Mechanobiyolojik Çalışmalar için Orbital Çalkalayıcıda Endotel Hücrelerinin 6 Kuyu Plakalarında Parçalanması

Özet

Bu protokol, endotel hücre büyümesini yörüngesel çalkalayıcı modelini kullanarak kesme gerilme uygulaması için 6 kuyulu bir plakanın belirli bir bölgesiyle sınırlamak için bir kaplama yöntemini açıklar.

Özet

Kanın akışı ile arteriyel duvara uygulanan kesme stresi endotel hücre morfolojisini ve fonksiyonunu etkiler. Düşük büyüklük, salınımlı ve multiliksiyonel kesme gerilmelerinin tümü endotel hücrelerinde pro-aterosklerotik fenotipi uyarmak için öne sürülmüştür, yüksek büyüklük ve tek yönlü veya tek eksenli kesmenin endotel homeostazı teşvik ettiği düşünülmektedir. Bu hipotezler daha fazla araştırma gerektirir, ancak geleneksel in vitro tekniklerin sınırlamaları vardır ve hücrelere çok yönlü kesme gerilmeleri uygulama konusunda özellikle zayıftır.

Giderek artan bir kullanım elde eden bir yöntem, endotel hücrelerini bir yörünge çalkalayıcı platformunda standart çok kuyulu plakalarda kültüre etmektir; Bu basit, düşük maliyetli, yüksek verimli ve kronik yöntemde, dönen ortam kuyunun farklı bölgelerinde çok yönlü kesme de dahil olmak üzere farklı kesme desenleri ve büyüklükleri üretir. Bununla birlikte, önemli bir sınırlamaya sahiptir: bir bölgedeki hücreler, bir akış türüne maruz kalan, kuyunun diğer bölümlerindeki hücreleri etkileyen, farklı akışlara maruz kalan ortama aracılar bırakabilir, bu nedenle akış ve fenotip arasındaki belirgin ilişkiyi bozabilir.

Burada, hücrelerin yalnızca belirli kesme stresi özelliklerine maruz kalmalarını sağlayan yöntemin kolay ve uygun fiyatlı bir modifikasyonunun sunulmasını sunuyoruz. Hücre tohumlama, ilgi çekici bölgeyi fibronektin ile kaplayarak kuyunun tanımlanmış bir bölgesiyle sınırlandırılır, ardından passivating çözeltisi kullanılarak pasivasyon yapılır. Daha sonra, plakalar çalkalayıcı üzerinde döndürebilir, bu da hücrelerin konumlarına bağlı olarak düşük büyüklükte çok yönlü kesme veya yüksek büyüklükte tek eksenli kesme gibi iyi tanımlanmış kesme profillerine maruz kalmasına neden olur. Daha önce olduğu gibi, standart hücre kültürü plastik yazılımının kullanımı, hücrelerin daha basit bir şekilde daha fazla analizini sağlar. Değişiklik, endotelden tanımlanmış kesme stresi özellikleri altında salınan ve kuyunun başka bir yerinde bulunan hücreleri etkileyen çözünür mediatörlerin gösterilmesine zaten izin vermiştir.

Giriş

Damar hücrelerinin mekanik ortamlarına verdikleri yanıtlar kan damarlarının normal fonksiyonlarında ve hastalığın gelişiminde önemlidir¹. Tüm kan damarlarının iç yüzeyini hizalayan endotel hücrelerinin (VC) mekanobiyolojisi, mekanobiyolojik araştırmaların özel bir odağı olmuştur, çünkü VC'ler doğrudan üzerlerindeki kan akışının yarattığı kesme stresini yaşarlar. İnflamatuar yanıtlar, değişen sertlik ve morfoloji, vazoaktif maddelerin salınımı ve kavernasyonel proteinlerin lokalizasyonu ve ekspresyonu gibi çeşitli fenotipik değişiklikler, EC'nin kesme stresine maruz kalmasına bağlıdır^2,3,4. Kesmeye bağımlı endotel özellikleri de ateroskleroz 5 ,^6,7gibi hastalıkların yamalı gelişimini açıklayabilir.

Stresin kontrol edilebildiği ve WC'lerin diğer hücre tiplerinden izole edilebildiği kültürde makasın VC'ler üzerindeki etkisini incelemek faydalıdır. VC'lere kesme stresi uygulamak için yaygın olarak kullanılan in vitro cihazlar paralel plaka akış odası ve koni ve plaka viskometresini içerir, ancak sadece tek eksenli sabit, salınımlı ve pulsatil akış^{uygulanabilir 8,9}. Konik veya dallanma geometrili modifiye akış odaları ve stenotik geometriyi taklit eden mikroakışkan yongalar geliştirilmiş olsa da, düşük verimleri ve mümkün olan nispeten kısa kültür süresi^{10, 11}.

Bir orbital çalkalayıcının platformuna yerleştirilen standart hücre kültürü plastik eşyalarında hücrelerin yetiştirildiği endotel mechanotransduction çalışması için orbital çalkalayıcı (veya iyi dönen) yöntem, yüksek verimli IC'lere kronik olarak karmaşık, mekansal olarak değişen kesme stres desenleri uygulayabildiği için giderek daha fazla dikkat çekmektedir (bkz. Warboys vd.^12). Dönen bir kuyuda kesme stresinin mekansal ve zamansal varyasyonunu karakterize etmek için Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) simülasyonları sunuldu. Plakanın yerleştiği çalkalayıcı platformun yörüngesel hareketinin neden olduğu kültür ortamının dönen hareketi, merkezde Düşük Büyüklükte Çok Yönlü Akışa (LMMF veya putatif olarak aterojenik akışa) ve 6 kuyulu bir plakanın kuyularının kenarında Yüksek Büyüklükteki Tek Eksenli Akışa (HMUF veya putatif olarak ateroprotektif akış) yol açar. Örneğin, zaman ortalamalı duvar kesme stresi (TAWSS) merkezde yaklaşık 0,3 Pa ve 5 mm yörünge yarıçapı 13 olan 150 rpm'de dönen 6 kuyu plakasının kenarında^{0,7 Pa'dır.} Yöntem sadece ticari olarak kullanılabilen plastik eşyalar ve orbital çalkalayıcının kendisini gerektirir.

Bununla birlikte, yöntemin (ve diğer akışların in vitro olarak empoze edilmesine) bir dezavantajı vardır: VC'ler çözünür mediatörleri ve mikropartikülleri kesmeye bağımlı bir şekilde serbest bırakır^14,15,16 ve bu secretome, dönen ortamdaki karıştırma nedeniyle kuyunun salındıkları bölgelerde VC'leri etkileyebilir. Bu, kesme stresinin EC fenotip üzerindeki gerçek etkilerini maskeleyebilirsiniz. Örneğin, Ghim ve arkadaşları, bunun farklı kesme profillerinin büyük parçacıkların hücrelerarası taşınması üzerindeki görünüşte aynı etkisini oluşturduğunu tahmin etmişler¹⁷.

Burada, yüzeyi pas geçirmek ve başka bir yerde büyümeyi önlemek için Pluronic F-127 kullanırken fibronektin kaplama kullanarak 6 kuyulu bir plakanın belirli bölgelerinde insan göbek damarı endotel hücresi (HUVEC) yapışıklığı teşvik etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, hücre büyümesini segmentlere ayırarak, VC'lerin yalnızca bir tür kesme profili yaşadığı ve kuyunun başka bir yerindeki diğer profillere maruz kalan VC'lerden gelen salgılardan etkilenmediği için yukarıda açıklanan sınırlamayı çözer.

Protokol

1. Cihazların imalatı ve reaktiflerin hazırlanması

1. Paslanmaz çelik modülün imalatı
   1. Paslanmaz çelik modülü, sağlanan mühendislik çizimine göre bir CNC freze makinesi kullanarak 316 paslanmaz çelikten imal edin (Şekil 1).
2. Polidimetilsiloksisan (PDMS) kalıbının 3D baskısı
   1. Sağlanan mühendislik çizimine göre SolidWorks kullanarak PDMS kalıbının 3D bilgisayar destekli tasarım (CAD) modelini hazırlayın (Şekil 2).
   2. CAD modelini bir STL dosyasına verin ve STL dosyasını Cura 2.6.2'ye alın.
   3. Modeli 50 mm/s baskı hızı ve %60 dolum yoğunluğu ile katmanlar halinde dilimleyin.
   4. Dosyayı G kodu olarak dışa aktarın ve yazdırmak için ultimaker² 3D yazıcıya yükleyin. Baskı malzemesi olarak polilaktik asit (PLA) kullanın.
3. PDMS halkasının dökümü
   1. PDMS tabanını ve kürleme maddesini (her ikisi de silikon elastomer kitinden) %90,9 baz ve %9,1 kürleyici madde oranıyla karıştırın.
   2. İyi karıştırılır çözeltinin yaklaşık 2,6 mL'lik kısmını 3D baskılı kalıba dökün.
   3. Vakum gaz giderme odasında kabarcıkları çıkarın.
   4. 80 °C fırında 1 saat boyunca tedavi edin.
   5. PDMS halkasının oda sıcaklığına soğumasını bekleyin, ardından kürlenmiş PDMS halkasını kalıptan dikkatlice çıkarın. PDMS halkasının mühendislik çizimi Şekil 3'tegösterilmiştir.
4. %1 Pluronic F-127 hazırlanması
   1. 5 g Pluronic F-127 tartın, bir cam şişeye dökün, ardından cam şişeye 100 mL steril su ekleyin. Bu% 5 Pluronic F-127 çözümü verir.
   2. Tüm Pluronic F-127 tozlarının suya batırıldığından emin olun, kapağı kapatın ve sıvı sterilizasyon döngüsü programı kullanarak otoklavlayın.
   3. Otoklavdan sonra, kullanmadan önce çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
   4. %1 Pluronic F-127 çözeltisi yapmak için 40 mL otomatik kapatılmış steril suya 10 mL%5 Pluronic F-127 çözeltisi ekleyin. Seyreltme işlemi biyogüvenlik kabini (BSC) davlumbazında gerçekleştirin.
   5. Oda sıcaklığında hem %1 hem de %5 Pluronic F-127 saklayın.
5. %4 paraformaldehit hazırlanması (PFA)
   1. Bir cam kabın içine 800 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve karıştırırken 60 °C'ye ısıtın (1,5,1 ila 1,5,5 adım arasında karıştırmaya devam edin).
   2. 40 g PFA tozu tartın ve sıcak PBS çözeltisine ekleyin.
      DİkKAT: PFA tehlikelidir, duman kaputunda 1.5.2 ila 1.5.6 adımlarını uygulayın.
   3. Çözeltiler netleşene kadar PFA çözeltisine yavaşça 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ekleyin.
   4. PFA çözeltisinin pH'ını 1 M hidroklorik asit (HCl) ile yaklaşık 7,4'e ayarlayın.
   5. 1X PBS ile çözeltiyi 1 L'ye kadar toplar. Bu% 4 PFA 1 L verir.
   6. FSAF çözeltisini 0,2 μm filtrelerle filtreleyin ve partikülleri, aliquot'u çıkarın ve -20 °C dondurucuda dondurun.
6. %0.1 Triton-X'in hazırlanması
   1. %0,1 Triton-X çözümü yapmak için 50 mL PBS'ye 50 μL saf Triton-X ekleyin.
7. %1 sığır serum albümini hazırlanması (BSA)
   1. 0,5 g BSA ağırlığında, 50 mL santrifüj tüpüne dökün ve ardından tüpe 50 mL PBS ekleyin.
   2. Çözünmesi için bir silindir üzerinde oda sıcaklığında 1 saat yuvarlanmasına izin verin.
   3. %1 BSA'yı iki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.

2. 6 kuyulu bir plakanın kaplanması

1. Kullanmadan önce paslanmaz çelik modülü, PDMS halkasını ve cımbızı otoklavlav. Sonraki tüm prosedürleri bir BSC davlumbazında gerçekleştirin ve steriliteyi sağlamak için aseptik teknikleri gözlemleyin.
2. PDMS halkasını cımbız kullanarak 6 kuyuya yerleştirin. PDMS halkasını kuyuyla merkezi olarak hizalamak için PDMS halkasının dış kenarını kullanın.
   NOT: Sadece doku dışı kültür iyi tedavi edilen plakalar kullanılmalıdır.
3. Paslanmaz çelik modülü cımbız kullanarak PDMS halkasının üzerine yerleştirin.
4. İç tutucu halka pensesinin uçlarını tutucu halkanın kavrama deliklerine yerleştirin, tutucuyu sıkın ve tutucuyu tutma halkasının çapını azaltmak için sıkın. 6 kuyuya takın, paslanmaz çelik modüle sıkıca bastırın ve PDMS halkasını kuyuda sabitlemek için penseyi serbest bırakın.
5. PDMS halkası ve paslanmaz çelik modülün açılmasıyla kuyunun ortasına veya kenarına (ilgi alanına bağlı olarak) 1 mL 5 μg/mL fibronektin ekleyin.
6. Fibronektin çözeltisinin tüm ilgi çekici bölgeyi kapsadığından emin olmak için plakayı döndürün.
7. % 95 hava / % 5 CO₂altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.
8. Fibronektin çözeltisini kuyudan çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi kuyudan tamamen çıkarın.
9. Saklama halkasını, paslanmaz çelik modülü ve PDMS halkasını kuyudan çıkarın.
10. Kuyunun ortasına veya kenarına (kaplamasız yüzey) %1,5 mL Pluronic F-127 ekleyin ve kaplamasız yüzeyi geçmek için oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yaslayın.
11. Pluronic F-127 çözeltisini kuyudan çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın.
12. Kaplamalıyı hemen iyi kullanın veya kaplanmış kuyuda bir PBS tabakası ile iki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.

3. HUVEC'lerin Tohumlama

1. Deneyde 5.
2. Tüm kültür ortamını çıkarın ve PBS ile hücreleri bir kez yıkayın.
3. % 0.05 tripsin 3 mL ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika boyunca% 95 hava / % 5 CO₂altında nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yaslanın. Hücreleri yerinden çıkarmak için şişeye hafifçe dokunun.
   NOT: Bu protokol HUVEC'ler kullanılarak test edilmiştir ve tripin konsantrasyonu ve inkübasyon süresi diğer VC'ler için farklı olabilir.
4. Çözeltiyi 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve önceden 37 °C'ye kadar ısıtılmış 6 mL kültür ortamı (örneğin, Lonza EGM-2) kullanarak tripsin nötralize edin.
5. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj. Nötralize tripsin çözeltisini çıkarın ve 1 mL önceden uyarılmış kültür ortamı ile hücreleri yeniden kullanın.
6. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 180k hücrelerini 1,5 mL önceden uyarılmış kültür ortamında kaplanmış 6 kuyulu bir plakaya koyun.
7. Hücrelerin kuyuda eşit şekilde dağılmasını sağlamak için kuyu plakasını yanal olarak sallayın.
8. Bir gecede %95 hava/%5 CO_2'nin altında 37 °C nemlendirilmiş inkübatörde bırakın.
9. Eklenmemiş hücreleri ve kültür ortamını çıkarın ve 2mL önceden uyarılmış kültür ortamı ile değiştirin.
   NOT: ortamda yüzen birçok eklenmemiş hücre beklenir.

4. Yörüngesel çalkalayıcı kullanarak kesme stresi uygulaması

1. HUVEC'ler 3 günlük büyümeden sonra birleştiğine ulaşmalıdır. Ortamı 1,9 mL önceden ısıtılan kültür ortamıyla değiştirin (2 mm yüksekliğe ulaşmak için).
2. Plakayı% 95 hava / % 5 CO 2 altında nemlendirilmiş bir inkübatöre bir yörünge çalkalayıcının platformuna yerleştirin ve₃ gün boyunca 150 rpm'de döndürün.
   NOT: Orbital çalkalayıcının dış yüzeyini inkübatöre yerleştirmeden önce %70 etanol kullanarak silin.
3. (İsteğe bağlı) 2 günlük kesmeden sonra, sitokinler ve kesme stresi arasındaki etkileşimi araştırmak için kültür ortamına sitokinler eklenebilir. Tedaviden sonra, hücreleri başka bir gün için kesin. Bu çalışmada hücreleri aktive etmek için TNF-α kullanılmıştır.
4. 3 günlük kesme stresi uygulamasından sonra analizler gerçekleştirin.

5. Hücrelerin boyanma ve görüntülenmesi

1. 3 günlük kesmeden sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve PBS ile hücreleri iki kez yıkayın.
2. Kuyuya %4 PFA'nın 1,5 mL'sini ekleyerek hücreleri sabitlayın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
3. %4 PFA'yı kuyudan çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın.
4. Kuyuya % 0,1 Triton-X ekleyerek hücrelerin dengesini bozun ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
5. %0,1 Triton-X solüsyonunun kuyudan çıkarılması ve blokaj için kuyuya %1 BSA'nın 1,5 mL'lik kısmını ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 BSA ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
6. Tavşan anti-insan ZO-1 antikorunu% 1 BSA'da 1:200 seyreltmede seyreltin. Kuyuya 1,5 mL seyreltilmiş antikor ekleyin ve 4 °C'de bir gecede hücrelerle kuluçkaya yatırın.
7. Gecelik inkübasyondan sonra, seyreltilmiş antikorun çıkarılmasının ve hücreleri PBS ile üç kez yıkaması.
8. Pbs'de 1:300 seyreltmede Alexa Fluor 488 etiketli keçi anti-tavşan IgG ikincil antikorunu seyreltin. Kuyuya 1,5 mL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca hücrelerle kuluçkaya yatırın.
9. Seyreltilmiş ikincil antikorları çıkarın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
10. DRAQ5'i PBS'de 1:1000 seyreltmede seyreltin. Kuyuya 1,5 mL seyreltilmiş DRAQ5 ekleyin ve hücre çekirdeğini lekelemek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca hücrelerle kuluçkaya yatırın.
11. Seyreltilmiş DRAQ5'i çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın.
12. Konfokal mikroskopla kenardan kuyunun ortasına karo taraması yapın.

6. Şekil indeksinin ve hücre sayısının nicelleştirilmesi

1. MATLAB R2016a kullanarak görüntüleri yayınlayın.
2. LIF dosyasını konfokal mikroskoptan MATLAB'a okuyun ve birleştirilmiş döşeme taramasını ikili bir görüntüye dönüştürün, ardından çekirdekleri arka plandan ayırmak için görüntüyü alana ve yoğunluğa göre eşik yapın.
3. İkili karo taramasını 1 mm radyal parçalara bölün.
4. Her bir çekirdeğe bir elips tak.
5. Hücre numarası vermek için her radyal segmentteki elips sayısını sayın.
6. Şekil dizinini = SI = 4π x Alan / Çevre²olarak tanımlayın. Her elips¹⁸için şekil dizinini hesaplayın.

Sonuçlar

HUVEC'lerin fibronektin ile kaplanmamış kuyu plakası bölgelerine yapışması Pluronic F-127 pasivasyonu ile kırıldı; büyüme, kesme stresi uygulaması ile ve olmadan 72 saat kültürden sonra bile fibronektin ile kaplanmış bölge ile sınırlıydı (Şekil 4A, Şekil 4C). Pluronic F-127 pasivasyonu olmadan, HUVEC'ler fibronektin olmadan yüzeye tutturuldu ve 72 saat kültürle daha da çoğaldı (?...

Tartışmalar

Dönen kuyu yöntemi, tek bir kuyuda karmaşık akış profilleri üretebilir - merkezde Düşük Büyüklükte Çok Yönlü Akış (LMMF) ve kuyunun kenarında Yüksek Büyüklükte Tek Eksenli Akış (HMUF). Bununla birlikte, çözünür aracılı kesme stresi salgıları dönen ortamda karıştırılacak ve tüm kuyudaki hücreleri etkileyecek ve belirli bir kesme stres profilinin hücreler üzerindeki gerçek etkisini maskeleyebilecektir.

Burada gösterilen kaplama yöntemi, hücrelerin b?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell and Media
Endothelial Growth Medium (EGM-2)	Lonza	cc-3162
Human Umbilical Vein Endothelial Cells	NA	NA	Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital
Reagents and Materials
Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG	Thermofisher Scientific	A11008
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-50G
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated	Scientific Laboratory Supplies Ltd	351146
Fibronectin from Bovine Plasma	Sigma-Aldrich	F1141-5MG
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Phosphate-Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-6X500ML
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Recombinant Human TNF-a	Peprotech	300-01A
RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg	RS	832-0264
Stainless Steel 316	Metal Supermarket	NA
Sylgard184 Silicone Elastomer kit	Farnell	101697
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody	Cell Signaling Technology	13663
DRAQ5 (5mM)	Bio Status	DR50200
Equipments
Grant Orbital Shaker PSU-10i	Scientific Laboratory Supplies Ltd	SHA7930
Leica TCS SP5 Confocal Microscope	Leica	NA
Retaining Ring Pliers	Misumi	RTWP32-58
Retaining Rings/Internal/C-Type	Misumi	RTWS35
Ultimaker 2+3-D printer	Ultimaker	NA
Softwares
Cura 2.6.2	Ultimaker	NA
MATLAB	The MathWorks	NA
Solidworks 2016	Dassault Systemes	NA