Valutazione dello stress ossidativo in campioni biologici utilizzando il test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico

Riepilogo

L'obiettivo del test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico è quello di valutare lo stress ossidativo in campioni biologici misurando la produzione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide, utilizzando la spettrofotometria a lunghezza d'onda visibile a 532 nm. Il metodo qui descritto può essere applicato al siero umano, ai lisati cellulari e alle lipoproteine a bassa densità.

Abstract

Nonostante la sua limitata specificità analitica e robustezza, il saggio delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS) è stato ampiamente utilizzato come metrica generica della perossidazione lipidica nei fluidi biologici. È spesso considerato un buon indicatore dei livelli di stress ossidativo all'interno di un campione biologico, a condizione che il campione sia stato correttamente maneggiato e conservato. Il test prevede la reazione di prodotti di perossidazione lipidica, principalmente malondialdeide (MDA), con acido tiobarbiturico (TBA), che porta alla formazione di addotti MDA-TBA2 chiamati TBARS. TBARS produce un colore rosso-rosa che può essere misurato spettrofotometricamente a 532 nm. Il test TBARS viene eseguito in condizioni acide (pH = 4) e a 95 °C. L'MDA puro è instabile, ma queste condizioni consentono il rilascio di MDA da MDA bis (dimetil acetale), che viene utilizzato come standard analitico in questo metodo. Il test TBARS è un metodo semplice che può essere completato in circa 2 ore. La preparazione dei reagenti di analisi è descritta in dettaglio qui. I ricercatori attenti al budget possono utilizzare questi reagenti per più esperimenti a basso costo piuttosto che acquistare un costoso kit di analisi TBARS che consente solo la costruzione di una singola curva standard (e quindi può essere utilizzato solo per un esperimento). L'applicabilità di questo test TBARS è dimostrata nel siero umano, nelle lipoproteine a bassa densità e nei lisati cellulari. Il test è coerente e riproducibile e possono essere raggiunti limiti di rilevazione di 1,1 μM. Vengono fornite raccomandazioni per l'uso e l'interpretazione del test spettrofotometrico TBARS.

Introduzione

La perossidazione lipidica è un processo in cui i radicali liberi, come le specie reattive dell'ossigeno e le specie reattive dell'azoto, attaccano i doppi legami carbonio-carbonio nei lipidi, un processo che comporta l'estrazione di un idrogeno da un carbonio e l'inserimento di una molecola di ossigeno. Questo processo porta a una miscela di prodotti complessi tra cui radicali lipidici perossilici e idroperossidi come prodotti primari, nonché malondialdeide (MDA) e 4-idrossinonenale come prodotti secondari ^{predominanti1}.

MDA è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica come marcatore di perossidazione lipidica a causa della sua facile reazione con l'acido tiobarbiturico (TBA). La reazione porta alla formazione di MDA-TBA2, un coniugato che assorbe nello spettro visibile a 532 nm e produce un colore rosso-rosa2. Altre molecole derivate dalla perossidazione lipidica oltre all'MDA possono anche reagire con il TBA e assorbire la luce a 532 nm, contribuendo al segnale di assorbimento complessivo che viene misurato. Allo stesso modo, MDA può reagire con la maggior parte delle altre principali classi di biomolecole, limitando potenzialmente la sua accessibilità per la reazione con ^TBA3,4. Come tale, questo test tradizionale è semplicemente considerato per misurare "sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico" o ^TBARS5.

Se applicato e interpretato correttamente, il test TBARS è generalmente considerato un buon indicatore dei livelli complessivi di stress ossidativo in un campione ^biologico6. Sfortunatamente, come documentato da Khoubnasabjafari e altri, il test TBARS è spesso condotto e interpretato in modi che facilitano conclusioni dubbie3,4,7,8,9,10,11. Le cause di ciò sono radicate principalmente nelle variabili pre-analitiche correlate al campione e nella mancanza di robustezza del saggio che vieta variazioni apparentemente minori nel protocollo del saggio senza cambiamenti sostanziali nei risultati del test1,7,12,13.

Le variabili preanalitiche correlate alla manipolazione e alla conservazione dei biocampioni (ad esempio, plasma sanguigno mantenuto temporaneamente a -20 °C)^14,15 possono avere un impatto importante sui risultati del test TBARS16,17; tanto che i risultati del test TBARS non dovrebbero essere confrontati tra diversi laboratori a meno che non siano garantiti da espliciti dati di convalida analitica interlaboratorio. Questa raccomandazione è simile a come i western blots sono comunemente usati e interpretati. I confronti delle densità di banda sono validi per gli studi all'interno del blot e forse all'interno del laboratorio, ma il confronto delle densità di banda tra i laboratori è generalmente considerato una pratica non valida.

Alcuni ricercatori hanno suggerito che l'MDA misurato dal test TBARS semplicemente non soddisfa i criteri analitici o clinici richiesti da un biomarcatore accettabile3,9,10,18,19. Infatti, se il saggio non fosse stato sviluppato oltre 50 anni fa, probabilmente non avrebbe ottenuto l'uso diffuso e la tacita accettabilità che ha oggi. Sebbene esistano altri saggi con maggiore sensibilità analitica, specificità e robustezza utilizzati per determinare lo stress ossidativo, il saggio TBARS basato sull'assorbanza a 532 nm rimane di gran lunga uno dei saggi più comunemente usati per la determinazione della perossidazione ^lipidica20 e quindi la valutazione dello stress ossidativo.

Il test TBARS può essere trovato solo come un kit costoso (oltre 400 dollari USA), in cui le istruzioni non forniscono informazioni dettagliate sulla maggior parte delle concentrazioni dei reagenti utilizzati. Inoltre, i reagenti forniti possono essere utilizzati solo per un esperimento, perché è possibile realizzare una sola curva standard colorimetrica per kit. Questo può essere problematico per i ricercatori che intendono determinare i livelli di ossidazione all'interno di pochi campioni in diversi punti temporali, perché la stessa curva standard non può essere utilizzata più volte. Quindi, è necessario acquistare più kit per più esperimenti. Attualmente, a meno che non venga acquistato un kit costoso, non è disponibile un protocollo dettagliato su come eseguire un test TBARS. Alcuni ricercatori in passato hanno vagamente descritto come eseguire un test ^TBARS21,22, ma né un protocollo completamente dettagliato né un video completo su come condurre il test TBARS senza un kit costoso è disponibile in letteratura.

Qui riportiamo una metodologia dettagliata e convalidata analiticamente per lo scopo su come eseguire un test TBARS in modo semplice, riproducibile ed economico. I cambiamenti nella perossidazione lipidica del siero umano, dei lisati HepG2 e delle lipoproteine a bassa densità dopo il trattamento con ioni Cu(II) sono dimostrati come applicazioni illustrative per il test TBARS. I risultati dimostrano che questo test TBARS è coerente e riproducibile su base giornaliera.

Protocollo

I campioni di siero umano sono stati ottenuti da volontari consenzienti sotto l'approvazione dell'IRB e secondo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. I campioni sono stati codificati e de-identificati prima del trasferimento al laboratorio di analisi.

1. Preparazione del campione

1. Lisati di cellule HepG2
   1. Semina circa 10 x ¹⁰⁶ cellule HepG2 per pallone in 16 palloni T75 con 14 ml di emEM media integrati con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e coltiva le cellule per 2 giorni.
   2. Preparare il tampone RIPA: in un tubo da 50 mL, aggiungere 1,5 mL di 5 M NaCl, 2,5 mL di 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL di reagente NP-40, quindi portare il volume finale a 50 mL con acqua DI.
   3. Preparare il tampone di lisi: aliquota 20 mL di tampone RIPA in un tubo da 50 mL e aggiungere 200 μL di una soluzione inibitore della proteasi 100x per inibire la degradazione delle proteine e dei lipidi. Conservare a 4 °C.
      NOTA: il tampone di lisi è compatibile con i reagenti TBARS e non interferisce con l'assorbanza a 532 nm. Se si prevede di utilizzare un tampone di lisi diverso o di aggiungere ingredienti aggiuntivi al tampone di lisi, è necessario eseguire studi preliminari di convalida per verificare che i componenti del tampone di lisi siano compatibili con il test TBARS.
   4. Rimuovere i fluidi contenenti il 10% di FBS e lavare le celle 2x con 5 ml di PBS freddo e sterile 1x.
   5. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi ai palloni T75 contenenti le cellule e incubarli per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) con un vortice costante per garantire che il tampone sia ben distribuito.
   6. Raccogliere lisati in tubi di polipropilene a tappo a scatto da 2 mL opportunamente etichettati e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
   7. Ruotare i lisati a 5.000 x g per 10 minuti a RT per raccogliere i detriti cellulari e aspirare i supernatanti in un singolo tubo da 15 ml.
   8. Concentrare il surnatante di lisato cellulare quattro volte utilizzando uno Speed Vac a 50 °C e 3 mbar e fare aliquote di 94 μL ciascuna in tubi di polipropilene a tappo a scatto da 2 mL. Conservare i campioni a -80 °C fino a quando non vengono utilizzati per l'ossidazione in vitro e/o il test TBARS.
      NOTA: Per evitare di concentrare il surnatante di lisato cellulare, le cellule possono anche essere staccate usando 3 ml di 1x tripsina, neutralizzate con 6 mL di media e lavate 2x con 5 mL di PBS freddo. I pellet cellulari possono quindi essere ricostituiti in 250 μL di tampone di lisi e possono quindi essere eseguiti i passaggi 1.1.6 e 1.1.7.
   9. Preparare una soluzione madre di _CuCl2 da 35 mM in acido acetico (pH = 4).
      1. Preparare la soluzione di acido acetico (pH = 4): diluire 1 μL di acido acetico glaciale in 100 ml di acqua DI (il pH dovrebbe essere di circa 4 ma confermarlo con un pHmetro). Aggiungere più acqua o acido acetico per regolare il pH a 4.
      2. Pesare circa 0,1936 g di cloruro di rame II e sciogliere in 10 ml della soluzione di acido acetico (pH = 4) per formare un brodo di _CuCl2 da 144 mM. Aliquota 490 μL da questa soluzione e aggiungere a 1.510 μL di acido acetico (pH = 4) per ottenere una soluzione di _CuCl2 da 35 mM.
   10. Aliquota 6 μL dalla soluzione madre _cuCl2 da 35 mM e aggiungerla a sei campioni contenenti 94 μL di lisato cellulare per ottenere una concentrazione finale di _CuCl2 di circa 2 mM. Aggiungere 6 μL di una soluzione di acido acetico (pH = 4) che non ha _CuCl2 a sei campioni contenenti 94 μL di lisati cellulari da utilizzare come controlli. Il volume finale di lisato cellulare dovrebbe essere di 100 μL, che è quello che verrà utilizzato per il test TBARS.
       NOTA: La produzione della soluzione madre _cuCl2 da 35 mM in acido acetico (pH = 4) è necessaria per evitare la precipitazione dell'idrossido di rame.
   11. Incubare i campioni in un forno a 37 °C per 24 ore ed eseguire un saggio TBARS su ciascun campione contenente un volume finale di 100 μL.
   12. Ripetere i passaggi 1.1.9 e 1.1.11 2x in giorni separati per verificare la riproducibilità del test TBARS per i lisati cellulari HepG2.
2. Lipoproteine a bassa densità
   NOTA: In genere, la lipoproteina a bassa densità (LDL) pre-purificata contiene una certa quantità di EDTA. I campioni LDL utilizzati qui contengono lo 0,01% di EDTA. L'EDTA può inibire l'ossidazione in vitro mediata da Cu(II) delle LDL. Quindi, potrebbe essere necessario rimuovere EDTA dai campioni LDL prima di esperimenti o analisi. I passaggi 1.2.1–1.2.5 descrivono questo processo.
   ATTENZIONE: l'idrossido di sodio è corrosivo e provoca irritazione alla pelle e agli occhi. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale.
   1. Aliquota 24 μL da uno stock di LDL da 5,51 mg/mL (concentrazione proteica determinata con metodo Lowry modificato utilizzando BSA come standard) in tubi di polipropilene a tappo a scatto da 1 mL opportunamente etichettati. Effettuare tutte le aliquote necessarie e conservare a 4 °C fino all'uso nel test di ossidazione e/o TBARS.
   2. Preparare un tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl regolato a pH = 7 con perline NaOH: sciogliere 4,39 g di NaCl in 0,49 L di acqua, quindi aggiungere 1,19 g di HEPES. Sciogliere bene con una barra di agitazione. Aggiungere perline di idrossido di sodio fino a quando il pH è 7. Diluire a 0,5 L con acqua. Conservare il tampone a 4 °C e utilizzare entro 3 mesi.
   3. Aggiungere 476 μL del tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl (pH = 7) ai campioni LDL aliquotati per portare il volume finale a 500 μL. Aggiungere un campione LDL diluito a un dispositivo filtro centrifugo da 0,5 mL con un taglio di peso molecolare di 100K.
   4. Centrifuga i campioni a 14.000 x g per 10 minuti a RT, lasciando un volume finale di ripetizione di circa 30 μL. Ricostituire i campioni in 480 μL del tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl (pH = 7) e ruotare nuovamente a 14.000 x g per 10 minuti a RT. Eseguire questa fase 2 volte per un totale di quattro spin-through.
   5. Posizionare il dispositivo filtrante capovolto in un nuovo tubo di polipropilene a scatto da 2 mL e centrifugare a 1000 x g per 2 minuti per raccogliere il campione LDL (volume finale = circa 30 μL).
   6. Aliquotare il campione in un tubo da 1 mL opportunamente etichettato e aggiungere 20 μL di acqua a ciascun campione per ottenere un volume finale di 50 μL.
   7. Preparazione di soluzione madre _{cuCl2 da 200} μM in acido acetico (pH = 4)
      1. Preparare la soluzione di acido acetico (pH = 4): vedere il punto 1.1.9.1.
      2. Preparare una soluzione madre _cuCl2 da 144 mM (vedere punto 1.1.9.2), quindi aliquotare 5,5 μL dal brodo _CuCl2 da 144 mM e sciogliere in un volume finale di 4 mL di acido acetico (pH = 4) per ottenere la soluzione da 200 μM.
   8. Aliquota 2,7 μL dalla soluzione madre _{CuCl2 da 200} μM e aggiungerla a sei campioni contenenti 50 μL di LDL per ottenere una concentrazione finale di _CuCl2 di ~10 μM. Aggiungere 2,7 μL da una soluzione di acido acetico (pH = 4) che non contiene _CuCl2 a sei campioni contenenti 50 μL di LDL da utilizzare per i controlli.
   9. Incubare campioni LDL per 2 ore in forno a 37 °C. Dopo 2 ore, portare il volume finale a 100 μL per ogni campione con tampone HEPES da 10 mM in 0,15 M NaCl (pH = 7). Eseguire immediatamente un test TBARS.
   10. Ripetere i passaggi 1.2.3–1.2.9 2x in due giorni diversi per testare la riproduttività del test TBARS.
3. Siero umano
   1. Da un campione di siero umano, effettuare aliquote di 94 μL ciascuna in provette di polipropilene a tappo a scatto da 2 mL e conservare i campioni a -80 °C.
   2. Preparare una soluzione madre di _CuCl2 da 35 mM in acido acetico (pH = 4): vedere il passaggio 1.1.9.
   3. Aliquota 6 μL dalla soluzione madre _cuCl2 e aggiungerla a sei campioni contenenti 94 μL di siero umano per ottenere una concentrazione finale di _CuCl2 di circa 2 mM. Aggiungere 6 μL di una soluzione di acido acetico (pH = 4) che non ha _CuCl2 a sei campioni contenenti 94 μL di siero umano da utilizzare come controlli.
   4. Incubare campioni di siero umano per 24 ore in forno a 37 °C e determinare i livelli di ossidazione con il test TBARS (sezione 4).
   5. Ripetere i passaggi 1.3.2–1.3.4 2x in due giorni separati per determinare la riproducibilità del test TBARS.

2. Preparazione del reagente

ATTENZIONE: L'acido tiobarbiturico provoca irritazione della pelle e degli occhi e può essere dannoso per inalazione o assorbimento cutaneo. L'acido acetico può danneggiare gli organi interni se inalato. Preparare tutte le soluzioni acide in una cappa aspirante.

1. Preparazione di soluzione all'8,1% (p/v) di dodecilsolfato di sodio (SDS)
   1. Pesare 32,4 g di SDS e sciogliere in 350 ml di acqua DI in un becher. Utilizzare una barra di agitazione magnetica per sciogliere delicatamente la SDS ed evitare di creare bolle. Portare il volume finale a 400 ml con acqua DI e conservare la soluzione SDS presso RT.
      NOTA: qui viene preparata una soluzione SDS superiore all'8,1%; tuttavia, per 96 campioni, sono necessari solo circa 20 ml della soluzione SDS all'8,1%. Preparare questa soluzione in base al numero di campioni analizzati.
2. Preparazione di tampone di acetato di sodio 3,5 M (pH = 4)
   1. Diluire 100 mL di acido acetico glaciale in 350 mL di acqua DI in un becher. Utilizzare una barra magnetica per scioglierla delicatamente.
   2. Preparare una soluzione di NaOH da 6,5 M utilizzando perline di idrossido di sodio in acqua. Sciogliere 13 g di perline NaOH in 40 ml di acqua DI e portare ad un volume finale di 50 ml con acqua DI.
   3. Aggiungere lentamente circa 46 mL della soluzione di NaOH da 6,5 M alla soluzione di acido acetico mentre si mescola con la barra di agitazione (questo dovrebbe aumentare il pH a 4, ma confermare aggiungendo lentamente la soluzione di NaOH durante la misurazione utilizzando un pHmetro).
   4. Portare il volume finale a 500 ml con acqua DI e conservare il tampone di acetato di sodio a RT.
3. Preparazione di soluzione acquosa allo 0,8% di acido tiobarbiturico (aggiustata a pH = 4)
   NOTA: In questa fase, la preparazione dell'acido tiobarbiturico è ottimizzata per grandi volumi, poiché verrà analizzato un gran numero di campioni (108 campioni, esclusi gli standard). Preparare questa soluzione in base al numero di campioni pianificati per l'analisi.
   1. Preparare una soluzione di idrossido di sodio 5 M utilizzando perline di idrossido di sodio e acqua: sciogliere 4 g di perline di idrossido di sodio in un volume finale di 20 ml di acqua. Conservare in un contenitore di plastica. Questa soluzione deve essere preparata al momento per ogni lotto.
   2. Peso 4 g di acido tiobarbiturico e aggiungere 450 ml di acqua DI. Utilizzare una barra magnetica per scioglierla delicatamente.
      NOTA: questa soluzione verrà infine portata a un volume totale di 500 ml.
   3. Mentre si scioglie l'acido tiobarbiturico con una barra di agitazione, aggiungere (lentamente e in modo goccioso) circa 3 ml della soluzione di NaOH da 5 M con incrementi di 100 μL. Dopo aver aggiunto la soluzione di NaOH, le particelle di acido tiobarbiturico inizieranno a dissolversi.
   4. Se le particelle di acido tiobarbiturico non sono ancora completamente disciolte, aggiungere più della soluzione di NaOH 5 M con incrementi di 100 μL fino a quando tutte le particelle di acido tiobarbiturico sono completamente disciolte. Per questo particolare volume di soluzione, viene aggiunto un totale di 4 mL della soluzione di NaOH da 5 M per sciogliere completamente le particelle di acido tiobarbiturico.
      NOTA: A questa concentrazione, l'acido tiobarbiturico non si dissolve completamente a meno che il pH non sia quasi 4.
   5. Smettere di aggiungere NaOH dopo che tutto l'acido tiobarbiturico si è completamente sciolto. Evitare di superare un pH di 4. Il pH finale può essere verificato prendendo 1 μL dalla soluzione di acido tiobarbiturico miscelante e posizionandola su carta pH.
   6. Portare il volume finale a 500 ml con acqua DI e conservare la soluzione acquosa di acido tiobarbiturico allo 0,8% a RT.

3. Preparazione standard del campione di Malondialdeide bis(dimetilacetale)

NOTA: Malondialdeide (MDA) è instabile e non disponibile in commercio. Tuttavia, ci sono diverse forme chimiche di MDA che sono disponibili in commercio, come il sale di tetrabutilammonio MDA, MDA bis (dimetil acetale) e MDA bis (dietil acetale). Di queste tre forme chimiche, MDA bis (dimetilacetale) è usato qui, perché la maggior parte degli studi utilizza questo stesso ^{standard21,22}. Se si sceglie di utilizzare le altre due forme chimiche di MDA, è necessario effettuare una previa convalida della loro idoneità.

1. Preparare una soluzione madre di MDA bis (dimetilacetale) da 550 μM diluendo 92 μL di MDA bis (dimetilacetale) puro in 1 L di acqua DI. Utilizzare una barra magnetica per mescolare accuratamente la soluzione per 10 minuti. Conservare la soluzione a 4 °C e utilizzarla entro 1 mese.
2. Preparare un MDA bis (dimetilacetale) da 200 μM diluendo 726 μL dallo stock di 550 μM MDA bis (dimetilacetale) in 1274 μL di acqua DI. Questa soluzione di MDA bis (dimetilacetale) da 200 μM deve essere preparata fresca ogni volta che viene eseguito un test TBARS.
3. Preparazione della curva standard: prendere otto tubi di polipropilene a scatto da 2 ml ed etichettarli con le lettere da A a H. Aggiungere MDA bis (dimetilacetale) dal brodo da 200 μM e diluire in acqua come descritto nella Tabella 1.
4. Prendere otto tubi di vetro (13 mm x 100 mm) ed etichettarli A-H, quindi aggiungere 100 μL di standard ai tubi corrispondenti. Eseguire sei repliche per lo standard vuoto (campione A) per calcolare i limiti di rilevamento del test TBARS.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui per non più di 1 ora.

4. Test TBARS

NOTA: una volta avviato il test TBARS, deve essere terminato senza fermarsi.

1. Prendi tutti i tubi di vetro necessari per il numero di campioni da analizzare ed etichettali con i nomi dei campioni. Quindi, aggiungere 100 μL di ciascun campione preparato (come descritto sopra) a ciascun tubo di vetro.
2. Aggiungere 200 μL di SDS all'8,1% a ciascun campione e standard e ruotare delicatamente il tubo di vetro con un movimento circolare per mescolare il campione.
3. Aggiungere 1,5 mL del tampone di acetato di sodio 3,5 M (pH = 4) a ciascun campione e standard.
4. Aggiungere 1,5 mL della soluzione acquosa di acido tiobarbiturico allo 0,8% (pH = 4) a ciascun campione e standard.
5. Portare il volume finale a 4 mL per ogni campione e standard aggiungendo 700 μL di acqua DI.
6. Tappare saldamente ogni tubo di vetro e incubare in un blocco riscaldante impostato a 95 °C per 1 ora. Coprire i tubi di vetro con un foglio di alluminio per evitare la formazione di condensa nella parte superiore dei tubi.
7. Rimuovere i tubi di vetro dal blocco riscaldante e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
8. Centrifugare campioni e standard a 1500 x g per 10 min a 4 °C. Dopo la centrifugazione, mantenere i tubi di vetro contenenti i campioni e gli standard a RT.
   NOTA: mantenere i campioni su ghiaccio o a 4 °C farà precipitare l'intero campione o standard.
9. Immediatamente dopo la centrifugazione, aliquota 150 μL di surnatante da ciascun tubo e mettere in un pozzo separato di una piastra da 96 pozzetti.
10. Rimuovere eventuali bolle da ciascun pozzetto utilizzando una punta della pipetta.
    NOTA: la presenza di bolle produrrà letture di assorbanza incoerenti, portando a un'elevata imprecisione del saggio.
11. Leggere assorbanze a 532 nm. Sottrarre la lettura media di assorbanza dei campioni in bianco da tutte le altre letture di assorbanza.
12. Create una curva standard tracciando le letture di assorbanza sottratte in bianco a 532 nm rispetto alla concentrazione nota di ciascuno standard. Adatta i punti dati utilizzando la regressione lineare. Calcolare concentrazioni di campioni sconosciute utilizzando l'equazione della linea di regressione lineare ottenuta dalla curva standard.

Risultati

In condizioni acide (pH = 4) e a 95 °C, la malondialdeide (MDA) bis(dimetil acetale) produce ^MDA23. MDA e congeneri chimici strettamente correlati reagiscono con due molecole di acido tiobarbiturico (TBA) per produrre composti chiamati sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS), che danno un colore rosso-rosa e hanno un _λmax di assorbanza a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizzando MDA bis (dimetilacetale) come standa...

Discussione

Nonostante i suoi limiti1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e la mancanza di idoneità al confronto tra laboratori, il test TBARS è uno dei più

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L	VWR, PA	101642--262	cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube	Corning, NY	CLS430897	General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device	Fisher Scientific, NH	UFC510024	LDL purification
Caps for glass tubes	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	for TBARS assay
Copper II Chloride	SIGMA, MO	222011-250G	to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	eppendorf, NY	22363204	General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	General material
Fetal Bovine Serum US Source	Omega Scientific, CA	FB-11	for cell culture
Glacial Acetic Acid	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	cell lysis reagent
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL solvent
HepG2 Cells	ATCC, VA	HB-8065	Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge	Thermo Scientific, MA	75002431	General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma	Athens Research & Technology, GA	12-16-120412	Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment	VWR, PA	58948-025	General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer	Fisher Scientific, NH	51119200	To measure absorbance
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	cell lysis reagent
Sodium Chloride	SIGMA, MO	S7653-1KG	cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS Reagent
Sodium hydroxide	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap	USA Scientific, FL	658175	cell culture
Thiobarbituric Acid	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS Reagent
TRIS base	Fluka, GA	93362	cell lysis reagent
Trypsin (1x)	VWR, PA	16777-166	To detach HepG2 cells