Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Résumé

Nous décrivons la procédure de différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires de souris en cellules neuronales en utilisant la méthode de la goutte suspendue. De plus, nous effectuons une analyse phénotypique complète par RT-qPCR, immunofluorescence, séquençage de l’ARN et cytométrie en flux.

Résumé

Nous décrivons la procédure étape par étape pour cultiver et différencier les cellules souches embryonnaires de souris en lignées neuronales, suivie d’une série de tests pour caractériser les cellules différenciées. Les cellules souches embryonnaires de souris E14 ont été utilisées pour former des corps embryoïdes par la méthode de la goutte suspendue, puis induites à se différencier en cellules progénitrices neurales par l’acide rétinoïque, et enfin différenciées en neurones. Des expériences quantitatives de réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-qPCR) et d’immunofluorescence ont révélé que les progéniteurs neuronaux et les neurones présentent des marqueurs correspondants (nestin pour les progéniteurs neuronaux et neurofilament pour les neurones) aux jours 8 et 12 après la différenciation, respectivement. Des expériences de cytométrie en flux sur une ligne E14 exprimant un rapporteur GFP piloté par le promoteur Sox1 ont montré qu’environ 60% des cellules au jour 8 sont GFP positives, indiquant la différenciation réussie des cellules progénitrices neurales à ce stade. Enfin, l’analyse ARN-seq a été utilisée pour profiler les changements transcriptomiques globaux. Ces méthodes sont utiles pour analyser l’implication de gènes et de voies spécifiques dans la régulation de la transition de l’identité cellulaire au cours de la différenciation neuronale.

Introduction

Depuis leur première dérivation à partir de la masse cellulaire interne des blastocystes de souris en développement^1,2,les cellules souches embryonnaires de souris (CSM) ont été utilisées comme outils puissants pour étudier l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches^3. En outre, l’étude de la différenciation des CSM conduit à une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires qui peuvent améliorer l’efficacité et la sécurité de la thérapie à base de cellules souches dans le traitement de maladies telles que les troubles neurodégénératifs⁴. Par rapport aux modèles animaux, ce système in vitro offre de nombreux avantages, notamment la simplicité dans la pratique et l’évaluation, le faible coût de maintien des lignées cellulaires par rapport aux animaux et la facilité relative des manipulations génétiques. Cependant, l’efficacité et la qualité des types de cellules différenciés sont souvent affectées par différentes lignées de cSM ainsi que par les méthodes de différenciation^5,6. En outre, les tests traditionnels pour évaluer l’efficacité de la différenciation reposent sur un examen qualitatif de gènes marqueurs sélectionnés qui manquent de robustesse et ne parviennent donc pas à saisir les changements globaux dans l’expression des gènes.

Ici, nous visons à utiliser une batterie de tests pour l’évaluation systématique de la différenciation neuronale. En utilisant à la fois des analyses in vitro traditionnelles sur des marqueurs sélectionnés et des séquençages d’ARN, nous établissons une plate-forme pour mesurer l’efficacité de la différenciation ainsi que les changements transcriptomiques au cours de ce processus. Sur la base d’un protocole précédemment établi^7,nous avons généré des corps embryoïdes (EB) grâce à la technique de la goutte suspendue, suivie d’une induction utilisant une quantité supraphysiologique d’acide rétinoïque (PR) pour générer des cellules progénitrices neurales (NPC), qui ont ensuite été différenciées en neurones avec un milieu d’induction neuronal. Pour examiner l’efficacité de la différenciation, en plus des tests traditionnels de RT-qPCR et d’immunofluorescence (FI), nous avons effectué une cytométrie d’ARN-seq et de cytométrie en flux. Ces analyses fournissent une mesure complète de la progression de la différenciation spécifique au stade.

Protocole

1. Culture mESC

1. Enduisez une plaque de 10 cm traitée par culture tissulaire de 0,1 % de gélatine et laissez la gélatine reposer pendant au moins 15 à 30 minutes avant de l’aspirer.
2. Graine γ fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) irradiés un jour avant la culture des CSM dans le milieu mESC préchauffé (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 15% de sérum fœtal bovin (FBS), acides aminés non essentiels, β-mercaptoéthanol, L-glutamine, pénicilline/streptomycine, pyruvate de sodium, LIF, PD0325901 (PD) et Chir99021 (CH)).
3. Laissez les MEF irradiés par γ se déposer et se fixer à la surface de la plaque avant de cultiver des cellules E14.
4. Décongeler les CSE E14 au bain-marie à 37 °C et transférer rapidement les cellules dans un tube conique de 15 cm avec un milieu mESC chaud. Abattez les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.
5. Remettre en suspension les cellules dans 10 mL de milieu mESC et plaquer les cellules sur la plaque de culture contenant les MEF γ irradiés précédemment. Incuber la culture cellulaire dans un incubateur à 37 °C sous 5% de CO_2.
6. Pour le passage de culture, aspirer le milieu et laver la plaque avec 1x PBS stérile. Ajouter suffisamment de trypsine à 0,05 % pour recouvrir la surface de la plaque et incuber à 37 °C pendant 3 min.
7. Neutraliser la trypsine avec un milieu mESC et une pipette pour générer une suspension monocellulaire. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirer le surnageant.
8. Comptez les cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules et ensemencez environ 5,0 x 10⁵ cellules dans une plaque de culture de 10 cm.
9. Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu mESC, plaquer les cellules sur la plaque de culture tissulaire recouverte de gélatine et incuber des cultures comme décrit précédemment.
   REMARQUE: Il est recommandé que les CSM soient passés tous les 2 jours pour empêcher les cellules de se différencier dans leurs colonies. Le rouge de phénol dans le milieu fonctionne uniquement comme un indicateur de pH et en fonction de la densité cellulaire, il peut devenir jaunâtre (plus acide), plus tôt que 2 jours. Par conséquent, il peut être nécessaire de changer de support tous les jours. Les MEF γ irradiés finiront par mourir après quelques passages.

2. EB, PNJ et différenciation des neurones

1. Effectuez le protocole de passage de culture mentionné précédemment et comptez les cellules (étapes 1.7-1.10).
2. Méthode de la goutte suspendue (jour 0)
   1. Pour une plaque de culture cellulaire de 10 cm, comptez environ 2,5 x 10⁴ cellules où 5,0 x 10 2 cellules^seront en suspension dans un milieu de différenciation de 20 μL (DMEM avec 15% de FBS, acides aminés non essentiels, β-mercaptoéthanol, L-glutamine, pénicilline/streptomycine et pyruvate de sodium). Environ cinquante gouttelettes de 20 μL contenant les cellules peuvent être plaquées sur une plaque de 10 cm.
   2. Aliquotez le nombre approprié de cellules, puis centrifugez les cellules à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.
   3. Remettre les cellules dans le volume approprié de milieu de différenciation pour une densité cellulaire de 5,0 x 10² cellules pour 20 μL (par exemple, 2,5 x 10⁴ cellules dans 1 mL de milieu de différenciation).
   4. À l’aide d’une micropipette ou d’une pipette répéteur, placez 20 μL de gouttelettes de la suspension cellulaire sur le couvercle de la plaque de culture tissulaire. Assurez-vous que les gouttelettes ne sont pas trop proches les unes des autres pour les empêcher de fusionner.
      REMARQUE: Les gouttelettes peuvent être plaquées sur une plaque de fixation traitée par culture tissulaire ou une plaque de suspension car elles seront placées sur le couvercle et non sur la plaque elle-même. Pour une approche plus réalisable et stérile, plaquez les gouttelettes sur une plaque de culture tissulaire de fixation et transférez-les sur une plaque de suspension comme décrit ci-dessous.
   5. Remplissez la plaque avec 5 à 10 mL de 1x PBS et remettez soigneusement le couvercle sur la plaque. Incuber la culture dans l’incubateur à 37 °C.
      REMARQUE: PBS est ajouté à la plaque de culture pour empêcher les gouttelettes de se dessécher.
3. Le jour 2,utilisez une micropipette pour recueillir les gouttelettes du couvercle et placez-les dans une plaque de suspension de culture cellulaire de 10 cm remplie de 10 mL de milieu de différenciation. Incuber la culture sur un shaker orbital secouant à basse vitesse dans l’incubateur.
4. Le jour 4,pour récolter les EB, prélever les cellules, centrifuger à 200 x g pendant 3 min, et retirer le surnageant.
   REMARQUE: Les EB peuvent également être lavés avec 1x PBS selon les exigences des expériences ultérieures.
5. Pour poursuivre la procédure et induire la différenciation EB en cellules progénitrices neurales (NPC), préparez le milieu de différenciation avec de l’acide rétinoïque (PR) de 5 μM.
6. Retirez l’ancien milieu en abattant les EB à 100 x g pendant 3 min ou laissez les EB se déposer avant d’aspirer l’ancien milieu. Ajouter 10 mL du milieu de différenciation contenant 5 μM RA à la plaque de culture.
7. Le jour 6, remplacez au moins la moitié du milieu par un milieu frais contenant 5 μM de RA en inclinant la plaque et en pipetant le milieu comme décrit ci-dessus.
   REMARQUE: Il est recommandé de remplacer au moins la moitié du milieu par un milieu frais contenant de la PR les jours 5 et 7. Prenez note de l’indicateur de rouge phénol; s’il devient jaunâtre, il est préférable de remplacer tout le milieu.
8. Le jour 8,récoltez les PNJ en collectant les cellules, en centrifugant à 200 x g pendant 3 min et en retirant le surnageant.
   REMARQUE: Les PNJ peuvent également être lavés avec 1x PBS selon les besoins des expériences ultérieures. Si nécessaire, les PNJ peuvent être congelés et décongelés à nouveau pour une culture et une analyse ultérieures. Si les PNJ doivent être cultivés, l’accutase peut également être utilisée comme alternative à la trypsine.
9. Pour poursuivre la procédure et différencier les PNJ en neurones, prélever les NPC dans un tube conique de 15 mL par centrifugation, les dissocier avec de la trypsine et les incuber à 37 °C pendant 3 min. Pipettez les PNJ pour s’assurer que tous les agrégats de PNJ sont dissociés et neutralisez la trypsine avec le milieu.
10. Filtrer les cellules avec une passoire à cellules en nylon de 40 μm et compter les cellules avant de les plaquer à une densité de 1,5 x^{10 5}/cm² dans un milieu N2 (milieu DMEM/F12 + 3 mg/mL de glucose + 3 mg/mL d’albumine sérique bovine riche en lipides (LBSA) + supplément de N2 de 1:100 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL de stylo/streptocoque + 1 mM de L-glutamine) sur une plaque traitée par culture tissulaire pour des expériences ultérieures de PCR et de transfert western; ou sur une chambre de culture tissulaire pour des expériences d’immunofluorescence.
11. Le jour 9,remplacez l’ancien milieu par un milieu N2 frais.
12. Le jour 10,changez le milieu N2 avec le milieu N2/B27 (50 % de DMEM/F12 et 50 % de basale neurale, 3 mg/mL de LBA, supplément de 1:200 N2, supplément de 1:100 B27, 50 U/mL de stylo/streptocoque et 1 mM de L-glutamine).
13. Aux jours 11 à 12,récoltez les neurones comme suit. Laver les cellules avec 1x PBS, ajouter la trypsine et incuber la culture dans l’incubateur à 37 °C pendant 3 min avant de neutraliser la trypsine avec un milieu et de centrifuger à 200 x g pendant 3 min.

3. Caractérisation des CSM et des cellules différenciées

1. Dosage de la phosphatase alcaline (AP)
   1. Utilisez un kit pour évaluer l’activité de la phosphatase alcaline (voir le Tableau des matériaux).
   2. Retirez le milieu de la plaque de culture et lavez les ESC avec 1x PBS.
   3. Ajouter 1 mL de la solution fixe (composée de formaldéhyde et de méthanol) fournie avec le kit à la plaque et l’incuber à température ambiante pendant 2 à 5 min.
      REMARQUE: Une sur-incubation dans la solution de réparation peut compromettre l’activité AP.
   4. Retirez la solution fixe, lavez les ESC avec 1x PBS et laissez une certaine quantité de PBS dans la plaque.
      REMARQUE: Gardez les CES humides dans PBS pour ne pas compromettre l’activité AP.
   5. Préparez la solution AP en mélangeant les solutions de substrat A, B et C au rapport 1:1:1. Mélanger d’abord les solutions A et B et incuber le mélange à température ambiante pendant 2 minutes avant d’ajouter la solution C.
   6. Retirez le PBS 1x et ajoutez la solution AP préparée précédemment.
   7. Incuber les ESC pendant environ 15 minutes dans l’obscurité en enveloppant la plaque de culture avec du papier d’aluminium ou en effectuant l’étape 3.5 dans une pièce sombre.
   8. Surveillez la réaction et retirez la solution réactionnelle lorsque la solution devient brillante pour éviter toute coloration non spécifique.
   9. Lavez les ESC deux fois avec 1x PBS.
   10. Empêchez l’échantillon de sécher en recouvrant les ESC de 1x PBS ou d’un support de montage.
       REMARQUE: Une tache rouge ou violette apparaîtra pour l’expression AP. La plaque peut être conservée dans un réfrigérateur à 4 °C.
2. RT-qPCR
   1. Prélever des cellules à différentes étapes en suivant les étapes 1.6 à 1.7 et 2.4 pour les CES et les EB et les PNJ, respectivement.
   2. Isoler l’ARN à l’aide d’une solution d’extraction d’ARN, d’ADN et de protéines (voir Tableau des matériaux).
   3. Générez de l’ADNc avec un kit de transcriptase inverse (voir la table des matériaux)et suivez le manuel du fabricant.
3. Fixation et intégration
   1. Récoltez les EB et les PNJ comme décrit ci-dessus (étape 2.6) et fixez-les avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans 1x PBS pendant 30 min à température ambiante.
   2. Retirez le PFA et lavez l’échantillon avec 1x PBS pendant 5 min.
   3. Placer l’échantillon dans une dilution en série de 1x PBS, 10%, 20% et 30% de solutions de saccharose à 25\u201228 °C où l’échantillon est transféré à la solution suivante après 30 min d’incubation.
      REMARQUE: L’échantillon peut être conservé dans la solution de saccharose à 30% à 4 ° C avant de poursuivre l’étape d’incorporation.
   4. Mouiller l’embout de la pipette avec une solution de saccharose avant de placer l’échantillon (sans les empiler) au centre du cryo-moule et pipeter l’excès de liquide.
      REMARQUE: Le papier filtre peut également être utilisé pour éliminer l’excès de solution. Mouiller la pointe de la pipette avec une solution de saccharose est important pour empêcher les EB et les PNJ de coller aux parois de la pointe.
   5. Ajoutez soigneusement une solution de température de coupe optimale (OCT) au moule sans remettre les échantillons en suspension et éliminez les bulles en excès avec une pipette.
   6. Placez le moule avec l’échantillon sur un mélangeur de laboratoire à basse vitesse pour agiter légèrement l’échantillon pendant 15 min. Cela aide à régler les EB et les PNJ au fond s’ils sont remis en suspension dans la solution OCT.
   7. Congelez rapidement l’échantillon en plaçant la moisissure dans de l’azote liquide ou sur de la glace carbonique.
      REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés dans un congélateur à -70 ° C avant de passer à l’étape suivante.
4. Cryosection
   1. Réglez le cryostat pour qu’il refroidisse à -20 à -18 °C avant de transférer l’échantillon dans l’instrument.
   2. Détachez le bloc OCT congelé du moule et fixez-le sur le support avec une petite solution OCT placée sur la surface du support.
   3. Alignez le bloc OPO de sorte que les EB et les PNJ soient les plus proches de la lame pour vous assurer que l’échantillon n’est pas perdu pendant la section.
   4. Coupez soigneusement 10 μm du bloc et portez une attention particulière aux tranches qui contiennent l’échantillon.
   5. Placez rapidement la tranche d’OCT contenant l’échantillon sur la lame de verre d’incorporation de tissu et laissez les tranches d’OCT sécher à l’air libre pendant 1 h à température ambiante.
      REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à -70 °C pour une utilisation ultérieure.
5. Immunofluorescence (FI)
   1. Bloquer les sections OCT ou les chambres de culture contenant des neurones dans 10% de sérum d’âne normal / 0,1% de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 1 h à température ambiante.
   2. Incuber les échantillons dans un anticorps primaire dilué dans du sérum d’âne normal à 5 % / 0,05 % de Triton X-100 dans 1x PBS pendant la nuit à 4 °C.
   3. Lavez les échantillons dans 1x PBS/0,1 % Triton X-100 trois fois pendant 5 min chaque lavage.
   4. Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire dilué dans 5 % de sérum d’âne normal /0,05 % de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 1 h à température ambiante.
   5. Laver les échantillons dans 1x PBS/0,1 % Triton X-100 trois fois pendant 5 min chaque lavage puis incuber les échantillons dans 1 μg/mL DAPI.
   6. Montez les échantillons avec un couvercle et un support de montage et laissez-le sécher.
   7. Observez les échantillons au microscope à fluorescence.
6. Analyse de séquençage de l’ARN
   1. Prélever les cellules à différents stades et effectuer une extraction de l’ARN (voir étape 3.2).
   2. Préparer les bibliothèques d’ADNc, effectuer un séquençage approfondi et une analyse des données selon le protocole décrit dans Wang et al.^8.
   3. Effectuez l’analyse d’ontologie génique (GO) à l’aide du package R, clusterProfiler.
7. Cytométrie en flux
   1. Collectez les CSE en suivant les étapes 1.6 à 1.7 et remettez en suspension les cellules dans un milieu. Collectez les EB et les PNJ en suivant l’étape 2.4 et remettez en suspension les cellules dans un milieu.
   2. Filtrer la suspension cellulaire à l’aide de la passoire à cellules en nylon de 40 μm dans un nouveau tube conique de 15 mL.
   3. Mesurer le signal GFP des échantillons à l’aide du cytomètre en flux (effectué par l’installation centrale de l’établissement).

Résultats

En tant que représentation de notre méthode, nous avons effectué une expérience de différenciation EB, NPC et neuronale sur des cellules E14. Les cellules E14 ont été cultivées sur des MEF γ irradiés(figure 1A)jusqu’à ce que la population de MEF irradiés par γ se dilue. Nous avons confirmé la pluripotence des cellules E14 en effectuant une coloration à la phosphatase alcaline (AP)(Figure 1B)et plus tard rt-qPCR (voir ci-dessous) pour les marqueu...

Discussion

La méthode de différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris est établie depuis des décennies et les chercheurs ont continué à modifier les protocoles précédents ou à en créer de nouveaux à des fins diverses^7,10,11. Nous avons utilisé une série de tests pour analyser de manière exhaustive l’efficacité et la progression des étapes de différenciation des CSM en neurones, qui peuvent être...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0.1% Gelatin	Sigma	G1890-100G	Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	28908	Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer	Falcon	352340
Albumax	Thermo Fisher Scientific	11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11001	Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II	Stemgent	00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox	Azura Genomics	AZ-2105
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSCanto	BD	657338
bFGF	Sigma	11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Chir99021	Cayman Chemicals	13122
Chloroform	C298-500	Fisher Chemical
DAPI	Invitrogen	R37606
DMEM	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320033
EB buffer	Qiagen	19086
Ethanol	111000200	Pharmco	Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System	Illumina	SY-401-2501
Isopropanol	BDH1133-4LG	BDH VWR Analytical	Diluted in de-ionized water
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
LIF	N/A	N/A	Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers	IDTDNA	N/A	5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl
mNanog primers	IDTDNA	N/A	5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers	IDTDNA	N/A	5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers	IDTDNA	N/A	5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers	IDTDNA	N/A	5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers	IDTDNA	N/A	5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin primary antibody	Millipore	MAB5326	Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament primary antibody	DSHB	2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit	BioO Scientific	NOVA-5138-07
PD0325901	Cayman Chemicals	13034
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	Prepared in de-ionized water
- Potassium chloride	P217-500G	VWR
- Potassium phosphate monobasic anhydrous	0781-500G	VWR
- Sodium chloride	BP358-10	Fisher Bioreagents
- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate	SX0715-1	Milipore
Random hexamer primer	Thermo Scientific	SO142
Retinoic acid	Sigma	R2625	Prepared in DMSO
Sodium pyruvate	Corning	25-000-Cl
Sucrose	Sigma	84097	Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura	4583
TriPure Isolation Reagent	Sigma-Aldrich	11667165001
TruSeq Rapid	Illumina	20020616
β-mercaptoethanol	Fisher BioReagents	BP176-100