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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Ziel des Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assays ist es, oxidativen Stress in biologischen Proben zu bewerten, indem die Produktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd, unter Verwendung der Spektrophotometrie der sichtbaren Wellenlänge bei 532 nm gemessen wird. Die hier beschriebene Methode kann auf menschliches Serum, Zelllysate und Lipoproteine niedriger Dichte angewendet werden.

Zusammenfassung

Trotz seiner begrenzten analytischen Spezifität und Robustheit wurde der Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) Assay weit verbreitet als generische Metrik der Lipidperoxidation in biologischen Flüssigkeiten verwendet. Es wird oft als ein guter Indikator für den Grad des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe angesehen, vorausgesetzt, die Probe wurde ordnungsgemäß gehandhabt und gelagert. Der Assay beinhaltet die Reaktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd (MDA), mit Thiobarbitursäure (TBA), was zur Bildung von MDA-TBA2-Addukten namens TBARS führt. TBARS ergibt eine rot-rosa Farbe, die spektralphotometrisch bei 532 nm gemessen werden kann. Der TBARS-Assay wird unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C durchgeführt. Reines MDA ist instabil, aber diese Bedingungen erlauben die Freisetzung von MDA aus MDA-Bis (Dimethylacetal), das als analytischer Standard in dieser Methode verwendet wird. Der TBARS-Assay ist eine einfache Methode, die in etwa 2 h abgeschlossen werden kann. Die Herstellung von Assay-Reagenzien wird hier ausführlich beschrieben. Budgetbewusste Forscher können diese Reagenzien für mehrere Experimente zu geringen Kosten verwenden, anstatt ein teures TBARS-Assay-Kit zu kaufen, das nur die Konstruktion einer einzigen Standardkurve erlaubt (und somit nur für ein Experiment verwendet werden kann). Die Anwendbarkeit dieses TBARS-Assays wird in humanem Serum, Lipoproteinen niedriger Dichte und Zelllysaten gezeigt. Der Assay ist konsistent und reproduzierbar, und es können Nachweisgrenzen von 1,1 μM erreicht werden. Es werden Empfehlungen für die Verwendung und Interpretation des spektralphotometrischen TBARS-Assays gegeben.

Einleitung

Lipidperoxidation ist ein Prozess, bei dem freie Radikale, wie reaktive Sauerstoffspezies und reaktive Stickstoffspezies, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in Lipiden angreifen, ein Prozess, der die Abstraktion eines Wasserstoffs aus einem Kohlenstoff und die Insertion eines Sauerstoffmoleküls beinhaltet. Dieser Prozess führt zu einer Mischung komplexer Produkte, einschließlich Lipidperoxylreste und Hydroperoxide als Primärprodukte sowie Malondialdehyd (MDA) und 4-Hydroxynonenal als vorherrschende Sekundärprodukte1.

MDA wurde in der biomedizinischen Forschung aufgrund seiner einfachen Reaktion mit Thiobarbitursäure (TBA) häufig als Marker für die Lipidperoxidation verwendet. Die Reaktion führt zur Bildung von MDA-TBA2, einem Konjugat, das im sichtbaren Spektrum bei 532 nm absorbiert und eine rot-rosa Farbe erzeugt2. Andere Moleküle, die neben MDA aus der Lipidperoxidation stammen, können ebenfalls mit TBA reagieren und Licht bei 532 nm absorbieren, was zum gemessenen Gesamtabsorptionssignal beiträgt. In ähnlicher Weise kann MDA mit den meisten anderen wichtigen Klassen von Biomolekülen reagieren, was möglicherweise seine Zugänglichkeit für die Reaktion mit TBA3,4 einschränkt. Daher wird dieser traditionelle Assay einfach als Messung von "Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen" oder TBARS5 betrachtet.

Bei richtiger Anwendung und Interpretation wird der TBARS-Assay im Allgemeinen als guter Indikator für den Gesamtgehalt des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe angesehen6. Leider, wie von Khoubnasabjafari und anderen dokumentiert, wird der TBARS-Assay oft auf eine Weise durchgeführt und interpretiert, die zweifelhafte Schlussfolgerungen ermöglicht3,4,7,8,9,10,11. Die Ursachen dafür liegen in erster Linie in probenbezogenen präanalytischen Variablen und einem Mangel an Assay-Robustheit, der scheinbar geringfügige Variationen im Assay-Protokoll ohne wesentliche Änderungen der Assay-Ergebnisse verbietet1,7,12,13.

Präanalytische Variablen im Zusammenhang mit der Handhabung und Lagerung von Bioproben (z. B. Blutplasma, das vorübergehend bei -20 °C gehalten wird)14,15 können einen großen Einfluss auf die TBARS-Testergebnisse haben16,17; so sehr, dass TBARS-Assay-Ergebnisse nicht zwischen verschiedenen Labors verglichen werden sollten, es sei denn, dies wird durch explizite analytische Validierungsdaten zwischen den Labors gerechtfertigt. Diese Empfehlung ähnelt der Art und Weise, wie Western Blots häufig verwendet und interpretiert werden. Vergleiche der Banddichten gelten für Studien innerhalb des Blots und vielleicht innerhalb des Labors, aber der Vergleich der Banddichten zwischen Laboratorien wird im Allgemeinen als ungültige Praxis angesehen.

Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass MDA, gemessen mit dem TBARS-Assay, einfach nicht die analytischen oder klinischen Kriterien erfüllt, die für einen akzeptablen Biomarker erforderlich sind3,9,10,18,19. In der Tat, wenn der Assay nicht vor über 50 Jahren entwickelt worden wäre, hätte er wahrscheinlich nicht die weit verbreitete Verwendung und stillschweigende Akzeptanz erlangt, die er heute hat. Obwohl es andere Assays mit größerer analytischer Sensitivität, Spezifität und Robustheit gibt, die zur Bestimmung von oxidativem Stress verwendet werden, bleibt der TBARS-Assay, der auf der Absorption bei 532 nm basiert, bei weitem einer der am häufigsten verwendeten Assays zur Bestimmung der Lipidperoxidation20 und damit zur Bewertung von oxidativem Stress.

Der TBARS-Assay ist nur als teures Kit (über 400 US-Dollar) zu finden, in dem die Anleitung keine detaillierten Informationen über die meisten Konzentrationen der verwendeten Reagenzien liefert. Darüber hinaus können die bereitgestellten Reagenzien nur für ein Experiment verwendet werden, da nur eine kolorimetrische Standardkurve pro Kit hergestellt werden kann. Dies kann für Forscher problematisch sein, die beabsichtigen, den Oxidationsgrad innerhalb weniger Proben zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, da die gleiche Standardkurve nicht mehrmals verwendet werden kann. Daher müssen mehrere Kits für mehrere Experimente gekauft werden. Derzeit gibt es kein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines TBARS-Assays, es sei denn, es wird ein teures Kit gekauft. Einige Forscher haben in der Vergangenheit vage beschrieben, wie man einen TBARS-Assay durchführt21,22, aber weder ein vollständig detailliertes Protokoll noch ein umfassendes Video darüber, wie man den TBARS-Assay ohne ein teures Kit durchführt, ist in der Literatur verfügbar.

Hier berichten wir über eine detaillierte, analytisch validierte Methodik zur Durchführung eines TBARS-Assays auf einfache, reproduzierbare und kostengünstige Weise. Veränderungen in der Lipidperoxidation von humanem Serum, HepG2-Lysaten und Lipoproteinen niedriger Dichte bei der Behandlung mit Cu(II)-Ionen werden als illustrative Anwendungen für den TBARS-Assay nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser TBARS-Assay im Alltag konsistent und reproduzierbar ist.

Protokoll

Menschliche Serumproben wurden von einwilligenden Freiwilligen unter IRB-Zulassung und gemäß den in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebrachten Prinzipien erhalten. Die Proben wurden vor dem Transfer in das Analyselabor codiert und de-identifiziert.

1. Probenvorbereitung

  1. HepG2 Zelllysate
    1. Entkernen Sie etwa 10 x 106 HepG2-Zellen pro Kolben in 16 T75-Kolben mit 14 ml EMEM-Medien, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), und züchten Sie Zellen für 2 Tage.
    2. RIPA-Puffer vorbereiten: in einem 50-ml-Röhrchen 1,5 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL NP-40-Reagenz hinzufügen und dann das endige Volumen mit DI-Wasser auf 50 ml bringen.
    3. Lysepuffer vorbereiten: Aliquot 20 ml RIPA-Puffer in ein 50 ml Röhrchen und 200 μL einer 100-fachen Proteaseinhibitorlösung hinzufügen, um den Protein- und Lipidabbau zu hemmen. Bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Der Lysepuffer ist mit TBARS-Reagenzien kompatibel und stört die Absorption bei 532 nm nicht. Wenn Sie planen, einen anderen Lysepuffer zu verwenden oder zusätzliche Inhaltsstoffe zum Lysepuffer hinzuzufügen, müssen vorläufige Validierungsstudien durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob die Lysepufferkomponenten mit dem TBARS-Assay kompatibel sind.
    4. Entfernen Sie Medien mit 10% FBS und waschzellen 2x mit 5 ml kaltem, sterilem 1x PBS.
    5. Geben Sie 1 ml Lysepuffer in die T75-Kolben, die die Zellen enthalten, und inkubieren Sie sie für 10 min bei Raumtemperatur (RT) mit konstanter Verwirbelung, um sicherzustellen, dass der Puffer gut verteilt ist.
    6. Sammeln Sie Lysate in entsprechend gekennzeichneten 2 ml Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss und inkubieren Sie 10 minuten lang auf Eis.
    7. Drehen Sie die Lysate bei 5.000 x g für 10 min bei RT, um Zelltrümmer zu sammeln, und aspirieren Sie Überstände in einem einzigen 15-ml-Rohr.
    8. Zelllysat-Überstand mit einem Speed Vac bei 50 °C und 3 mbar vierfach konzentrieren und Aliquots von je 94 μL zu 2 mL Snap-Cap-Polypropylenrohren herstellen. Lagern Sie die Proben bei -80 °C, bis sie für die In-vitro-Oxidation und/oder den TBARS-Test verwendet werden.
      HINWEIS: Um eine Konzentration des Zelllysat-Überstands zu vermeiden, können zellen auch mit 3 ml 1x Trypsin abgelöst, mit 6 ml Medien neutralisiert und 2x mit 5 ml kaltem PBS gewaschen werden. Zellpellets können dann in 250 μL Lysepuffer rekonstituiert werden, und die Schritte 1.1.6 und 1.1.7 können dann durchgeführt werden.
    9. Bereiten Sie eine 35 mM CuCl2-Stammlösung in Essigsäure (pH = 4) vor.
      1. Essigsäurelösung herstellen (pH = 4): Verdünnen Sie 1 μL Eisessig in 100 ml DI-Wasser (pH sollte ungefähr 4 betragen, aber bestätigen Sie dies mit einem pH-Meter). Fügen Sie mehr Wasser oder Essigsäure hinzu, um den pH-Wert auf 4 einzustellen.
      2. Etwa 0,1936 g Kupfer-II-Chlorid eingewichten und in 10 mL der Essigsäurelösung (pH = 4) zu einem 144 mM CuCl2-Stamm auflösen. Aliquot 490 μL aus dieser Lösung und fügen Sie zu 1.510 μL Essigsäure (pH = 4) hinzu, um eine 35 mM CuCl2-Lösung herzustellen.
    10. Aliquot 6 μL aus der 35 mM CuCl2-Stammlösung und geben Sie es zu sechs Proben, die 94 μL Zelllysat enthalten, um eine endgültige CuCl2-Konzentration von etwa 2 mM zu erhalten. 6 μL einer Essigsäurelösung (pH = 4), die kein CuCl2 enthält, werden sechs Proben mit 94 μL Zelllysaten als Kontrollen zugesetzt. Das endgültige Volumen des Zelllysats sollte 100 μL betragen, was für den TBARS-Assay verwendet wird.
      HINWEIS: Die Herstellung der 35 mM CuCl2-Stammlösung in Essigsäure (pH = 4) ist notwendig, um die Ausfällung von Kupferhydroxid zu verhindern.
    11. Inkubieren Sie Proben in einem Ofen bei 37 °C für 24 h und führen Sie einen TBARS-Assay an jeder Probe mit einem Endvolumen von 100 μL durch.
    12. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.9 und 1.1.11 2x an getrennten Tagen, um die Reproduzierbarkeit des TBARS-Assays für HepG2-Zelllysate zu überprüfen.
  2. Lipoproteine niedriger Dichte
    HINWEIS: Typischerweise enthält vorgereinigtes Low Density Lipoprotein (LDL) eine gewisse Menge an EDTA. Die hier verwendeten LDL-Proben enthalten 0,01% EDTA. EDTA kann die in vitro Cu(II)-vermittelte Oxidation von LDL hemmen. Daher kann es notwendig sein, EDTA vor Experimenten oder Analysen aus LDL-Proben zu entfernen. In den Schritten 1.2.1 bis 1.2.5 wird dieser Vorgang beschrieben.
    VORSICHT: Natriumhydroxid ist ätzend und verursacht Reizungen in Haut und Augen. Verwenden Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung.
    1. Aliquot 24 μL aus einem 5,51 mg/ml LDL-Stamm (Proteinkonzentration bestimmt durch modifizierte Lowry-Methode unter Verwendung von BSA als Standard) in entsprechend gekennzeichnete 1 mL Snap-Cap-Polypropylenröhrchen. Stellen Sie so viele Aliquots wie nötig her und lagern Sie sie bei 4 °C bis zur Verwendung in der Oxidation und/oder TBARS-Assay.
    2. Bereiten Sie einen 10 mM HEPES-Puffer in 0,15 M NaCl, eingestellt auf pH = 7, mit NaOH-Perlen vor: Lösen Sie 4,39 g NaCl in 0,49 l Wasser auf und fügen Sie dann 1,19 g HEPES hinzu. Mit einem Rührstab gut auflösen. Fügen Sie Natriumhydroxidperlen hinzu, bis der pH-Wert 7 beträgt. Mit Wasser auf 0,5 l verdünnen. Puffer bei 4 °C lagern und innerhalb von 3 Monaten verwenden.
    3. 476 μL des 10 mM HEPES-Puffers in 0,15 M NaCl (pH = 7) zu den aliquotedierten LDL-Proben geben, um das Endvolumen auf 500 μL zu bringen. Geben Sie eine verdünnte LDL-Probe in eine 0,5 ml Zentrifugalspinfiltervorrichtung mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 100 K.
    4. Spinnproben bei 14.000 x g für 10 min bei RT, wobei ein endgültiges Retentatvolumen von etwa 30 μL verbleibt. Rekonstituieren Sie Proben in 480 μL des 10 mM HEPES-Puffers in 0,15 M NaCl (pH = 7) und drehen Sie sich erneut bei 14.000 x g für 10 min bei RT. Führen Sie diesen Schritt 2x für insgesamt vier Spin-Throughs durch.
    5. Legen Sie die Filtervorrichtung verkehrt herum in ein neues 2-ml-Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss und zentrifugieren Sie bei 1000 x g für 2 min, um die LDL-Probe zu sammeln (Endvolumen = ca. 30 μL).
    6. Aliquote Probe in entsprechend markiertes 1 ml Röhrchen und 20 μL Wasser zu jeder Probe geben, um ein Endvolumen von 50 μL zu erreichen.
    7. Herstellung von 200 μM CuCl2 Stammlösung in Essigsäure (pH = 4)
      1. Essigsäurelösung (pH = 4) herstellen: siehe Schritt 1.1.9.1.
      2. Man bereitet eine 144 mM CuCl2 Stammlösung vor (siehe Schritt 1.1.9.2), dann aliquot 5,5 μL aus dem 144 mM CuCl2 Stamm und löst sich in einem Endvolumen von 4 mL Essigsäure (pH = 4) auf, um die 200 μM Lösung herzustellen.
    8. Aliquot 2,7 μL aus der 200 μM CuCl2 Stammlösung und geben Sie es zu sechs Proben mit 50 μL LDL, um eine endgültige CuCl2-Konzentration von ~ 10 μM zu erreichen. 2,7 μL aus einer Essigsäurelösung (pH = 4), die kein CuCl2 enthält, werden zu sechs Proben mit 50 μL LDL für die Kontrollen gegeben.
    9. Inkubieren Sie LDL-Proben für 2 h in einem Ofen bei 37 °C. Nach 2 h das Endvolumen auf 100 μL für jede Probe mit 10 mM HEPES-Puffer in 0,15 M NaCl (pH = 7) bringen. Führen Sie sofort einen TBARS-Assay durch.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3–1.2.9 2x an zwei verschiedenen Tagen, um die Reproduktion des TBARS-Assays zu testen.
  3. Menschliches Serum
    1. Machen Sie aus einer menschlichen Serumprobe Aliquots von je 94 μL in 2 mL Snap-Cap Polypropylenröhrchen und lagern Sie die Proben bei -80 °C.
    2. Eine 35 mM CuCl2-Stammlösung in Essigsäure (pH = 4) herstellen: siehe Schritt 1.1.9.
    3. Aliquot 6 μL aus der CuCl2-Stammlösung und geben Sie es zu sechs Proben, die 94 μL menschliches Serum enthalten, um eine endgültige CuCl2-Konzentration von etwa 2 mM zu erhalten. Fügen Sie 6 μL einer Essigsäurelösung (pH = 4), die kein CuCl2 enthält, zu sechs Proben mit 94 μL humanem Serum hinzu, um sie als Kontrollen zu verwenden.
    4. Menschliche Serumproben 24 h lang in einem Ofen bei 37 °C inkubieren und den Oxidationsgrad mit TBARS-Assay bestimmen (Abschnitt 4).
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2–1.3.4 2x an zwei verschiedenen Tagen, um die Reproduzierbarkeit des TBARS-Assays zu bestimmen.

2. Vorbereitung des Reagenzes

VORSICHT: Thiobarbitursäure verursacht Haut- und Augenreizungen und kann durch Einatmen oder Hautabsorption schädlich sein. Essigsäure kann innere Organe schädigen, wenn sie eingeatmet wird. Bereiten Sie alle Säurelösungen in einem Abzug vor.

  1. Herstellung von 8,1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung
    1. 32,4 g SDS auswiegen und in 350 ml DI-Wasser in einem Becherglas auflösen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um SDS sanft aufzulösen und Blasen zu vermeiden. Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 400 ml und lagern Sie die SDS-Lösung bei RT.
      HINWEIS: Hier wird überschüssige 8,1% SDS-Lösung vorbereitet; Für 96 Proben werden jedoch nur etwa 20 ml der 8,1% igen SDS-Lösung benötigt. Bereiten Sie diese Lösung entsprechend der Anzahl der analysierten Proben vor.
  2. Herstellung von 3,5 M Natriumacetatpuffer (pH = 4)
    1. Verdünnen Sie 100 ml Eisessig in 350 mL DI-Wasser in einem Becherglas. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um es vorsichtig aufzulösen.
    2. Bereiten Sie eine 6,5 M NaOH-Lösung unter Verwendung von Natriumhydroxidperlen in Wasser vor. 13 g NaOH-Perlen in 40 mL DI-Wasser lösen und mit DI-Wasser auf ein Endvolumen von 50 mL bringen.
    3. Langsam etwa 46 ml der 6,5 M NaOH-Lösung in die Essigsäurelösung geben, während Sie mit dem Rührstab mischen (dies sollte den pH-Wert auf 4 erhöhen, aber durch langsames Hinzufügen der NaOH-Lösung während der Messung mit einem pH-Meter bestätigen).
    4. Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 500 ml und lagern Sie den Natriumacetatpuffer bei RT.
  3. Herstellung von 0,8% iger wässriger Lösung von Thiobarbitursäure (eingestellt auf pH = 4)
    HINWEIS: In diesem Schritt wird die Herstellung von Thiobarbitursäure für große Mengen optimiert, da eine große Anzahl von Proben analysiert wird (108 Proben, ohne die Standards). Bereiten Sie diese Lösung in Abhängigkeit von der Anzahl der für die Analyse geplanten Proben vor.
    1. Bereiten Sie eine 5 M Natriumhydroxidlösung mit Natriumhydroxidperlen und Wasser vor: Lösen Sie 4 g Natriumhydroxidperlen in einem Endvolumen von 20 ml Wasser auf. In einem Kunststoffbehälter aufbewahren. Diese Lösung sollte für jede Charge frisch zubereitet werden.
    2. Gewicht 4 g Thiobarbitursäure und 450 ml DI-Wasser hinzufügen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um es vorsichtig aufzulösen.
      HINWEIS: Diese Lösung wird schließlich auf ein Gesamtvolumen von 500 ml gebracht.
    3. Beim Auflösen der Thiobarbitursäure mit einem Rührstab (langsam und tropfenweise) etwa 3 ml der 5 M NaOH-Lösung in 100 μL-Schritten zugeben. Nach Zugabe der NaOH-Lösung beginnen sich die Thiobarbitursäurepartikel aufzulösen.
    4. Wenn sich die Thiobarbitursäurepartikel noch nicht vollständig gelöst haben, fügen Sie mehr von der 5 M NaOH-Lösung in 100 μL-Schritten hinzu, bis alle Thiobarbitursäurepartikel vollständig gelöst sind. Für dieses spezielle Lösungsvolumen werden insgesamt 4 ml der 5 M NaOH-Lösung zugegeben, um die Thiobarbitursäurepartikel vollständig aufzulösen.
      HINWEIS: Bei dieser Konzentration löst sich Thiobarbitursäure nicht vollständig auf, es sei denn, der pH-Wert beträgt fast 4.
    5. Hören Sie auf, NaOH hinzuzufügen, nachdem sich die gesamte Thiobarbitursäure vollständig aufgelöst hat. Vermeiden Sie es, einen pH-Wert von 4 zu überschreiten. Der endgültige pH-Wert kann überprüft werden, indem 1 μL aus der mischenden Thiobarbitursäurelösung entnommen und auf pH-Papier gegeben wird.
    6. Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 500 ml und lagern Sie wässrige 0,8% ige Thiobarbitursäurelösung bei RT.

3. Malondialdehyd-Bis(dimethylacetal)-Standardprobenvorbereitung

HINWEIS: Malondialdehyd (MDA) ist instabil und nicht im Handel erhältlich. Es gibt jedoch verschiedene chemische Formen von MDA, die kommerziell erhältlich sind, wie MDA-Tetrabutylammoniumsalz, MDA-Bis (Dimethylacetal) und MDA-Bis (Diethylacetal). Von diesen drei chemischen Formen wird hier MDA-Bis (Dimethylacetal) verwendet, da die Mehrheit der Studien denselben Standard verwendet21,22. Wenn Sie sich für die Verwendung der beiden anderen chemischen Formen von MDA entscheiden, sollte eine vorherige Validierung ihrer Eignung durchgeführt werden.

  1. Bereiten Sie eine 550 μM MDA-Bis (Dimethylacetal) Stammlösung vor, indem Sie 92 μL reines MDA-Bis (Dimethylacetal) in 1 L DI-Wasser verdünnen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um die Lösung 10 Minuten lang gründlich zu mischen. Die Lösung bei 4 °C lagern und innerhalb von 1 Monat verwenden.
  2. Bereiten Sie ein 200 μM MDA-Bis (Dimethylacetal) vor, indem Sie 726 μL aus dem 550 μM MDA-Bis (Dimethylacetal) -Stamm in 1274 μL DI-Wasser verdünnen. Diese 200 μM MDA-Bis(dimethylacetal)-Lösung sollte bei jeder TBARS-Untersuchung frisch zubereitet werden.
  3. Standardkurvenvorbereitung: Nehmen Sie acht 2-ml-Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss und beschriften Sie sie mit den Buchstaben A bis H. Fügen Sie MDA-Bis (Dimethylacetal) aus dem 200-μM-Vorrat hinzu und verdünnen Sie es wie in Tabelle 1 beschrieben in Wasser.
  4. Nehmen Sie acht Glasröhren (13 mm x 100 mm) und beschriften Sie sie A–H, dann fügen Sie 100 μL Standard zu den entsprechenden Rohren hinzu. Führen Sie sechs Replikate für den Blankostandard (Probe A) durch, um die Nachweisgrenzen des TBARS-Assays zu berechnen.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier für nicht mehr als 1 h pausiert werden.

4. TBARS-Assay

HINWEIS: Sobald der TBARS-Assay gestartet ist, sollte er ohne Unterbrechung abgeschlossen sein.

  1. Nehmen Sie so viele Glasröhrchen wie nötig für die Anzahl der zu analysierenden Proben und beschriften Sie sie mit den Namen der Proben. Dann fügen Sie 100 μL jeder vorbereiteten Probe (wie oben beschrieben) zu jedem Glasröhrchen hinzu.
  2. Geben Sie 200 μL 8,1% SDS zu jeder Probe und jedem Standard hinzu und schwenken Sie das Glasröhrchen vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung, um die Probe zu mischen.
  3. Jeder Probe und jedem Standard werden 1,5 ml des 3,5 M Natriumacetatpuffers (pH = 4) zugesetzt.
  4. Jeder Probe und jedem Standard werden 1,5 ml der wässrigen 0,8%igen Thiobarbitursäurelösung (pH = 4) zugegeben.
  5. Bringen Sie das Endvolumen für jede Probe und jeden Standard auf 4 ml, indem Sie 700 μL DI-Wasser hinzufügen.
  6. Schließen Sie jedes Glasrohr fest ab und inkubieren Sie es in einem auf 95 °C eingestellten Heizblock für 1 h. Decken Sie die Glasröhren mit Aluminiumfolie ab, um Kondensation an den Oberseiten der Rohre zu vermeiden.
  7. Entfernen Sie die Glasröhren aus dem Heizblock und inkubieren Sie 30 min auf Eis.
  8. Zentrifugenproben und Standards bei 1500 x g für 10 min bei 4 °C. Bewahren Sie nach der Zentrifugation die Glasröhrchen mit den Proben und Standards bei RT auf.
    HINWEIS: Wenn Sie die Proben auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren, wird die gesamte Probe oder Norm ausgefällt.
  9. Unmittelbar nach der Zentrifugation 150 μL Überstand aus jedem Rohr aliquotieren und in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte geben.
  10. Entfernen Sie alle Blasen aus jeder Vertiefung mit einer Pipettenspitze.
    HINWEIS: Das Vorhandensein von Blasen führt zu inkonsistenten Absorptionswerten, was zu einer hohen Assay-Ungenauigkeit führt.
  11. Ablesen der Absorptionsraten bei 532 nm. Subtrahieren Sie den durchschnittlichen Absorptionswert der leeren Proben von allen anderen Absorptionswerten.
  12. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die blank-subtrahierten Absorptionswerte bei 532 nm im Vergleich zur bekannten Konzentration jedes Standards darstellen. Passen Sie die Datenpunkte mithilfe der linearen Regression an. Berechnen Sie unbekannte Stichprobenkonzentrationen unter Verwendung der Gleichung der linearen Regressionslinie aus der Standardkurve.

Ergebnisse

Unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C ergibt Malondialdehyd (MDA) bis(dimethyl acetal) MDA23. MDA und eng verwandte chemische Kongenere reagieren mit zwei Molekülen Thiobarbitursäure (TBA), um Verbindungen zu produzieren, die als Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) bezeichnet werden, die eine rot-rosa Farbe ergeben und eine Absorption λmax bei 532 nm aufweisen (Abbildung 1, Abbildung 2). Unter Verwendun...

Diskussion

Trotz seiner Einschränkungen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 und mangelnder Eignung für Vergleiche zwischen Laboratorien ist der TBARS-Assay einer der <...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die hier berichtete Forschung wurde zum Teil vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Award-Nr. R33 CA217702 und das Programm Initiative for Maximizing Student Development (IMSD). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Ansicht der National Institutes of Health dar.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 LVWR, PA101642--262cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tubeCorning, NYCLS430897General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterileThermo Fisher Scientific, MA280895To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter deviceFisher Scientific, NHUFC510024LDL purification
Caps for glass tubesThermo Fisher Scientific, MA14-930-15Dfor TBARS assay
Copper II ChlorideSIGMA, MO222011-250Gto induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)VWR, PA53283-800for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC, VAHB-8065HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLeppendorf, NY22363204General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mLGenesee Sceitific, CA22363352General material
Fetal Bovine Serum US SourceOmega Scientific, CAFB-11for cell culture
Glacial Acetic AcidSIGMA, MO27225-1L-RTBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)Thermo Scientific, MA87786cell lysis reagent
HEPESSIGMA, MOH3375-250GLDL solvent
HepG2 CellsATCC, VAHB-8065Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl)Fisher Scientific, NHA144-212cell lysis reagent
Legend Micro 17 CentrifugeThermo Scientific, MA75002431General material
Low Density Lipoprotein, Human PlasmaAthens Research & Technology, GA12-16-120412Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-AssortmentVWR, PA58948-025General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)SIGMA, MO8207560250TBARS Standard
Multiskan Go Microplate SpectrophotometerFisher Scientific, NH51119200To measure absorbance
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100MLcell lysis reagent
Sodium ChlorideSIGMA, MOS7653-1KGcell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS)SIGMA, MO436143-100GTBARS Reagent
Sodium hydroxideSIGMA, MO367176-2.5KGTBARS Reagent
SpeedVac ConcentratorThermo Scientific, MASC250EXPFor concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter capUSA Scientific, FL658175cell culture
Thiobarbituric AcidSIGMA, MOT5500-100GTBARS Reagent
TRIS baseFluka, GA93362cell lysis reagent
Trypsin (1x)VWR, PA16777-166To detach HepG2 cells

Referenzen

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K., Armstrong, D. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

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