Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

Riepilogo

Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Abstract

Descriviamo la procedura passo-passo per la coltura e la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali, seguita da una serie di saggi per caratterizzare le cellule differenziate. Le cellule staminali embrionali di topo E14 sono state utilizzate per formare corpi embrioidi attraverso il metodo della goccia sospesa, e poi indotte a differenziarsi in cellule progenitrici neurali dall'acido retinoico e infine differenziate in neuroni. La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) e gli esperimenti di immunofluorescenza hanno rivelato che i progenitori neurali e i neuroni mostrano marcatori corrispondenti (nestina per i progenitori neurali e neurofilamento per i neuroni) rispettivamente al giorno 8 e 12 post-differenziazione. Esperimenti di citometria a flusso su una linea E14 che esprime un reporter GFP guidato dal promotore Sox1 hanno mostrato che circa il 60% delle cellule al giorno 8 sono GFP positive, indicando la differenziazione di successo delle cellule progenitrici neurali in questa fase. Infine, l'analisi RNA-seq è stata utilizzata per profilare i cambiamenti trascrittomici globali. Questi metodi sono utili per analizzare il coinvolgimento di geni e percorsi specifici nella regolazione della transizione dell'identità cellulare durante la differenziazione neuronale.

Introduzione

Fin dalla loro prima derivazione dalla massa cellulare interna delle blastocisti di topo in via di sviluppo^1,2,le cellule staminali embrionali di topo (mESC) sono state utilizzate come potenti strumenti per studiare l'auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali^3. Inoltre, lo studio della differenziazione mESC porta a un'enorme comprensione dei meccanismi molecolari che possono migliorare l'efficienza e la sicurezza nella terapia basata sulle cellule staminali nel trattamento di malattie come i disturbi neurodegenerativi⁴. Rispetto ai modelli animali, questo sistema in vitro offre molti vantaggi, tra cui semplicità nella pratica e nella valutazione, basso costo nel mantenimento delle linee cellulari in contrasto con gli animali e relativa facilità nelle manipolazioni genetiche. Tuttavia, l'efficienza e la qualità dei tipi di cellule differenziate sono spesso influenzate da diverse linee di mESC e dai metodi di differenziazione^5,6. Inoltre, i saggi tradizionali per valutare l'efficienza della differenziazione si basano sull'esame qualitativo di geni marcatori selezionati che mancano di robustezza e quindi non riescono a cogliere i cambiamenti globali nell'espressione genica.

Qui miriamo a utilizzare una batteria di saggi per la valutazione sistematica della differenziazione neuronale. Utilizzando sia le tradizionali analisi in vitro su marcatori selezionati che l'RNA-seq, stabiliamo una piattaforma per la misurazione dell'efficienza di differenziazione e dei cambiamenti trascrittomici durante questo processo. Sulla base di un protocollo precedentemente stabilito^7,abbiamo generato corpi embrioidi (EB) attraverso la tecnica della goccia sospesa, seguita dall'induzione utilizzando la quantità soprafisiologica di acido retinoico (RA) per generare cellule progenitrici neurali (NPC), che sono state successivamente differenziate in neuroni con mezzo di induzione neurale. Per esaminare l'efficienza del differenziamento, oltre ai tradizionali test RT-qPCR e immunofluorescenza (IF), abbiamo eseguito RNA-seq e citometria a flusso. Queste analisi forniscono una misurazione completa della progressione della differenziazione specifica dello stadio.

Protocollo

1. Cultura mESC

1. Rivestire una piastra di 10 cm trattata con coltura tissutale con lo 0,1% di gelatina e lasciare riposare la gelatina per almeno 15-30 minuti prima di aspirarla.
2. I fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati γ un giorno prima di coltivare le mESC nel mezzo mESC preriscaldato (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with 15% fetale bovine serum (FBS), aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina/streptomicina, piruvato di sodio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).
3. Consentire ai MEF irradiati γ di depositarsi e attaccarsi alla superficie della piastra prima di coltivare le cellule E14.
4. Scongelare gli ESC E14 a bagnomaria a 37 °C e trasferire rapidamente le celle in un tubo conico di 15 cm con mezzo caldo mESC. Pellet le celle a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
5. Risospese le cellule in 10 mL di terreno mESC e placcare le cellule sulla piastra di coltura contenente i MEF irradiati γ seminati in precedenza. Incubare la coltura cellulare in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
6. Per il passaggio in coltura, aspirare il mezzo e lavare la piastra con 1x PBS sterile. Aggiungere abbastanza 0,05% di tripsina per coprire la superficie della piastra e incubare a 37 °C per 3 minuti.
7. Neutralizzare la tripsina con mezzo mESC e pipetta per generare sospensione monocellulare. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
8. Contare le cellule con un emocitometro o un contatore cellulare e seminare circa 5,0 x 10⁵ cellule in una piastra di coltura di 10 cm.
9. Risospese le cellule in 10 mL di mezzo mESC, placcare le cellule sulla piastra di coltura tissutale rivestita di gelatina e incubare le colture come descritto in precedenza.
   NOTA: Si raccomanda di passare le mESC ogni 2 giorni per evitare che le cellule si differenzino nelle loro colonie. Il rosso fenolo nel mezzo funziona esclusivamente come indicatore di pH e, a seconda della densità cellulare, può diventare giallastro (più acido), prima di 2 giorni. Quindi, potrebbe essere necessario cambiare il mezzo ogni giorno. I MEF irradiati γ alla fine moriranno dopo un paio di passaggi.

2. Differenziazione di EB, NPC e neuroni

1. Eseguire il protocollo di passaggio di coltura menzionato in precedenza e contare le cellule (passaggi 1.7-1.10).
2. Metodo di goccia sospesa (giorno 0)
   1. Per una piastra di coltura cellulare di 10 cm, contare circa 2,5 x 10⁴ cellule in cui 5,0 x 10² cellule saranno sospese in un mezzo di differenziazione da 20 μL (DMEM con 15% FBS, aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina / streptomicina e piruvato di sodio). Circa cinquanta goccioline da 20 μL contenenti le cellule possono essere placcate su una piastra da 10 cm.
   2. Aliquotare il numero appropriato di cellule, quindi centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
   3. Risospese le cellule nel volume appropriato del mezzo di differenziazione per una densità cellulare di 5,0 x 10² cellule per 20 μL (ad esempio, 2,5 x 10⁴ cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione).
   4. Utilizzando una micropipetta o una pipetta ripetitore, posizionare 20 μL di goccioline della sospensione cellulare sul coperchio della piastra di coltura tissutale. Assicurati che le goccioline non siano troppo vicine l'una all'altra per impedire loro di fondersi.
      NOTA: le goccioline possono essere placcate su una piastra di fissaggio trattata con coltura di tessuto o su una piastra di sospensione in quanto verranno posizionate sul coperchio e non sulla piastra stessa. Per un approccio più fattibile e sterile, piallare le goccioline su una piastra di coltura tissutale di attacco e trasferirle su una piastra di sospensione come descritto di seguito.
   5. Riempire la piastra con 5-10 ml di 1x PBS e rimettere con cura il coperchio sulla piastra. Incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C.
      NOTA: PBS viene aggiunto alla piastra di coltura per evitare che le goccioline si secchino.
3. Il giorno 2,utilizzare una micropipetta per raccogliere le goccioline dal coperchio e metterle in una piastra di sospensione per colture cellulari di 10 cm riempita con 10 ml di mezzo di differenziazione. Incubare la coltura su uno shaker orbitale che scuote a bassa velocità nell'incubatore.
4. Il giorno 4,per raccogliere gli EB, raccogliere le cellule, centrifugare a 200 x g per 3 min e rimuovere il surnatante.
   NOTA: Gli EB possono anche essere lavati con 1x PBS secondo i requisiti degli esperimenti successivi.
5. Per continuare la procedura e indurre la differenziazione EB in cellule progenitrici neurali (NPC), preparare il mezzo di differenziazione con acido retinoico (RA) da 5 μM.
6. Rimuovere il vecchio mezzo pellettizzando gli EB a 100 x g per 3 minuti o lasciare che gli EB si depositino prima di aspirare il vecchio mezzo. Aggiungere 10 ml del mezzo di differenziazione contenente 5 μM RA alla piastra di coltura.
7. Il giorno 6, sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente 5 μM RA inclinando la piastra e pipettando il mezzo come descritto sopra.
   NOTA: Si raccomanda di sostituire almeno la metà del mezzo con un mezzo fresco contenente RA nei giorni 5 e 7. Prendi nota dell'indicatore rosso fenolo; se diventa giallastro, è meglio sostituire tutto il mezzo.
8. Il giorno 8,raccogli gli NPC raccogliendo le cellule, centrifugando a 200 x g per 3 minuti e rimuovendo il surnatante.
   NOTA: Gli NPC possono anche essere lavati con 1x PBS in base alle esigenze degli esperimenti successivi. Se necessario, gli NPC possono essere congelati e scongelati di nuovo per una successiva coltura e analisi. Se gli NPC devono essere coltivati, l'accutasi può anche essere usato come alternativa alla tripsina.
9. Per continuare la procedura e differenziare gli NPC in neuroni, raccogliere gli NPC in un tubo conico da 15 ml mediante centrifugazione, dissociarli con tripsina e incubarli a 37 °C per 3 min. Pipettare gli NPC per garantire che tutti gli aggregati NPC siano dissociati e neutralizzare la tripsina con il mezzo.
10. Filtrare le cellule con un colino di cellule di nylon da 40 μm e contare le cellule prima di placcarle ad una densità di 1,5 x^{10 5}/cm² in mezzo N2 (DMEM/F12 medio + 3 mg/mL di glucosio + 3 mg/mL di albumina sierica bovina ricca di lipidi (LBSA) + supplemento di 1:100 N2 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL penna/streptococco + 1 mM di L-glutammina) su una piastra trattata con colture tissutali per successivi esperimenti di PCR e western blot; o su una camera di coltura tissutale per esperimenti di immunofluorescenza.
11. Il giorno 9, sostituire il vecchio mezzo con un mezzo N2 fresco.
12. Il giorno 10,cambiare il mezzo N2 con il mezzo N2 / B27 (50% DMEM / F12 e 50% basale neurale, 3 mg / mL LBA, 1: 200 N2 supplemento, 1: 100 B27 supplemento, 50 U / mL penna / streptococco e 1 mM L-glutammina).
13. Nei giorni 11-12, raccogliere i neuroni come segue. Lavare le cellule con 1x PBS, aggiungere tripsina e incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C per 3 minuti prima di neutralizzare la tripsina con mezzo e centrifugare a 200 x g per 3 min.

3. Caratterizzazione di mESC e cellule differenziate

1. Saggio della fosfatasi alcalina (AP)
   1. Utilizzare un kit per valutare l'attività della fosfatasi alcalina (vedere la Tabella dei materiali).
   2. Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura e lavare gli ESC con 1x PBS.
   3. Aggiungere 1 mL della soluzione fissa (composta da formaldeide e metanolo) fornita con il kit alla piastra e incubarla a temperatura ambiente per 2-5 minuti.
      NOTA: l'eccessiva incubazione nella soluzione di correzione può compromettere l'attività pa.
   4. Rimuovere la soluzione fissa, lavare gli ESC con 1x PBS e lasciare una certa quantità di PBS nella piastra.
      NOTA: mantenere le ESC umide in PBS per non compromettere l'attività AP.
   5. Preparare la soluzione AP mescolando le soluzioni di substrato A, B e C con un rapporto 1:1:1. Mescolare prima le soluzioni A e B e incubare la miscela a temperatura ambiente per 2 minuti prima di aggiungere la soluzione C.
   6. Rimuovere il PBS 1x e aggiungere la soluzione AP preparata in precedenza.
   7. Incubare gli ESC per circa 15 minuti al buio avvolgendo la piastra di coltura con un foglio di alluminio o eseguendo il passaggio 3.5 in una stanza buia.
   8. Monitorare la reazione e rimuovere la soluzione di reazione quando la soluzione diventa luminosa per evitare macchie non specifiche.
   9. Lavare gli ESC due volte con 1x PBS.
   10. Evitare che il campione si asciughi coprendo gli ESC con 1x PBS o mezzo di montaggio.
       NOTA: per l'espressione AP verrà visualizzata una macchia rossa o viola. La piastra può essere conservata in frigorifero a 4 °C.
2. RT-qPCR
   1. Raccogliere le cellule in varie fasi seguendo i passaggi 1.6-1.7 e 2.4 rispettivamente per ESC ed EB e NPC.
   2. Isolare l'RNA utilizzando RNA, DNA e soluzione di estrazione proteica (vedere Tabella dei materiali).
   3. Genera cDNA con un kit di trascrittasi inversa (vedi la Tabella dei materiali)e segui il manuale del produttore.
3. Fissazione e incorporamento
   1. Raccogliere EB e NPC come descritto sopra (fase 2.6) e fissarli con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
   2. Rimuovere il PFA e lavare il campione con 1x PBS per 5 minuti.
   3. Posizionare il campione in una diluizione seriale di 1s PBS, 10%, 20% e 30% di saccarosio a 25\u201228 °C, dove il campione viene trasferito alla soluzione successiva dopo 30 minuti di incubazione.
      NOTA: Il campione può essere conservato nella soluzione di saccarosio al 30% a 4 °C prima di continuare con la fase di incorporamento.
   4. Bagnare la punta della pipetta con soluzione di saccarosio prima di posizionare il campione (senza impilarli) al centro del criostampo e pipettare il liquido in eccesso.
      NOTA: la carta da filtro può essere utilizzata anche per rimuovere la soluzione in eccesso. Bagnare la punta della pipetta con una soluzione di saccarosio è importante per evitare che gli EB e gli NPC si attacchino alle pareti della punta.
   5. Aggiungere con attenzione la soluzione a temperatura di taglio ottimale (OCT) allo stampo senza sospescere nuovamente i campioni e rimuovere le bolle in eccesso con una pipetta.
   6. Posizionare lo stampo con il campione su un miscelatore da laboratorio a bassa velocità per agitare leggermente il campione per 15 minuti. Questo aiuta a sistemare gli EB e gli NPC verso il basso se vengono risospesi nella soluzione OCT.
   7. Congelare rapidamente il campione posizionando lo stampo in azoto liquido o su ghiaccio secco.
      NOTA: i campioni possono essere conservati in un congelatore a -70 °C prima di passare al passaggio successivo.
4. Criosezione
   1. Impostare il criostato in modo che si raffreddi a -20--18 °C prima di trasferire il campione allo strumento.
   2. Staccare il blocco OCT congelato dallo stampo e fissarlo sul supporto con una piccola soluzione OCT posizionata sulla superficie del supporto.
   3. Allineare il blocco dello Strumento di personalizzazione di Office in modo che gli NB e gli NPC siano più vicini al pannello per garantire che il campione non vada perso durante il sezionamento.
   4. Sezionare con attenzione 10 μm del blocco e prestare molta attenzione alle fette che contengono il campione.
   5. Posizionare rapidamente la fetta OCT contenente il campione sul vetrino di vetro che incorpora il tessuto e lasciare asciugare all'aria le fette OCT per 1 ora a temperatura ambiente.
      NOTA: I campioni possono essere conservati a -70 °C per un uso successivo.
5. Immunofluorescenza (IF)
   1. Blocca sezioni OCT o camere di coltura contenenti neuroni in 10% di siero d'asino normale / 0,1% Triton X-100 in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
   2. Incubare i campioni in anticorpi primari diluiti in siero d'asino normale al 5% e Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS durante la notte a 4 °C.
   3. Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio.
   4. Incubare i campioni con anticorpi secondari diluiti in siero d'asino normale al 5% / Triton X-100 allo 0,05% in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
   5. Lavare i campioni in 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre volte per 5 minuti ogni lavaggio, quindi incubare i campioni in 1 μg/mL DAPI.
   6. Montare i campioni con un coperchio e un mezzo di montaggio e lasciarlo asciugare.
   7. Osservare i campioni al microscopio a fluorescenza.
6. Analisi RNA-seq
   1. Raccogliere le cellule in varie fasi ed eseguire l'estrazione dell'RNA (vedere il passaggio 3.2).
   2. Preparare le librerie di cDNA, eseguire il sequenziamento profondo e l'analisi dei dati secondo il protocollo descritto in Wang et al.⁸.
   3. Eseguire l'analisi gene ontology (GO) utilizzando il pacchetto R, clusterProfiler.
7. Citometria a flusso
   1. Raccogliere le ESC seguendo i passaggi 1.6-1.7 e risospensionare le celle nel mezzo. Raccogliere gli EB e gli NPC seguendo il passaggio 2.4 e risospensionare le cellule nel mezzo.
   2. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando il filtro per celle di nylon da 40 μm in un nuovo tubo conico da 15 ml.
   3. Misurare il segnale GFP dei campioni utilizzando il citometro a flusso (eseguito dalla struttura principale dell'istituzione).

Risultati

Come rappresentazione del nostro metodo, abbiamo eseguito un esperimento di differenziazione EB, NPC e neuroni su cellule E14. Le cellule E14 sono state coltivate su MEF irradiati γ (Figura 1A) fino a quando la popolazione meF irradiata γ non si è diluita. Abbiamo confermato la pluripotenza delle cellule E14 eseguendo la colorazione della fosfatasi alcalina (AP)(Figura 1B)e successivamente RT-qPCR (vedi sotto) per i marcatori Nanog e Oct4. L...

Discussione

Il metodo per la differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali di topo è stato stabilito per decenni e i ricercatori hanno continuato a modificare i protocolli precedenti o crearne di nuovi per vari scopi^7,10,11. Abbiamo utilizzato una serie di saggi per analizzare in modo completo l'efficienza e il progresso delle fasi di differenziazione delle mESC ai neuroni, che possono essere utilizzate nell'analisi di altre ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0.1% Gelatin	Sigma	G1890-100G	Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	28908	Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer	Falcon	352340
Albumax	Thermo Fisher Scientific	11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11001	Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II	Stemgent	00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox	Azura Genomics	AZ-2105
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSCanto	BD	657338
bFGF	Sigma	11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Chir99021	Cayman Chemicals	13122
Chloroform	C298-500	Fisher Chemical
DAPI	Invitrogen	R37606
DMEM	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320033
EB buffer	Qiagen	19086
Ethanol	111000200	Pharmco	Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System	Illumina	SY-401-2501
Isopropanol	BDH1133-4LG	BDH VWR Analytical	Diluted in de-ionized water
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
LIF	N/A	N/A	Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers	IDTDNA	N/A	5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl
mNanog primers	IDTDNA	N/A	5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers	IDTDNA	N/A	5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers	IDTDNA	N/A	5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers	IDTDNA	N/A	5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers	IDTDNA	N/A	5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin primary antibody	Millipore	MAB5326	Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament primary antibody	DSHB	2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit	BioO Scientific	NOVA-5138-07
PD0325901	Cayman Chemicals	13034
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	Prepared in de-ionized water
- Potassium chloride	P217-500G	VWR
- Potassium phosphate monobasic anhydrous	0781-500G	VWR
- Sodium chloride	BP358-10	Fisher Bioreagents
- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate	SX0715-1	Milipore
Random hexamer primer	Thermo Scientific	SO142
Retinoic acid	Sigma	R2625	Prepared in DMSO
Sodium pyruvate	Corning	25-000-Cl
Sucrose	Sigma	84097	Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura	4583
TriPure Isolation Reagent	Sigma-Aldrich	11667165001
TruSeq Rapid	Illumina	20020616
β-mercaptoethanol	Fisher BioReagents	BP176-100