Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Zusammenfassung

Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.

Zusammenfassung

Wir beschreiben das schrittweise Verfahren zur Kultivierung und Differenzierung embryonaler Stammzellen von Mäusen in neuronale Linien, gefolgt von einer Reihe von Assays zur Charakterisierung der differenzierten Zellen. Die embryonalen Stammzellen der E14-Maus wurden verwendet, um embryoide Körper durch die Hängende-Drop-Methode zu bilden, und dann induziert, sich durch Retinsäure in neuronale Vorläuferzellen zu differenzieren und schließlich in Neuronen zu differenzieren. Quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) und Immunfluoreszenzexperimente zeigten, dass die neuronalen Vorläufer und Neuronen am Tag 8 bzw. 12 nach der Differenzierung entsprechende Marker (Nestin für neuronale Vorläufer und Neurofilament für Neuronen) aufweisen. Durchflusszytometrie-Experimente an einer E14-Linie, die einen Sox1-Promotor-gesteuerten GFP-Reporter exprimierte, zeigten, dass etwa 60% der Zellen an Tag 8 GFP-positiv sind, was auf die erfolgreiche Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen in diesem Stadium hinweist. Schließlich wurde die RNA-seq-Analyse verwendet, um die globalen transkriptomischen Veränderungen zu profilieren. Diese Methoden sind nützlich, um die Beteiligung bestimmter Gene und Signalwege an der Regulierung des Zellidentitätsübergangs während der neuronalen Differenzierung zu analysieren.

Einleitung

Seit ihrer ersten Ableitung aus der inneren Zellmasse der sich entwickelnden Mausblastozysten^1,2, wurden embryonale Mausstammzellen (mESC) als leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzellen verwendet³. Darüber hinaus führt die Untersuchung der mESC-Differenzierung zu einem enormen Verständnis molekularer Mechanismen, die die Effizienz und Sicherheit in der stammzellbasierten Therapie bei der Behandlung von Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen verbessern können⁴. Im Vergleich zu Tiermodellen bietet dieses In-vitro-System viele Vorteile, darunter Einfachheit in der Praxis und Bewertung, geringe Kosten bei der Pflege von Zelllinien im Gegensatz zu Tieren und relative Leichtigkeit bei genetischen Manipulationen. Die Effizienz und Qualität differenzierter Zelltypen wird jedoch häufig durch unterschiedliche Linien von mES-Zellen sowie die Differenzierungsmethoden^5,6beeinflusst. Auch die traditionellen Assays zur Bewertung der Differenzierungseffizienz beruhen auf der qualitativen Untersuchung ausgewählter Markergene, denen es an Robustheit mangelt und die daher globale Veränderungen in der Genexpression nicht erfassen.

Hier wollen wir eine Batterie von Assays zur systematischen Beurteilung der neuronalen Differenzierung einsetzen. Mit traditionellen In-vitro-Analysen an ausgewählten Markern und RNA-seq etablieren wir eine Plattform zur Messung der Differenzierungseffizienz sowie der transkriptomischen Veränderungen während dieses Prozesses. Basierend auf einem zuvor etablierten Protokoll⁷erzeugten wir embryoide Körper (EBs) durch die Hanging-Drop-Technik, gefolgt von induktion unter Verwendung supraphysiologischer Mengen an Retinsäure (RA), um neuronale Vorläuferzellen (NPCs) zu erzeugen, die anschließend zu Neuronen mit neuronalem Induktionsmedium differenziert wurden. Um die Effizienz der Differenzierung zu untersuchen, haben wir zusätzlich zu den traditionellen RT-qPCR- und Immunfluoreszenz(IF)-Assays RNA-seq und Durchflusszytometrie durchgeführt. Diese Analysen liefern eine umfassende Messung des Verlaufs der stufenspezifischen Differenzierung.

Protokoll

1. mESC-Kultur

1. Beschichten Sie eine 10 cm gewebekulturbehandelte Platte mit 0,1% Gelatine und lassen Sie die Gelatine mindestens 15-30 min aushärten, bevor Sie sie aussaugen.
2. Samen γ-bestrahlten embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus einen Tag vor der Kultivierung der mESCs im vorgewärmten mESC-Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 15% fetalem Rinderserum (FBS), nicht-essentiellen Aminosäuren, β-Mercaptoethanol, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin, Natriumpyruvat, LIF, PD0325901 (PD) und Chir99021 (CH)).
3. Lassen Sie die γ bestrahlten MEFs sich absetzen und an der Plattenoberfläche befestigen, bevor Sie E14-Zellen kultivieren.
4. E14 ESCs im 37 °C Wasserbad auftauen und die Zellen in einem 15 cm konischen Röhrchen mit warmem mESC-Medium schnell übertragen. Die Zellen bei 200 x g für 3 min pelletieren und den Überstand entfernen.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml mESC-Medium und platten Sie die Zellen auf der Kulturplatte, die die zuvor γ bestrahlten MEFs enthält. Inkubieren Sie die Zellkultur in einem 37 °C Inkubator unter 5%_CO2.
6. Für die Kulturübergabe das Medium ansaugen und die Platte mit sterilen 1x PBS waschen. Fügen Sie genügend 0,05% Trypsin hinzu, um die Plattenoberfläche zu bedecken, und inkubieren Sie bei 37 °C für 3 min.
7. Neutralisieren Sie das Trypsin mit mESC-Medium und Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
8. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler und säen Sie etwa 5,0 x 10⁵ Zellen in eine 10 cm große Kulturplatte.
9. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml mESC-Medium, platten Sie die Zellen auf die mit Gelatine beschichtete Gewebekulturplatte und inkubieren Sie Kulturen wie zuvor beschrieben.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, dass mESCs alle 2 Tage durchquert werden, um zu verhindern, dass sich die Zellen in ihren Kolonien differenzieren. Phenolrot im Medium fungiert ausschließlich als pH-Indikator und kann je nach Zelldichte früher als 2 Tage gelblich (saurer) werden. Daher kann es notwendig sein, das Medium jeden Tag zu wechseln. Die γ-bestrahlten MEFs werden schließlich nach ein paar Passagen absterben.

2. EB-, NPC- und Neuronendifferenzierung

1. Führen Sie das bereits erwähnte Kultur-Passaging-Protokoll durch und zählen Sie die Zellen (Schritte 1.7–1.10).
2. Hängende Tropfenmethode (Tag 0)
   1. Zählen Sie für eine 10 cm Große Zellkulturplatte etwa 2,5 x 10⁴ Zellen, wobei 5,0 x^{10 2} Zellen in einem 20 μL-Differenzierungsmedium suspendiert werden (DMEM mit 15% FBS, nicht-essentiellen Aminosäuren, β-Mercaptoethanol, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin und Natriumpyruvat). Etwa fünfzig 20 μL Tröpfchen, die die Zellen enthalten, können auf einer 10 cm großen Platte plattiert werden.
   2. Aliquotieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen und zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 200 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
   3. Resuspendieren Sie die Zellen im geeigneten Volumen des Differenzierungsmediums für eine Zelldichte von 5,0 x^{10 2} Zellen pro 20 μL (z. B. 2,5 x 10⁴ Zellen in 1 ml Differenzierungsmedium).
   4. Mit einer Mikropipette oder einer Repeaterpipette 20 μL Tröpfchen der Zellsuspension auf den Deckel der Gewebekulturplatte geben. Stellen Sie sicher, dass die Tröpfchen nicht zu nahe beieinander liegen, um zu verhindern, dass sie verschmelzen.
      HINWEIS: Die Tröpfchen können entweder auf einer mit Gewebekulturen behandelten Befestigungsplatte oder einer Suspensionsplatte plattiert werden, da sie auf dem Deckel und nicht auf der Platte selbst platziert werden. Für einen praktikableren und sterileren Ansatz plätten Sie die Tröpfchen auf einer Befestigungs-Gewebekulturplatte und übertragen Sie sie wie unten beschrieben auf eine Suspensionsplatte.
   5. Füllen Sie die Platte mit 5–10 ml 1x PBS auf und setzen Sie den Deckel vorsichtig wieder auf die Platte. Inkubieren Sie die Kultur im 37 °C Inkubator.
      HINWEIS: PBS wird der Kulturplatte zugesetzt, um zu verhindern, dass die Tröpfchen austrocknen.
3. Am Tag 2sammeln Sie mit einer Mikropipette die Tröpfchen aus dem Deckel und legen Sie sie in eine 10 cm große Zellkultur-Suspensionsplatte, die mit 10 ml Differenzierungsmedium gefüllt ist. Inkubieren Sie die Kultur auf einem Orbitalschüttler, der mit niedriger Geschwindigkeit im Inkubator schüttelt.
4. Am Tag 4,um die EBs zu ernten, sammeln Sie die Zellen, zentrifugieren Sie bei 200 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
   HINWEIS: Die EBs können auch mit 1x PBS gemäß den Anforderungen nachfolgender Experimente gewaschen werden.
5. Um das Verfahren fortzusetzen und die EB-Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) zu induzieren, bereiten Sie das Differenzierungsmedium mit 5 μM Retinsäure (RA) vor.
6. Entfernen Sie das alte Medium, indem Sie die EBs bei 100 x g für 3 min pelletieren oder lassen Sie die EBs absetzen, bevor Sie das alte Medium aussaugen. 10 mL des Differenzierungsmediums, das 5 μM RA enthält, in die Kulturplatte geben.
7. Ersetzen Sie am Tag 6mindestens die Hälfte des Mediums durch ein frisches Medium, das 5 μM RA enthält, indem Sie die Platte kippen und das Medium wie oben beschrieben pipettieren.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, an den Tagen 5 und 7 mindestens die Hälfte des Mediums durch frisches RA-haltiges Medium zu ersetzen. Beachten Sie den phenolroten Indikator; Wenn es gelblich wird, ist es am besten, das gesamte Medium zu ersetzen.
8. Am Tag 8erntet ihr die NPCs, indem ihr die Zellen sammelt, 3 min lang bei 200 x g zentrifugiert und den Überstand entfernt.
   HINWEIS: Die NPCs können auch mit 1x PBS gewaschen werden, je nach den Bedürfnissen nachfolgender Experimente. Bei Bedarf können NPCs eingefroren und für die spätere Kultur und Analyse wieder aufgetaut werden. Sollen die NPCs kultiviert werden, kann Accutase auch als Alternative zu Trypsin verwendet werden.
9. Um das Verfahren fortzusetzen und NPCs zu Neuronen zu differenzieren, sammeln Sie NPCs in einem 15 ml konischen Rohr durch Zentrifugation, dissoziieren Sie sie mit Trypsin und inkubieren Sie sie bei 37 ° C für 3 min. Pipettieren Sie die NPCs, um sicherzustellen, dass alle NPC-Aggregate dissoziiert sind und neutralisieren Sie das Trypsin mit dem Medium.
10. Filtern Sie die Zellen mit einem 40 μm Nylon-Zellsieb und zählen Sie die Zellen, bevor Sie sie mit einer Dichte von 1,5 x 10⁵/ cm² in N2-Medium (DMEM / F12-Medium + 3 mg / ml Glukose + 3 mg / ml lipidreiches Rinderserumalbumin (LBSA) + 1:100 N2-Präparat + 10 ng / ml bFGF + 50 U / ml Pen / Streptokokken + 1 mM L-Glutamin) auf einer mit Gewebekultur behandelten Platte für nachfolgende PCR- und Western-Blot-Experimente plattieren; oder auf einer Gewebekulturkammer für Immunfluoreszenzexperimente.
11. Ersetzen Sie am Tag 9das alte Medium durch ein frisches N2-Medium.
12. Wechseln Sie am Tag 10das N2-Medium mit N2/B27-Medium (50% DMEM/F12 und 50% neural basal, 3 mg/ml LBA, 1:200 N2-Präparat, 1:100 B27-Präparat, 50 U/ml Pen/Streptokokken und 1 mM L-Glutamin).
13. An den Tagen 11-12ernten Sie die Neuronen wie folgt. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS, fügen Sie Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Kultur im 37 ° C-Inkubator für 3 min, bevor Sie das Trypsin mit Medium neutralisieren und 3 min bei 200 x g zentrifugieren.

3. Charakterisierung von mES-Zellen und differenzierten Zellen

1. Alkalischer Phosphatase (AP) Assay
   1. Verwenden Sie ein Kit, um die alkalische Phosphataseaktivität zu beurteilen (siehe Materialtabelle).
   2. Entfernen Sie das Medium von der Kulturplatte und waschen Sie die ESCs mit 1x PBS.
   3. 1 ml der fixen Lösung (besteht aus Formaldehyd und Methanol), die mit dem Kit geliefert wurde, auf die Platte geben und bei Raumtemperatur für 2–5 min inkubieren.
      HINWEIS: Eine Überinkubation in der Fixlösung kann die AP-Aktivität beeinträchtigen.
   4. Entfernen Sie die Fixlösung, waschen Sie die ESCs mit 1x PBS und lassen Sie eine gewisse Menge PBS in der Platte.
      HINWEIS: Halten Sie die ESCs in PBS feucht, um die AP-Aktivität nicht zu beeinträchtigen.
   5. Bereiten Sie die AP-Lösung vor, indem Sie die A-, B- und C-Substratlösungen im Verhältnis 1:1:1 mischen. Mischen Sie zuerst A- und B-Lösungen und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 2 min, bevor Sie die C-Lösung hinzufügen.
   6. Entfernen Sie die 1x PBS, und fügen Sie die zuvor vorbereitete AP-Lösung hinzu.
   7. Inkubieren Sie die ESCs für ca. 15 min im Dunkeln, indem Sie die Kulturplatte mit Alufolie umwickeln oder Schritt 3.5 in einem dunklen Raum durchführen.
   8. Überwachen Sie die Reaktion und entfernen Sie die Reaktionslösung, wenn die Lösung hell wird, um unspezifische Flecken zu vermeiden.
   9. Waschen Sie die ESCs zweimal mit 1x PBS.
   10. Verhindern Sie das Austrocknen der Probe, indem Sie die ESCs mit 1x PBS oder Montagemedium abdecken.
       HINWEIS: Für den AP-Ausdruck erscheint ein roter oder violetter Fleck. Der Teller kann in einem 4 °C Kühlschrank aufbewahrt werden.
2. RT-qPCR
   1. Sammeln Sie Zellen in verschiedenen Stadien, indem Sie die Schritte 1.6-1.7 und 2.4 für ES-Zellen bzw. EBs bzw. NPCs ausführen.
   2. Isolieren Sie RNA mit RNA, DNA und Proteinextraktionslösung (siehe Tabelle der Materialien).
   3. Generieren Sie cDNA mit einem Reverse-Transkriptase-Kit (siehe Materialtabelle)und folgen Sie dem Handbuch des Herstellers.
3. Fixierung und Einbettung
   1. Ernten Sie EBs und NPCs wie oben beschrieben (Schritt 2.6) und fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung in 1x PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
   2. Entfernen Sie die PFA und waschen Sie die Probe mit 1x PBS für 5 min.
   3. Die Probe wird in eine serielle Verdünnung von 1x PBS-, 10%-, 20%- und 30%-Saccharoselösungen bei 25°u201228 °C gegeben, wobei die Probe nach 30 min Inkubation in die nächste Lösung überführt wird.
      HINWEIS: Die Probe kann in der 30%igen Saccharoselösung bei 4 °C gelagert werden, bevor mit dem Einbettungsschritt fortgefahren wird.
   4. Befeuchten Sie die Pipettenspitze mit Saccharoselösung, bevor Sie die Probe (ohne sie zu stapeln) in die Mitte der Kryoform geben und die überschüssige Flüssigkeit auspipetieren.
      HINWEIS: Filterpapier kann auch verwendet werden, um die überschüssige Lösung zu entfernen. Die Benetzung der Pipettenspitze mit Saccharoselösung ist wichtig, um zu verhindern, dass die EBs und NPCs an den Wänden der Spitze haften bleiben.
   5. Geben Sie der Form vorsichtig eine optimale Schneidtemperaturlösung (OCT) hinzu, ohne die Proben erneut zu verwenden, und entfernen Sie überschüssige Blasen mit einer Pipette.
   6. Legen Sie die Form mit der Probe bei niedriger Geschwindigkeit auf einen Labormischer, um die Probe 15 Minuten lang leicht zu rühren. Dies hilft, die EBs und NPCs unten zu platzieren, wenn sie in der OCT-Lösung resuspendiert werden.
   7. Frieren Sie die Probe schnell ein, indem Sie die Form in flüssigen Stickstoff oder auf Trockeneis legen.
      HINWEIS: Die Proben können in einem Gefrierschrank von -70 °C gelagert werden, bevor sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
4. Kryosektion
   1. Stellen Sie den Kryostaten auf -20 bis -18 °C ab, bevor Sie die Probe auf das Gerät übertragen.
   2. Lösen Sie den gefrorenen OCT-Block von der Form und befestigen Sie ihn mit einer kleinen OCT-Lösung auf der Oberfläche des Halters.
   3. Richten Sie den OAT-Block so aus, dass die EBs und NPCs dem Blade am nächsten sind, um sicherzustellen, dass die Probe während des Schneidens nicht verloren geht.
   4. Schneiden Sie vorsichtig 10 μm des Blocks und achten Sie genau auf die Scheiben, die die Probe enthalten.
   5. Legen Sie die OCT-Scheibe, die die Probe enthält, schnell auf den Glasträger mit Gewebeeinbettung und lassen Sie die OCT-Scheiben 1 h bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
      HINWEIS: Die Proben können bei -70 °C für die spätere Verwendung gelagert werden.
5. Immunfluoreszenz (IF)
   1. Blockieren Sie OCT-Abschnitte oder Kulturkammern, die Neuronen in 10% normalem Eselserum / 0,1% Triton X-100 in 1x PBS für 1 h bei Raumtemperatur enthalten.
   2. Inkubieren Sie die Proben in primären Antikörpern, verdünnt in 5% normalem Eselserum/0,05% Triton X-100 in 1x PBS über Nacht bei 4 °C.
   3. Proben in 1x PBS/0,1% Triton X-100 dreimal für 5 min pro Wäsche waschen.
   4. Inkubieren Sie die Proben mit sekundärem Antikörper, verdünnt in 5% normalem Eselserum/0,05% Triton X-100 in 1x PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
   5. Proben in 1x PBS/0,1% Triton X-100 dreimal für jeweils 5 min waschen und die Proben dann in 1 μg/ml DAPI inkubieren.
   6. Montieren Sie die Proben mit einem Deckglas und etwas Montagemedium und lassen Sie sie trocknen.
   7. Beobachten Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop.
6. RNA-seq-Analyse
   1. Sammeln Sie die Zellen in verschiedenen Stadien und führen Sie eine RNA-Extraktion durch (siehe Schritt 3.2).
   2. Bereiten Sie die cDNA-Bibliotheken vor, führen Sie eine tiefe Sequenzierung und Datenanalyse gemäß dem in Wang et al.⁸beschriebenen Protokoll durch.
   3. Führen Sie die GO-Analyse (Gene Ontology) mit dem R-Paket clusterProfiler durch.
7. Durchflusszytometrie
   1. Sammeln Sie ES-Zellen, indem Sie die Schritte 1.6-1.7 ausführen und die Zellen in Medium resuspendieren. Sammle die EBs und NPCs, indem du Schritt 2.4 befolgest, und resuspendiere die Zellen in Medium.
   2. Filtern Sie die Zellsuspension mit dem 40 μm Nylon-Zellsieb in ein neues 15 mL konisches Rohr.
   3. Messen Sie das GFP-Signal der Proben mit dem Durchflusszytometer (durchgeführt von der Core Facility der Institution).

Ergebnisse

Als Darstellung unserer Methode führten wir ein EB-, NPC- und Neuronendifferenzierungsexperiment an E14-Zellen durch. E14-Zellen wurden auf γ-bestrahlten MEFs kultiviert (Abbildung 1A), bis die γ-bestrahlte MEF-Population verdünnt war. Wir bestätigten die Pluripotenz der E14-Zellen durch alkalische Phosphatase (AP) Färbung (Abbildung 1B) und später RT-qPCR (siehe unten) für Nanog- und Oct4-Marker. Die γ-bestrahlten MEF-freien E14-Zelle...

Diskussion

Die Methode zur neuronalen Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus ist seit Jahrzehnten etabliert, und die Forscher haben die vorherigen Protokolle weiter modifiziert oder neue für verschiedene Zwecke geschaffen^7,10,11. Wir verwendeten eine Reihe von Assays, um die Effizienz und den Fortschritt der Differenzierungsstufen von mESCs zu Neuronen umfassend zu analysieren, die bei der Analyse anderer Abstammungsdifferen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0.1% Gelatin	Sigma	G1890-100G	Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	28908	Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer	Falcon	352340
Albumax	Thermo Fisher Scientific	11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11001	Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II	Stemgent	00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox	Azura Genomics	AZ-2105
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSCanto	BD	657338
bFGF	Sigma	11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Chir99021	Cayman Chemicals	13122
Chloroform	C298-500	Fisher Chemical
DAPI	Invitrogen	R37606
DMEM	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320033
EB buffer	Qiagen	19086
Ethanol	111000200	Pharmco	Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System	Illumina	SY-401-2501
Isopropanol	BDH1133-4LG	BDH VWR Analytical	Diluted in de-ionized water
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
LIF	N/A	N/A	Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers	IDTDNA	N/A	5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl
mNanog primers	IDTDNA	N/A	5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers	IDTDNA	N/A	5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers	IDTDNA	N/A	5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers	IDTDNA	N/A	5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers	IDTDNA	N/A	5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin primary antibody	Millipore	MAB5326	Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament primary antibody	DSHB	2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit	BioO Scientific	NOVA-5138-07
PD0325901	Cayman Chemicals	13034
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	Prepared in de-ionized water
- Potassium chloride	P217-500G	VWR
- Potassium phosphate monobasic anhydrous	0781-500G	VWR
- Sodium chloride	BP358-10	Fisher Bioreagents
- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate	SX0715-1	Milipore
Random hexamer primer	Thermo Scientific	SO142
Retinoic acid	Sigma	R2625	Prepared in DMSO
Sodium pyruvate	Corning	25-000-Cl
Sucrose	Sigma	84097	Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura	4583
TriPure Isolation Reagent	Sigma-Aldrich	11667165001
TruSeq Rapid	Illumina	20020616
β-mercaptoethanol	Fisher BioReagents	BP176-100