티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석체를 이용한 생물학적 시료의 산화 스트레스 평가

요약

티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석의 목표는 532 nm에서 가시파장 분광측을 사용하여 지질 과산화 제품, 주로 말론다이얼데히드의 생산을 측정하여 생물학적 샘플에서 산화 스트레스를 평가하는 것입니다. 여기에 설명된 방법은 인간 혈청, 세포 리스, 저밀도 지단백에 적용될 수 있다.

초록

제한된 분석 특이성과 견고함에도 불구하고 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석법은 생물학적 유체의 지질 과산화의 일반적인 지표로 널리 사용되고 있습니다. 시료가 적절히 처리되고 저장되었다는 경우 생물학적 시료 내에서 산화 스트레스 수준을 나타내는 좋은 지표로 간주됩니다. 분석은 지질 과산화 제품의 반응을 포함, 주로 말론 다이얼데히드 (MDA), 티오 바르비투산 (TBA),TBAR라는 MDA-TBA2 어덕트의 형성에 이르게. TBARS는 532 nm에서 분광측정으로 측정할 수 있는 빨간색 분홍색 색상을 생성합니다. TBARS 분석법은 산성 조건(pH = 4) 및 95°C에서 수행됩니다. 순수 MDA는 불안정하지만 이러한 조건은 MDA 비스 (디메틸 아세탈)에서 MDA의 방출을 허용하며, 이는이 방법의 분석 표준으로 사용됩니다. TBARS 분석법은 약 2시간 안에 완료할 수 있는 간단한 방법입니다. 분석 시약의 준비는 여기에서 자세히 설명되어 있습니다. 예산에 민감한 연구원은 단일 표준 곡선의 시공을 허용하는 고가의 TBARS 분석 키트를 구입하는 대신 저렴한 비용으로 여러 실험에 이러한 시약을 사용할 수 있습니다 (따라서 하나의 실험에만 사용할 수 있습니다). 이 TBARS 분석법의 적용성은 인간 혈청, 저밀도 지단백 및 세포 용해에서 나타난다. 분석은 일관되고 재현 가능하며 1.1 μM의 검출 한계에 도달 할 수 있습니다. 분광성 TBARS 분석기의 사용 및 해석에 대한 권장 사항이 제공됩니다.

서문

지질 과산화는 반응성 산소 종 및 반응성 질소 종과 같은 자유 라디칼이 지질의 탄소 탄소 이중 결합을 공격하는 과정으로, 탄소로부터의 수소의 추상화와 산소 분자의 삽입을 수반하는 과정입니다. 이 과정은 주요 제품으로 지질 페록실 라디칼, 하이드로퍼산화물, 말론다이얼데히드(MDA) 및 4-하이드록시논날을 주요 이차 제품으로 포함하는 복잡한 제품의 혼합물로 이어집니다¹.

MDA는 티오바르비투릭 산 (TBA)과의 촉진 반응으로 인해 지질 과산화의 마커로 생물 의학 연구에서 널리 사용되었습니다. 반응은 MDA-TBA2의 형성으로 이끌어 냅니다, 532 nm에서 가시 스펙트럼에서 흡수하고 빨간 분홍색 색깔²를 생성하는 합자. MDA 외에 지질 과산화에서 파생 된 다른 분자는 또한 TBA와 반응하고 532 nm에서 빛을 흡수 할 수 있으며, 측정되는 전반적인 흡수 신호에 기여합니다. 유사하게, MDA는 생체 분자의 대부분의 그밖 주요 종류와 반응할 수 있습니다, 잠재적으로 ^TBA3,4를 가진 반응에 대한 그것의 접근성을 제한합니다. 이와 같이, 이 전통적인 분석은 단순히 측정 하는 것으로 간주 됩니다 "티오 바르 비 투 릭 산 반응 물질" 또는 ^TBARS5.

올바르게 적용되고 해석될 때, TBARS 분석법은 일반적으로 생물학적 샘플⁶에서 산화 스트레스의 전반적인 수준을 나타내는 좋은 지표로 간주됩니다. 불행하게도, Khoubnasabjafari 와 다른 사람에 의해 문서화 된 바와 같이, TBARS 분석은 종종 수행되고 모호한 결론을 용이하게하는 방법으로 해석3,4,7,8,9,10,11. 이에 대한 원인은 주로 샘플 관련 사전 분석 변수와 분석 결과에 상당한 변화없이 분석 프로토콜의 겉보기 사소한 변화를 금지하는 분석 견고성의 부족에 뿌리를 두고 있습니다^11,7,12,13.

바이오시메시 처리 및 저장과 관련된 사전 분석 변수(예를 들어, 혈장은 일시적으로 -20°C)^14,15에 TBARS 분석 결과 ^16,17에 큰 영향을 미칠 수 있다; 따라서 TBARS 분석 결과는 명시적 실험실 간 분석 유효성 검사 데이터에 의해 보증되지 않는 한 다른 실험실에서 비교해서는 안 됩니다. 이 권장 사항은 서양 얼룩이 일반적으로 사용되고 해석되는 방식과 비슷합니다. 밴드 밀도의 비교는 내부 블롯과 아마도 실험실 내 연구에 유효하지만 실험실 간의 대역 밀도비교는 일반적으로 잘못된 관행으로 간주됩니다.

몇몇 연구원은 TBARS 분석에 의해 측정된 MDA가 단순히 허용가능한 biomarker3,9,10,18,19의 요구된 분석 또는 임상 기준을 충족하지 않는다는 것을 건의했습니다. 실제로, 분석이 50 년 전에 개발되지 않았다면, 그것은 아마 오늘날 널리 사용되고 암묵적 인 수용성을 얻지 못했을 것입니다. 산화 스트레스를 결정하는 데 사용되는 더 큰 분석 감도, 특이성 및 견고성을 가진 다른 분석이 있지만, 532 nm의 흡수도에 기초한 TBARS 분석법은 지질 과산화^의 결정에 가장 일반적으로 사용되는 분석 중 하나까지 남아 있으며, 따라서 산화 스트레스의 평가.

TBARS 분석법은 고가의 키트(400달러 이상)로만 찾을 수 있으며, 지침은 사용되는 대부분의 시약 농도에 대한 자세한 정보를 제공하지 않습니다. 또한 제공된 시약은 키트당 하나의 컬러메트릭 표준 곡선만 만들 수 있기 때문에 하나의 실험에만 사용할 수 있습니다. 동일한 표준 곡선을 여러 번 사용할 수 없기 때문에 이것은 다른 시점에서 몇 가지 샘플 내에서 산화 수준을 결정하려는 연구자에게 문제가 될 수 있습니다. 따라서 여러 실험을 위해 여러 키트를 구입해야 합니다. 현재 고가의 키트를 구입하지 않는 한 TBARS 분석기를 수행하는 방법에 사용할 수 있는 자세한 프로토콜이 없습니다. 과거에 일부 연구자들은 TBARS 분석^21,22를 수행하는 방법을 모호하게 설명했지만, 고가의 키트없이 TBARS 분석법을 수행하는 방법에 대한 완전히 상세한 프로토콜이나 포괄적 인 비디오는 문헌에서 사용할 수 없습니다.

여기에서는 간단하고 재현 가능하며 저렴한 방법으로 TBARS 분석기를 수행하는 방법에 대한 자세한 분석 검증 방법론을 보고합니다. 인간 혈청의 지질 과산화의 변화, HepG2 용해, Cu(II) 이온을 치료할 때 저밀도 지단백은 TBARS 분석에 대한 예시적인 응용 프로그램으로 입증된다. 결과는 이 TBARS 분석이 매일 일관되고 재현가능한 것으로 보여 줍니다.

프로토콜

인간 혈청 표본은 IRB 승인에 따라 자원 봉사자의 동의와 헬싱키 선언에 표현 된 원칙에 따라 얻은. 표본은 분석 실험실로 이송되기 전에 코딩및 식별을 해제했습니다.

1. 샘플 준비

1. HepG2 셀 용해
   1. 16T75 플라스크에서 플라스크 당 약 10 x ¹⁰⁶ HepG2 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하고 2일 동안 세포를 성장시켰다.
   2. RIPA 버퍼 준비: 50 mL 튜브에서 5 M NaCl의 1.5 mL, 1 M Tris-HCl (pH = 7)의 2.5 mL, NP-40 시약의 500 μL을 추가 한 다음 DI 물로 최종 부피를 50 mL로 가져 올립니다.
   3. 리시스 버퍼 준비: ALIquot 20 mL의 RIPA 버퍼를 50 mL 튜브에 넣고 단백질과 지질 분해를 억제하기 위해 100x 프로테아제 억제제 용액의 200 μL을 추가합니다. 4 °C에 보관하십시오.
      참고: 리시스 버퍼는 TBARS 시약과 호환되며 532 nm에서 흡광도를 방해하지 않습니다. 다른 리시스 버퍼를 사용하거나 리시스 버퍼에 추가 성분을 추가하려는 경우 리시스 버퍼 구성 요소가 TBARS 분석과 호환되는지 확인하기 위해 예비 유효성 검사 연구를 수행해야 합니다.
   4. 10% FBS를 함유한 미디어를 제거하고 5mL의 냉멸 살균 1x PBS로 셀 2배 세척합니다.
   5. 세포를 포함하는 T75 플라스크에 1mL의 용해 버퍼를 추가하고 상온(RT)에서 10분 동안 배양하여 버퍼가 잘 분산되도록 합니다.
   6. lysates를 적절하게 라벨로 2 mL 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브로 수집하고 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.
   7. 리스를 5,000 x g에서 10분 동안 회전하여 셀 이물질을 수집하고 슈퍼네티를 단일 15mL 튜브로 흡인합니다.
   8. 농축 셀은 50°C및 3mbar의 속도 진공을 사용하여 슈퍼쿼터를 4배 씩 분해하고 각각 94 μL의 알리쿼트를 2mL 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브로 만듭니다. 시험관 내 산화 및/또는 TBARS 분석에 사용될 때까지 샘플을 -80°C에 저장합니다.
      참고: 세포 용해 체계를 집중하지 않으려면, 세포는 또한 1x 트립신3mL을 사용하여 분리될 수 있고, 6mL의 미디어로 중화되고, 감기 PBS5mL로 2x를 세척할 수 있다. 그런 다음 세포 펠릿을 250μL의 리시스 버퍼로 재구성할 수 있으며, 1.1.6 및 1.1.7 단계는 다음 수행될 수 있다.
   9. 아세트산(pH =4)으로 35m _CuCl2 스톡 용액을 준비한다.
      1. 아세트산 용액 준비(pH = 4): 100mL의 DI 수에서 빙하 아세트산 1μL을 희석하십시오(pH는 약 4이어야 하지만 pH 미터로 이를 확인). pH를 4로 조정하기 위해 물 이나 아세트산을 더 넣습니다.
      2. 구리 II 염화물의 약 0.1936 g의 무게를 내밀고 144mM _CuCl2 재고를 만들기 위해 아세트산 용액(pH = 4)의 10mL에 용해한다. 이 용액에서 Aliquot 490 μL및 35mM _CuCl2 용액을 만들기 위해 아세트산 (pH = 4)의 1,510 μL에 추가합니다.
   10. 35m _CuCl2 스톡 용액으로부터 의 알리쿼트 6 μL을 사용하여 세포 용액의 94 μL을 포함하는 6개의 샘플에 추가하여 약 2mM의 최종 _CuCl2 농도를 만듭니다. 대조군으로 사용하기 위해 94 μL의 세포 용액을 포함하는 6개의 샘플에 _CuCl2 가 없는 아세트산 용액(pH = 4)의 6μL을 추가합니다. 셀 리세이트의 최종 부피는 100 μL이어야 하며, 이는 TBARS 분석에 사용될 것입니다.
       참고: 구리 수산화물의 침전을 방지하기 위해 아세트산(pH = 4)으로 35m MM _CuCl2 스톡 용액을 만드는 것이 필요하다.
   11. 24시간 동안 37°C의 오븐에서 샘플을 배양하고 100 μL의 최종 부피를 포함하는 각 샘플에 TBARS 분석작업을 수행한다.
   12. HepG2 세포 용해제에 대한 TBARS 분석의 재현성을 확인하기 위해 별도의 일에 1.1.9 및 1.1.11 2배를 반복합니다.
2. 저밀도 지단백
   참고: 전형적으로, 미리 정제된 저밀도 지단백(LDL)은 EDTA의 어느 양을 포함합니다. 여기서 사용되는 LDL 샘플에는 0.01% EDTA가 포함되어 있습니다. EDTA는 LDL의 체외 Cu(II)-매개 산화를 억제할 수 있다. 따라서 실험 또는 분석 전에 LDL 샘플에서 EDTA를 제거해야 할 수도 있습니다. 1.2.1-1.2.5 단계는 이 프로세스를 설명합니다.
   주의: 수산화 나트륨은 부식성이며 피부와 눈에 자극을 일으킵니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다.
   1. Aliquot 24 μL은 5.51 mg/mL LDL 스톡(BSA를 표준으로 사용하여 수정된 Lowry 방법에 의해 결정된 단백질 농도)을 1mL 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브로 적절히 표지하였다. 필요에 따라 많은 알리코를 만들고 산화 및/또는 TBARS 분석에서 사용할 때까지 4 °C에 보관하십시오.
   2. NaOH 구슬을 사용하여 pH = 7으로 조정된 0.15 M NaCl에서 10mM HEPES 버퍼를 준비합니다: 0.49 L의 물에 NaCl 4.39 g를 용해한 다음 HEPES 1.19 g을 추가합니다. 교반 바에 잘 녹입니다. pH가 7이 될 때까지 수산화 나트륨 구슬을 추가합니다. 물로 0.5 L로 희석하십시오. 버퍼를 4°C로 저장하고 3개월 이내에 사용하십시오.
   3. 10m HEPES 버퍼의 476 μL을 0.15 M NaCl(pH = 7)에 알리인용 LDL 샘플에 추가하여 최종 부피를 500 μL로 가져옵니다. 희석된 LDL 샘플을 100K 분자량 차단 장치로 0.5mL 원심 스핀 필터 장치에 추가합니다.
   4. RT에서 10분 동안 14,000 x g의 샘플을 회전하여 약 30 μL의 최종 재보전 부피를 남깁니다. 0.15 M NaCl(pH = 7)의 10m HEPES 버퍼의 480 μL에서 샘플을 재구성하고 RT에서 10분 동안 14,000xg에서 다시 회전합니다.
   5. 필터 장치를 새로운 2mL 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브에 거꾸로 놓고 원심분리기를 1000 x g에 2분 동안 배치하여 LDL 샘플을 수집합니다(최종 부피 = 약 30 μL).
   6. Aliquot 샘플을 적절하게 표지된 1mL 튜브로 샘플링하고 각 샘플에 20 μL의 물을 추가하여 최종 부피 50 μL을 달성합니다.
   7. 아세트산 내 200 μM _CuCl2 스톡 용액 의 제제 (pH = 4)
      1. 아세트산 용액 준비(pH = 4): 1.1.9.1 단계를 참조하십시오.
      2. 144m _CuCl2 스톡 용액(단계 1.1.9.2 참조), 144m _CuCl2 스톡에서 알리쿼트 5.5 μL을 준비하고 200 μM 용액을 만들기 위해 4mL의 아세트산(pH= 4)의 최종 부피로 용해한다.
   8. 200 μM _CuCl2 스톡 용액으로부터 2.7 μL을 알리쿼트 2.7 μL을 추가하고 LDL의 50 μL을 포함하는 6개의 샘플에 추가하여 ~10 μM의 최종 _CuCl2 농도를 달성한다. 대조군에 사용될 LDL50 μL을 포함하는 6개의 샘플에 _CuCl2 를 포함하지 않는 아세트산 용액(pH = 4)에서 2.7 μL을 추가합니다.
   9. 37°C에서 오븐에서 2h에 대한 LDL 샘플을 배양합니다. 2시간 후, 0.15 M NaCl(pH = 7)의 10mM HEPES 버퍼를 가진 각 샘플에 대해 최종 부피를 100 μL로 가져옵니다. 즉시 TBARS 분석체를 수행합니다.
   10. TBARS 분석의 재생산성을 테스트하기 위해 2일 동안 1.2.3-1.2.9 배의 단계를 반복합니다.
3. 인간 혈청
   1. 인간 혈청 샘플에서, 2mL 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브로 각각 94 μL의 알리쿼트를 만들고 -80 °C에서 샘플을 저장합니다.
   2. 아세트산(pH = 4)으로 35m _CuCl2 스톡 용액을 준비하십시오( 1.1.9단계 참조).
   3. _CuCl2 스톡 용액으로부터 의 알리쿼트 6 μL을 인간 혈청 의 94 μL을 포함하는 6개의 샘플에 추가하여 약 2mM의 최종 _CuCl2 농도를 만듭니다. 제어로 사용하기 위해 인간 혈청의 94 μL을 포함하는 6개의 견본에 _CuCl2가 없는 아세트산 용액(pH = 4)의 6μL을 추가합니다.
   4. 37°C에서 오븐에서 24시간 동안 인간 혈청 샘플을 배양하고 TBARS 분석(섹션 4)을 사용하여 산화 수준을 결정합니다.
   5. TBARS 분석의 재현성을 결정하기 위해 2일 동안 1.3.2-1.3.4 2배를 반복합니다.

2. 시약 준비

주의: 티오바르비투릭 산은 피부와 눈 자극을 유발하며 흡입이나 피부 흡수로 인해 해를 끼칠 수 있습니다. 아세트산은 흡입하면 내부 장기를 손상시킬 수 있습니다. 연기 후드에 모든 산 성 솔루션을 준비합니다.

1. 도데딜설페이트 나트륨(SDS) 용액 8.1% (w/v) 제제
   1. 32.4 g의 SDS를 무게로 빼내고 비커에 350mL의 DI 물에 용해하십시오. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 SDS를 부드럽게 녹이고 거품을 일으키지 마십시오. 최종 볼륨을 400mL에 DI 워터로 가져와 RT에 SDS 솔루션을 저장합니다.
      참고: 여기에 초과 8.1% SDS 솔루션이 준비됩니다. 그러나, 96개의 견본을 위해, 8.1% SDS 용액의 대략 20 mL만 필요합니다. 분석되는 샘플 수에 따라 이 솔루션을 준비합니다.
2. 3.5M 아세테이트 버퍼 준비(pH = 4)
   1. 비커에 DI 수의 350 mL에 빙하 아세트산 100 mL을 희석. 마그네틱 스터디 바를 사용하여 부드럽게 녹입니다.
   2. 물에 수산화 나트륨 구슬을 사용하여 6.5 M NaOH 솔루션을 준비하십시오. NAOH 구슬 13g을 디수 40mL에 녹여 DI 물로 50mL의 최종 부피를 가져옵니다.
   3. 교반 바와 혼합하는 동안 아세트산 용액에 6.5M NaOH 용액의 약 46mL를 천천히 추가하십시오(pH를 4로 높여야 하지만 pH 미터를 사용하여 측정하면서 NaOH 용액을 천천히 첨가하여 확인하십시오).
   4. DI 물로 최종 볼륨을 500mL로 가져와 RT에 아세테이트 버퍼를 보관하십시오.
3. 티오바르비투릭산의 0.8% 수성 용액 제제(pH = 4로 조정)
   참고: 이 단계에서, 티오바르비투릭 산의 제제는 대량에 최적화되어 있으며, 이는 많은 수의 시료가 분석될 것이기 때문에(표준을 포함하지 않는 108개의 시료). 분석을 위해 계획된 샘플 수에 따라 이 솔루션을 준비합니다.
   1. 수산화 나트륨 구슬과 물을 사용하여 5M 나트륨 수산화 용액을 준비하십시오 : 수산화 나트륨 구슬 4 g을 20 mL의 최종 부피로 용해하십시오. 플라스틱 용기에 보관하십시오. 이 솔루션은 각 배치에 대해 새로 준비해야 합니다.
   2. 티오바르비투릭 산의 무게 4 g와 디 워터 450mL를 추가합니다. 마그네틱 스터디 바를 사용하여 부드럽게 녹입니다.
      참고: 이 솔루션은 결국 500mL 총 부피로 가져올 것입니다.
   3. 스티어 바와 티오바르비투릭 산을 용해하는 동안, 100 μL 증분에 5 M NaOH 용액의 약 3mL (천천히 그리고 드롭 와이즈 방식으로) 추가합니다. NaOH 용액을 추가한 후 티오바르비투르산 입자가 용해되기 시작합니다.
   4. 티오바르비투르산 입자가 여전히 완전히 용해되지 않은 경우, 모든 티오바르비투릭 산 입자가 완전히 용해될 때까지 100μL 증분에 5M NaOH 용액을 더 추가합니다. 이러한 특정 용액의 경우, 티오바르비투릭 산 입자를 완전히 용해시키기 위해 5M NaOH 용액의 총 4mL이 첨가된다.
      참고: 이 농도에서, 티오바르비투릭 산은 pH가 거의 4인 경우가 아니면 완전히 녹지 않을 것입니다.
   5. 모든 티오바르비투릭 산이 완전히 용해 된 후 NaOH를 추가 중지합니다. pH를 4를 초과하지 마십시오. 최종 pH는 혼합 티오바르비투릭 산 용액으로부터 1 μL을 복용하여 pH 용지에 배치하여 확인할 수 있습니다.
   6. 최종 부피를 DI 물로 500mL로 가져와 서서0.8% 티오바르비투릭 산 용액을 RT에 저장합니다.

3. 말론디알데히드 비스(디메틸 아세트탈) 표준 샘플 준비

참고: 말론다이얼데히드(MDA)는 불안정하며 시판할 수 없습니다. 그러나 MDA 테트라부틸람모늄 염, MDA 비스(디메틸 아세탈), MDA 비스(diethyl acetal)와 같이 상용화되는 다양한 화학적 형태가 있다. 이러한 세 가지 화학 형태 중 MDA 비스(dimethyl acetal)는 대부분의 연구가 동일한 표준을 사용하기 때문에 여기에서 사용됩니다^21,22. MDA의 다른 두 가지 화학 적 형태를 사용하기로 선택한 경우 적합성에 대한 사전 검증이 수행되어야합니다.

1. 순MDA 비스(디메틸 아세탈)의 92 μL을 DI 수의 1L에 희석하여 550 μM MDA 비스(디메틸 아세탈) 스톡 솔루션을 준비한다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 10분 동안 용액을 완전히 혼합합니다. 용액을 4°C로 저장하고 1개월 이내에 사용하십시오.
2. 디워터 1274μL의 550 μM MDA 비스(디메틸 아세탈) 스톡에서 726 μL을 희석하여 200 μM MDA 비스(디메틸 아세트탈)를 준비한다. 이 200 μM MDA 비스 (디메틸 아세트탈) 솔루션은 TBARS 분석이 수행 될 때마다 신선한 준비되어야한다.
3. 표준 곡선 준비: 8 2mL 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브를 가지고 200 μM 스톡에서 MDA 비스 (디메틸 아세트탈)를 추가하고 표 1에 설명 된 대로 물에 희석 H를 통해 문자 A로 라벨을 부착하십시오.
4. 8개의 유리 튜브(13mm x 100mm)를 가지고 A-H에 라벨을 붙인 다음 해당 튜브에 100 μL의 표준을 추가합니다. TBARS 분석기의 검출 한계를 계산하기 위해 빈 표준(샘플 A)에 대해 6개의 복제본을 수행합니다.
   참고: 프로토콜을 1h 이하로 일시 중지할 수 있습니다.

4. TBARS 분석

참고: TBARS 분석이 시작되면 멈추지 않고 완료해야 합니다.

1. 샘플 수를 분석하고 샘플의 이름으로 라벨을 붙일 수 있도록 필요한 만큼 유리 튜브를 가져 가라. 그런 다음, 각 유리 튜브에 각 준비된 샘플(위에서 설명한 대로)의 100 μL을 추가합니다.
2. 각 샘플에 8.1% SDS의 200 μL을 추가하고 표준을 정하고 부드럽게 샘플을 혼합하기 위해 원형 모션으로 유리 튜브를 소용돌이.
3. 각 샘플 및 표준에 3.5M 아세테이트 버퍼(pH = 4)의 1.5mL를 추가합니다.
4. 각 시료 및 표준에 수성 0.8% 티오바르비투릭 산 용액(pH = 4)의 1.5mL를 추가합니다.
5. 700 μL의 DI 물을 추가하여 각 시료및 표준에 대해 최종 부피를 4mL로 가져옵니다.
6. 각 유리 튜브를 단단히 캡하고 1 h에 대한 95 °C로 설정 된 가열 블록에서 배양하십시오. 유리 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 튜브 꼭대기에서 응축을 방지합니다.
7. 가열 블록에서 유리 튜브를 제거하고 30 분 동안 얼음에 배양하십시오.
8. 원심분리기 샘플 및 표준은 4°C에서 10분 동안 1500 x g의 샘플및 표준입니다. 원심 분리 후, RT에서 샘플 및 표준을 포함하는 유리 튜브를 유지합니다.
   참고: 샘플을 얼음 또는 4°C로 유지하면 전체 샘플 또는 표준이 침전됩니다.
9. 원심분리 직후, 각 튜브에서 150 μL의 상류체를 알리쿼트하여 96웰 플레이트의 별도의 우물에 넣습니다.
10. 파이펫 팁을 사용하여 각 우물에서 거품을 제거합니다.
    참고: 거품의 존재는 일관성없는 흡광도 판독값을 산출하여 높은 분석 부정확성으로 이어질 것입니다.
11. 532 nm에서 흡광도를 읽습니다. 다른 모든 흡광도 판독값에서 빈 샘플의 평균 흡광도 판독값을 뺍니다.
12. 각 표준의 알려진 농도 대 532 nm에서 빈 감도 흡수도 판독값을 플로팅하여 표준 곡선을 만듭니다. 선형 회귀를 사용하여 데이터 점을 맞춥시게 합니다. 표준 곡선에서 얻은 선형 회귀 라인의 방정식을 사용하여 알 수 없는 샘플 농도를 계산합니다.

결과

산성 조건(pH = 4)과 95°C에서 말론다이얼데히드(MDA) 비스(디메틸 아세트탈)는 ^MDA23을 산출한다. MDA와 밀접한 관련이 있는 화학 콘게너들은 티오바르비투르산(TBA)의 두 분자와 반응하여 티오바르비투릭 산 반응성 물질(TBARS)이라고 불리는 화합물을 생산하여 붉은 분홍색 색상을 주고 532nm에서 흡수성 _λmax 를 갖는다(도 1, 도 2). MDA ...

토론

그 한계에도 불구하고1,3,4,8,9,10,12,12,13,14,15,19 및 실험실 사이의 비교에 대한 적합성의 부족에도 불구하고, TBARS 분석은 가장 오래된 중 하나입니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L	VWR, PA	101642--262	cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube	Corning, NY	CLS430897	General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device	Fisher Scientific, NH	UFC510024	LDL purification
Caps for glass tubes	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	for TBARS assay
Copper II Chloride	SIGMA, MO	222011-250G	to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	eppendorf, NY	22363204	General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	General material
Fetal Bovine Serum US Source	Omega Scientific, CA	FB-11	for cell culture
Glacial Acetic Acid	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	cell lysis reagent
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL solvent
HepG2 Cells	ATCC, VA	HB-8065	Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge	Thermo Scientific, MA	75002431	General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma	Athens Research & Technology, GA	12-16-120412	Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment	VWR, PA	58948-025	General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer	Fisher Scientific, NH	51119200	To measure absorbance
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	cell lysis reagent
Sodium Chloride	SIGMA, MO	S7653-1KG	cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS Reagent
Sodium hydroxide	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap	USA Scientific, FL	658175	cell culture
Thiobarbituric Acid	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS Reagent
TRIS base	Fluka, GA	93362	cell lysis reagent
Trypsin (1x)	VWR, PA	16777-166	To detach HepG2 cells