895To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter deviceFisher Scientific, NHUFC510024LDL purification
Caps for glass tubesThermo Fisher Scientific, MA14-930-15Dfor TBARS assay
Copper II ChlorideSIGMA, MO222011-250Gto induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)VWR, PA53283-800for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC, VAHB-8065HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLeppendorf, NY22363204General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLGenesee Sceitific, CA22363352General material
Fetal Bovine Serum US SourceOmega Scientific, CAFB-11for cell culture
Glacial Acetic AcidSIGMA, MO27225-1L-RTBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)Thermo Scientific, MA87786cell lysis reagent
HEPESSIGMA, MOH3375-250GLDL solvent
HepG2 CellsATCC, VAHB-8065Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl)Fisher Scientific, NHA144-212cell lysis reagent
Legend Micro 17 CentrifugeThermo Scientific, MA75002431General material
Low Density Lipoprotein, Human PlasmaAthens Research & Technology, GA12-16-120412Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-AssortmentVWR, PA58948-025General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)SIGMA, MO8207560250TBARS Standard
Multiskan Go Microplate SpectrophotometerFisher Scientific, NH51119200To measure absorbance
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100MLcell lysis reagent
Sodium ChlorideSIGMA, MOS7653-1KGcell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS)SIGMA, MO436143-100GTBARS Reagent
Sodium hydroxideSIGMA, MO367176-2.5KGTBARS Reagent
SpeedVac ConcentratorThermo Scientific, MASC250EXPFor concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter capUSA Scientific, FL658175cell culture
Thiobarbituric AcidSIGMA, MOT5500-100GTBARS Reagent
TRIS baseFluka, GA93362cell lysis reagent
Trypsin (1x)VWR, PA16777-166To detach HepG2 cells

Referanslar

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K., Armstrong, D. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

KimyaSay 159tiyobak rik asit reaktif maddelerTBARSoksidasyonlipid peroksidasyonmalondialdehitMDAtiobarbit rik asitTBAoksidatif stres

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır