JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Özet

Fare embriyonik kök hücrelerinin nöronal soylara kült haline alınması ve ayırt edilmesi için adım adım prosedürü ve ardından farklılaştırılmış hücreleri karakterize etmek için bir dizi tahlil açıklıyoruz. E14 fare embriyonik kök hücreleri, asılı bırakma yöntemiyle embriyoid cisimleri oluşturmak için kullanıldı ve daha sonra retinoik asit ile nöral progenitör hücrelere farklılaşmaya teşvik edildi ve son olarak nöronlara farklılaştı. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ve immünofluoresans deneyleri, nöral progenitörlerin ve nöronların sırasıyla 8 ve 12. Sox1 promotör güdümlü bir GFP muhabirini ifade eden bir E14 hattında yapılan akış sitometrisi deneyleri, 8. günde hücrelerin yaklaşık% 60'ının GFP pozitif olduğunu ve bu aşamada nöral progenitör hücrelerin başarılı farklılığını gösterdiğini göstermiştir. Son olarak, küresel transkriptomik değişikliklerin profilini çıkarmak için RNA-seq analizi kullanılmıştır. Bu yöntemler, nöronal farklılaşma sırasında hücre kimliği geçişini düzenlemede belirli genlerin ve yolların katılımını analiz etmek için yararlıdır.

Giriş

Gelişmekte olan fare blastosistlerinin iç hücre kütlesinden ilk türetmelerinden bu yana1,2, fare embriyonik kök hücreleri (mESC) kök hücre kendini yenileme ve farklılaşmayı incelemek için güçlü araçlar olarak kullanılmıştır3. Ayrıca, mESC farklılaşması, nörodejeneratif bozukluklar gibi hastalıkların tedavisinde kök hücre bazlı tedavide verimliliği ve güvenliği artırabilecek moleküler mekanizmaların muazzam bir şekilde anlaşılmasına yol açar4. Hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, bu in vitro sistem pratik ve değerlendirmede basitlik, hayvanların aksine hücre hatlarının bakımında düşük maliyet ve genetik manipülasyonlarda göreceli kolaylık gibi birçok avantaj sağlar. Bununla birlikte, farklılaştırılmış hücre türlerinin verimliliği ve kalitesi genellikle farklı mESC çizgilerinin yanı sıra farklılaşma yöntemlerinden etkilenir5,6. Ayrıca, farklılaşma verimliliğini değerlendirmek için geleneksel tahliller, sağlamlıktan yoksun olan seçilmiş marker genlerinin nitel incelemesine dayanır ve bu nedenle gen ifadesindeki küresel değişiklikleri kavrayamazlar.

Burada nöronal farklılaşmanın sistematik olarak değerlendirilmesi için bir dizi tahlil kullanmayı hedefliyoruz. Seçilen belirteçlerde hem geleneksel in vitro analizleri hem de RNA-seq kullanarak, bu süreçteki transkriptomik değişikliklerin yanı sıra farklılaşma verimliliğinin ölçümü için bir platform oluşturuyoruz. Daha önce belirlenmiş bir protokol7'ye dayanarak, asma damla tekniği ile embriyoid cisimleri (EBs) oluşturduk, ardından daha sonra nöral indüksiyon ortamına sahip nöronlara farklılaştırılmış olan nöral progenitör hücreler (NPC' ler) oluşturmak için suprafizyolojik retinoik asit (RA) kullanarak indüksiyon oluşturduk. Farklılaşmanın verimliliğini incelemek için, geleneksel RT-qPCR ve immünofluoresans (IF) testlerine ek olarak, RNA-seq ve akış sitometrisi gerçekleştirdik. Bu analizler, aşamaya özgü farklılaşmanın ilerlemesinin kapsamlı bir ölçümünü sağlar.

Protokol

1. mESC kültürü

  1. 10 cm doku kültürü ile işlenmiş bir plakayı% 0.1 jelatin ile kaplayın ve jelatin aspire etmeden önce en az 15-30 dakika ayarlanın.
  2. Önceden ısıtılmış mESC ortamında (Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) %15 fetal sığır serumu (FBS), esansiyel olmayan amino asitler ile mESC'leri kültlemeden bir gün önce tohum γ ışınlanmış fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler), β-mercaptoethanol, L-glutamin, penisilin/streptomisin, sodyum piruvat, LIF, PD0325901 (PD) ve Chir99021 (CH)).
  3. E14 hücrelerini kültlemeden önce γ ışınlanmış MEF'lerin yerleşmesine ve plaka yüzeyine bağlanmasına izin verin.
  4. E14 ESC'leri 37 °C su banyosunda çözün ve hücreleri ılık mESC ortamına sahip 15 cm konik bir tüpte hızla aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 200 x g'da peletin ve süpernatant çıkarın.
  5. Hücreleri 10 mL mL mESC ortamda yeniden depola ve hücreleri daha önce tohumlanmış γ ışınlanmış MEF'leri içeren kültür plakasına plakala. Hücre kültürünü% 5 CO2altında 37 ° C inkübatörde kuluçkaya yatırın.
  6. Kültür geçişi için, ortamı epire edin ve plakayı steril 1x PBS ile yıkayın. Plaka yüzeyini kaplayacak ve 37 °C'de 3 dakika kuluçkaya yatıracak kadar % 0,05 trypsin ekleyin.
  7. Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için trypsin'i mESC orta ve pipetle nötralize edin. Hücreleri 200 x g'da 3 dakika santrifüj edin ve üst yapıyı çıkarın.
  8. Hücreleri bir hemositometre veya hücre sayacı ile sayın ve 10 cm'lik bir kültür plakasında yaklaşık5.0 x 10 5 hücre tohum.
  9. Hücreleri 10 mL mL mESC ortamında yeniden biriktirin, jelatin kaplı doku kültürü plakasındaki hücreleri plaka edin ve daha önce açıklandığı gibi kültürleri kuluçkaya yatırın.
    NOT: Hücrelerin kolonilerinde farklılaşmalarını önlemek için her 2 günde bir MESC'lerin geçirilmesi önerilir. Ortadaki fenol kırmızısı sadece bir pH göstergesi olarak işlev görüyor ve hücresel yoğunluğa bağlı olarak, 2 günden daha kısa bir sürede sarımsı (daha asidik) hale gelebilir. Bu nedenle, ortamı her gün değiştirmek gerekebilir. γ ışınlanmış MEF'ler birkaç pasajdan sonra sonunda ölecekler.

2. EB, NPC ve nöron farklılaşması

  1. Daha önce bahsedilen kültür geçirme protokolünü gerçekleştirin ve hücreleri sayın (adım 1.7–1.10).
  2. Asılı bırakma yöntemi (gün 0)
    1. 10 cm hücre kültürü plakası için, 20 μL farklılaşma ortamında 5.0 x 102 hücrenin askıyaılacağı kabaca 2.5 x 104 hücre (%15 FBS'li DMEM, esansiyel olmayan amino asitler, β-mercaptoethanol, L-glutamin, penisilin/streptomisin ve sodyum pirruvat) sayar. Hücreleri içeren kabaca elli 20 μL damlacık, 10 cm'lik bir plaka üzerine kaplanabilir.
    2. Uygun sayıda hücreyi aliquot ve daha sonra 3 dakika boyunca 200 x g'da hücreleri santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.
    3. Hücreleri,20 μL başına 5,0 x 10 2 hücrelik bir hücre yoğunluğu için uygun farklılaşma ortamı hacminde yeniden biriktirin (örneğin, 1 mL farklılaşma ortamında2,5 x 10 4 hücre).
    4. Bir mikropipette veya tekrarlayıcı pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 20 μL damlacığı doku kültürü plakasının kapağına yerleştirin. Damlacıkların birleşmesini önlemek için birbirine çok yakın olmadığından emin olun.
      NOT: Damlacıklar, plakanın kendisine değil, kapağın üzerine yerleştirileceği için doku kültürüyle işlenmiş bir bağlantı plakasına veya süspansiyon plakasına kaplanabilir. Daha uygulanabilir ve steril bir yaklaşım için, damlacıkları bir bağlantı doku kültürü plakasına plakalayın ve aşağıda açıklandığı gibi bir süspansiyon plakasına aktarın.
    5. Plakayı 5-10 mL 1x PBS ile doldurun ve kapağı dikkatlice tabağa geri koyun. Kültürü 37 °C inkübatörde kuluçkaya yatırın.
      NOT: Damlacıkların kurumasını önlemek için kültür plakasına PBS eklenir.
  3. 2. günde,damlacıkları kapaktan toplamak ve 10 mL farklılaşma ortamı ile dolu 10 cm hücre kültürü süspansiyon plakasına yerleştirmek için bir mikropipette kullanın. Kuluçka makinesinde düşük hızda sallanan bir yörüngesel çalkalayıcı üzerinde kültürü kuluçkaya yatırın.
  4. 4. günde, EB'leri toplamak için, hücreleri toplayın, 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjün ve süpernatantı çıkarın.
    NOT: ED'ler, sonraki deneylerin gereksinimlerine göre 1x PBS ile de yıkanabilir.
  5. Prosedüre devam etmek ve EB farklılaşmasını nöral progenitör hücrelere (NPC' ler) teşvik etmek için, farklılaşma ortamını 5 μM retinoik asit (RA) ile hazırlayın.
  6. 3 dakika boyunca 100 x g'da 100 x g'da EB'leri peletleyarak eski ortamı çıkarın veya eski ortamı arzulamadan önce ED'lerin yerleşmesine izin verin. Kültür plakasına 5 μM RA içeren farklılaşma ortamının 10 mL'lik kısmını ekleyin.
  7. 6. günde,plakayı eğerek ve yukarıda açıklandığı gibi ortamı pipetleyarak ortamın en az yarısını 5 μM RA içeren taze ortamla değiştirin.
    NOT: Ortamın en az yarısının 5 ve 7. günlerde taze RA içeren ortamla değiştirilmesi önerilir. Fenol kırmızı göstergesini not alın; sarımsı olursa, tüm ortamı değiştirmek en iyisidir.
  8. 8. günde,hücreleri toplayarak, 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj yaparak ve süpernatantı çıkararak NPC'leri hasat edin.
    NOT: NPC'ler, sonraki deneylerin ihtiyaçlarına göre 1x PBS ile de yıkanabilir. Gerekirse, NPC'ler daha sonraki kültür ve analizler için dondurulabilir ve tekrar çözülebilir. NPC'ler kültürlenecekse, trypsin'e alternatif olarak accutase de kullanılabilir.
  9. Prosedüre devam etmek ve NPC'leri nöronlara ayırt etmek için, NPC'leri santrifüjleme ile 15 mL konik bir tüpte toplayın, tripsinle ayırın ve 37 ° C'de 3 dakika kuluçkaya yatırın. Tüm NPC agregalarının ayrışmasını sağlamak ve trypsin'i ortamla nötralize etmek için NPC'leri pipetle.
  10. Hücreleri 40 μm naylon hücre süzgeçli filtreleyin ve hücreleri N2 ortamında 1,5 x 105/cm2 yoğunluğa kaplamadan önce sayın (DMEM/F12 orta + 3 mg/mL glikoz + 3 mg/mL lipid bakımından zengin sığır sonraki PCR ve batı leke deneyleri için doku kültürüyle işlenmiş bir plaka üzerinde serum albümin (LBSA) + 1:100 N2 takviyesi + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL kalem/strep + 1 mM L-glutamin); veya immünofluoresans deneyleri için bir doku kültürü odasında.
  11. 9. günde,eski ortamı taze bir N2 ortamı ile değiştirin.
  12. 10. günde,N2 ortamını N2/B27 ortamı (%50 DMEM/F12 ve %50 nöral bazal, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 takviyesi, 1:100 B27 takviyesi, 50 U/mL kalem/strep ve 1 mM L-glutamin) ile değiştirin.
  13. 11-12 gün, nöronları aşağıdaki gibi hasat edin. Hücreleri 1x PBS ile yıkayın, tripsin ekleyin ve tripini 3 dakika boyunca 200 x g'da orta ve santrifüj ile nötralize etmeden önce 37 °C inkübatördeki kültürü 3 dakika kuluçkaya yatırın.

3. MESC'lerin ve farklılaştırılmış hücrelerin karakterizasyonu

  1. Alkali fosfataz (AP) tahlili
    1. Alkali fosfataz aktivitesini değerlendirmek için bir kit kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Ortamı kültür plakasından çıkarın ve ESC'leri 1x PBS ile yıkayın.
    3. Kit ile birlikte verilen sabit çözeltinin 1 mL'lik kısmını (formaldehit ve metanolden oluşur) tabağa ekleyin ve oda sıcaklığında 2-5 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Düzeltme çözümündeki aşırı inkübasyon AP etkinliğini tehlikeye atabilir.
    4. Düzeltme çözümünü çıkarın, ESC'leri 1x PBS ile yıkayın ve plakada bir miktar PBS bırakın.
      NOT: AP etkinliğini tehlikeye atmayacak şekilde ESC'leri PBS'de nemli tutun.
    5. A, B ve C substrat çözümlerini 1:1:1 oranında karıştırarak AP çözümünü hazırlayın. Önce A ve B çözeltilerini karıştırın ve C çözeltisini eklemeden önce karışımı oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın.
    6. 1x PBS'yi çıkarın ve daha önce hazırlanan AP çözümünü ekleyin.
    7. Kültür plakasını alüminyum folyo ile sararak veya karanlık bir odada 3.5 adımını gerçekleştirerek ESC'leri karanlıkta yaklaşık 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    8. Reaksiyonun izlenmesi ve spesifik olmayan lekelerin önlenmesi için çözelti parlak olduğunda reaksiyon çözeltisini çıkarın.
    9. ESC'leri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    10. ESC'leri 1x PBS veya montaj ortamı ile kaplayarak numunenin kurumasını önleyin.
      NOT: AP ifadesi için kırmızı veya mor bir leke görünecektir. Plaka 4 °C buzdolabında saklanabilir.
  2. RT-qPCR
    1. ESC'ler, ESB'ler ve NPC'ler için sırasıyla 1.6–1.7 ve 2.4 adımlarını izleyerek çeşitli aşamalarda hücreleri toplayın.
    2. RNA, DNA ve protein ekstraksiyon çözeltisi kullanarak RNA'yı izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Ters transkriptaz kiti ile cDNA oluşturun (Malzeme Tablosunabakın) ve üreticinin el kitabını izleyin.
  3. Sabitleme ve gömme
    1. Yukarıda açıklandığı gibi EBs ve NPC'leri hasat edin (adım 2.6) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1x PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile sabitlayın.
    2. PFA'yı çıkarın ve numuneyi 1x PBS ile 5 dakika yıkayın.
    3. Numuneyi 25\u201228 °C'de 1x PBS, %10-, %20 ve %30 sakkaroz çözeltilerinin seri seyreltilmesine yerleştirin ve burada numune 30 dakikalık inkübasyondan sonra bir sonraki çözüme aktarılır.
      NOT: Numune, gömme adımına devam etmeden önce% 30 sakkaroz çözeltisinde 4 °C'de saklanabilir.
    4. Numuneyi (istiflemeden) kriyo-kalıbın ortasına yerleştirmeden önce pipet ucunu sakkaroz çözeltisi ile ıslatın ve fazla sıvıyı pipetlayın.
      NOT: Filtre kağıdı fazla çözeltiyi çıkarmak için de kullanılabilir. Pipet ucunu sakkaroz çözeltisi ile ıslatmak, EBs ve NPC'lerin ucun duvarlarına yapışmasını önlemek için önemlidir.
    5. Numuneleri yeniden canlandırmadan kalıba optimum kesme sıcaklığı (OCT) çözeltisi dikkatlice ekleyin ve fazla kabarcıkları pipetle çıkarın.
    6. Numuneyi 15 dakika hafifçe çalkalamak için numuneyi bir laboratuvar mikserine düşük hızda yerleştirin. Bu, EBS ve NPC'lerin OCT çözümünde yeniden nünmeleri durumunda en alta yerleşmesine yardımcı olur.
    7. Kalıbı sıvı nitrojene veya kuru buza yerleştirerek numuneyi hızla dondurun.
      NOT: Numuneler bir sonraki adıma geçmeden önce -70 °C dondurucuda saklanabilir.
  4. Kriyoseksiyon
    1. Numuneyi cihaza aktarmadan önce kriyostatı -20 ila -18 °C'ye kadar soğumaya ayarlayın.
    2. Donmuş OCT bloğunu kalıptan ayırın ve tutucunun yüzeyine yerleştirilmiş küçük bir OCT çözeltisi ile tutucuya sabitleyin.
    3. EBS'ler ve NPC'ler kesitleme sırasında numunenin kaybolmamasını sağlamak için bıçağa en yakın olacak şekilde OCT bloğunu hizalayın.
    4. Bloğun 10 μm'lik bölümünü dikkatlice bölümleyin ve numuneyi içeren dilimlere çok dikkat edin.
    5. Numuneyi içeren OCT dilimini doku gömme cam kaydırağın üzerine hızla yerleştirin ve OCT dilimlerinin oda sıcaklığında 1 saat boyunca havayla kurumasını bekleyin.
      NOT: Numuneler daha sonra kullanılmak üzere -70 °C'de saklanabilir.
  5. İmmünofluoresans (IF)
    1. %10 normal eşek serumunda nöron içeren OCT bölümlerini veya kültür odalarını bloke edin/%0,1 Triton X-100 1x PBS'de oda sıcaklığında 1 saat.
    2. %5 normal eşek serumunda seyreltilmiş primer antikordaki örnekleri inkübasyona sokun/%0,05 Triton X-100 1x PBS'de bir gecede 4 °C'de.
    3. Numuneleri 1x PBS/%0,1 Triton X-100 üç kez 5 dakika boyunca yıkayın.
    4. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1x PBS'de %5 normal eşek serumu/%0,05 Triton X-100'de seyreltilmiş ikincil antikorla kuluçkaya yatırın.
    5. Numuneleri 1x PBS/%0,1 Triton X-100 üç kez 5 dakika boyunca yıkayın, ardından numuneleri 1 μg/mL DAPI'da kuluçkaya yatırın.
    6. Numuneleri bir kapak ve bir miktar montaj ortamı ile monte edin ve kurumasını bekleyin.
    7. Floresan mikroskop altında örnekleri gözlemleyin.
  6. RNA-seq analizi
    1. Hücreleri çeşitli aşamalarda toplayın ve RNA ayıklaması gerçekleştirin (bkz. adım 3.2).
    2. cDNA kütüphanelerini hazırlayın, Wang ve ark.8'deaçıklanan protokole göre derin sıralama ve veri analizi yapın.
    3. Gene Ontology (GO) analizini R paketi clusterProfiler kullanarak gerçekleştirin.
  7. Akış sitometrisi
    1. 1.6–1.7 adımlarını izleyerek ESC'leri toplayın ve hücreleri orta olarak yeniden uygulayın. 2.4 adımını izleyerek DB'leri ve NPC'leri toplayın ve hücreleri orta olarak yeniden biriktirin.
    2. 40 μm naylon hücre süzgecini kullanarak hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL konik tüpe filtreleyin.
    3. Akış sitometresini (kurumun çekirdek tesisi tarafından gerçekleştirilen) kullanarak numunelerin GFP sinyalini ölçün.

Sonuçlar

Yöntemimizin bir temsili olarak, E14 hücreleri üzerinde EB, NPC ve nöron farklılaşma deneyi gerçekleştirdik. E14 hücreleri, γ ışınlanmış MEF popülasyonu seyreltilene kadar γ ışınlanmış MEF'lerde kültürlenmiştir (Şekil 1A). Nanog ve Oct4 belirteçleri için Alkalin Fosfataz (AP) boyama ( Şekil 1B ) ve daha sonra RT-qPCR (aşağıya bakın) gerçekleştirerekE14hücrelerinin pluripotency'liğini doğruladık. γ ışın...

Tartışmalar

Fare embriyonik kök hücrelerinin sinirsel farklılaşması için yöntem onlarca yıldır oluşturulmuştur ve araştırmacılar önceki protokolleri değiştirmeye veya çeşitli amaçlar için yenilerini oluşturmaya devam etmişlerdir7,10,11. MESC'lerin nöronlara farklılaşma aşamalarının verimliliğini ve ilerlemesini kapsamlı bir şekilde analiz etmek için bir dizi tahlil kullandık, bu da fare veya insan ESC'lerin...

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarların olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH'den (1R35GM133496-01) Z. Gao'ya verilen bir hibe ile desteklendi. Bölümlemedeki yardımları için Dr. Ryan Hobbs'a teşekkür ederiz. Penn State College of Medicine'ın Genom Bilimleri ve Biyoinformatik, İleri Işık MikroskopiSi Görüntüleme ve Akış Sitometrisi gibi temel tesislerine teşekkür ediyoruz. Ayrıca RNA-seq analizindeki yardımları için Dr. Yuka Imamura'ya teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1XCorning25-052-CV
0.1% GelatinSigmaG1890-100GPrepared in de-ionized water
16% ParaformaldehydeThermo Scientific28908Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainerFalcon352340
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11001Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit IIStemgent00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRoxAzura GenomicsAZ-2105
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
BD FACSCantoBD657338
bFGFSigma11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626
Chir99021Cayman Chemicals13122
ChloroformC298-500Fisher Chemical
DAPIInvitrogenR37606
DMEMCorning10-017-CM
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320033
EB bufferQiagen19086
Ethanol111000200PharmcoDiluted in de-ionized water
Fetal bovine serumAtlanta BiologicalsS10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY-401-2501
IsopropanolBDH1133-4LGBDH VWR AnalyticalDiluted in de-ionized water
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030024
LIFN/AN/ACollected from MEF supernatant
m18srRNA primersIDTDNAN/A5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acidsCorning25-025-Cl
mNanog primersIDTDNAN/A5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primersIDTDNAN/A5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primersIDTDNAN/A5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primersIDTDNAN/A5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primersIDTDNAN/A5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nestin primary antibodyMilliporeMAB5326Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basalThermo Fisher Scientific21103049
Neurofilament primary antibodyDSHB2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep KitBioO ScientificNOVA-5138-07
PD0325901Cayman Chemicals13034
Penicillin/streptomycinCorning30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS)N/AN/APrepared in de-ionized water
- Potassium chlorideP217-500GVWR
- Potassium phosphate monobasic anhydrous0781-500GVWR
- Sodium chlorideBP358-10Fisher Bioreagents
- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrateSX0715-1Milipore
Random hexamer primerThermo ScientificSO142
Retinoic acidSigmaR2625Prepared in DMSO
Sodium pyruvateCorning25-000-Cl
SucroseSigma84097Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen18064022
Tissue-Tek O.C.T. compoundSakura4583
TriPure Isolation ReagentSigma-Aldrich11667165001
TruSeq RapidIllumina20020616
β-mercaptoethanolFisher BioReagentsBP176-100

Referanslar

  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
  3. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  4. Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
  5. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  6. McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
  7. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  8. Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
  9. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
  10. Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
  11. Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
  12. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
  13. Park, Y. -. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  14. Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
  15. Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
  16. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
  17. Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  18. Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  19. Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
  20. Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
  21. Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
  22. Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
  23. Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  24. Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
  25. Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
  26. Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 159Fare embriyonik k k h crelerembriyoid cisimlern ral progenit r h cren ronlarfarkl la maas l d meE14

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır