Segmentazione della crescita delle cellule endoteliali in piastre a 6 pozzi su uno shaker orbitale per studi meccanobiologici

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo di rivestimento per limitare la crescita delle cellule endoteliali a una regione specifica di una piastra a 6 po porsi per l'applicazione della sollecitazione di taglio utilizzando il modello di agitatore orbitale.

Abstract

Lo stress da taglio imposto alla parete arteriosa dal flusso sanguigno influisce sulla morfologia e sulla funzione delle cellule endoteliali. Sollecitazioni di taglio di bassa magnitudine, oscillatorie e multidirezionali sono state tutte postulate per stimolare un fenotipo pro-aterosclerotico nelle cellule endoteliali, mentre si pensa che l'alta magnitudine e il taglio unidirezionale o uniassiale promuovano l'omeostasi endoteliale. Queste ipotesi richiedono ulteriori indagini, ma le tecniche tradizionali in vitro hanno dei limiti e sono particolarmente povere nell'imporre sollecitazioni di taglio multidirezionali sulle cellule.

Un metodo che sta guadagnando sempre più uso è quello di coltura delle cellule endoteliali nelle piastre standard multi-pozzo sulla piattaforma di uno shaker orbitale; in questo metodo semplice, a basso costo, ad alta produttività e cronico, il mezzo vorticoso produce diversi modelli e magnitudini di taglio, incluso il taglio multidirezionale, in diverse parti del pozzo. Tuttavia, ha una limitazione significativa: le cellule in una regione, esposte a un tipo di flusso, possono rilasciare mediatori nel mezzo che influenzano le cellule in altre parti del pozzo, esposte a flussi diversi, distorcendo così la relazione apparente tra flusso e fenotipo.

Qui presentiamo una modifica facile e conveniente del metodo che consente alle cellule di essere esposte solo a specifiche caratteristiche di sollecitazione di taglio. La semina cellulare è limitata a una regione definita del pozzo rivestendo la regione di interesse con fibronectina, seguita da passivazione utilizzando soluzione passivante. Successivamente, le piastre possono essere ruotate sullo shaker, con conseguente esposizione delle cellule a profili di taglio ben definiti come taglio multidirezionale di bassa magnitudine o taglio uniassiale di alta magnitudine, a seconda della loro posizione. Come in precedenza, l'uso di plastware standard per la coltura cellulare consente un'ulteriore analisi diretta delle cellule. La modifica ha già permesso la dimostrazione di mediatori solubili, rilasciati dall'endotelio con caratteristiche di sollecitazione di taglio definite, che colpiscono le cellule situate altrove nel pozzo.

Introduzione

Le risposte delle cellule vascolari al loro ambiente meccanico sono importanti nella normale funzione dei vasi sanguigni e nello sviluppo della malattia¹. La meccanobiologia delle cellule endoteliali (EC) che ricorrono la superficie interna di tutti i vasi sanguigni è stata un particolare obiettivo della ricerca meccanobiologica perché gli EC sperimentano direttamente lo stress da taglio generato dal flusso sanguigno su di essi. Vari cambiamenti fenotipico come risposte infiammatorie, rigidità e morfologia alterate, rilascio di sostanze vasoattive e localizzazione ed espressione delle proteine giunzionali dipendono dall'esposizione della CE allo stress da^{taglio 2,3,4}. Le proprietà endoteliali shear-dependent possono anche tenere conto dello sviluppo irregolare di malattie come l'aterosclerosi^5,6,7.

È utile studiare l'effetto del taglio sui CES in coltura, dove le sollecitazioni possono essere controllate, e gli EC possono essere isolati da altri tipi di cellule. I dispositivi in vitro comunemente utilizzati per l'applicazione della sollecitazione di taglio agli EC includono la camera di flusso a piastre parallele e il viscometer a cono e piastra, ma solo il flusso uniassiale costante, oscillatorio e pulsatile può^{essere applicato 8,9}. Sebbene siano state sviluppate camere di flusso modificate con geometrie affusolata o ramificata e chip microfluidici che imitano una geometria stenotica, la loro bassa produttività e la durata di coltura relativamente breve che è possibile rappresentano una^{sfida 10, 11}.

Il metodo dello shaker orbitale (o pozzo vorticoso) per lo studio della meccanotrasduzione endoteliale, in cui le cellule sono coltivate in plasticware standard di coltura cellulare posto sulla piattaforma di uno shaker orbitale, sta guadagnando sempre più attenzione perché è in grado di imporre modelli di sollecitazione di taglio complessi e spazialmente variabili su EC ad alta produttività (vedi revisione da parte di Warboys et al.¹²). Simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) sono state utilizzate per caratterizzare la variazione spaziale e temporale della sollecitazione di taglio in un pozzo vorticoso. Il movimento vorticoso del mezzo di coltura causato dal moto orbitale della piattaforma dello shaker su cui è posizionata la piastra porta a un flusso multidirezionale di bassa magnitudine (LMMF, o flusso putativamente pro-aterogenico) al centro e a un flusso uniassiale di alta magnitudine (HMUF, o flusso putativamente ateroprotettivo) sul bordo dei pozzi di una piastra a 6 pozzi. Ad esempio, la sollecitazione di taglio della parete media nel tempo (TAWSS) è di circa 0,3 Pa al centro e 0,7 Pa sul bordo di una piastra a 6 po 'vorticosa a 150 giri/min con un raggio orbitale di 5 mm¹³. Il metodo richiede solo stoviglie disponibili in commercio e lo shaker orbitale stesso.

Esiste tuttavia uno svantaggio nel metodo (e in altri metodi di imposizione dei flussi in vitro): gli EC rilasciano mediatori solubili e microparticelle in modo dipendente dalla cesoia^14,15,16 e questo secretome può interessare i CE in regioni del pozzo diverse da quella in cui sono stati rilasciati, a causa della miscelazione nel mezzo vorticoso. Ciò può mascherare gli effetti effettivi della sollecitazione di taglio sul fenotipo CE. Ad esempio, Ghim et al.

Qui descriviamo un metodo per promuovere l'adesione della cellula endoteliale della vena ombelicale umana (HUVEC) in regioni specifiche di una piastra a 6 pozzi usando il rivestimento di fibronectina mentre si utilizza pluronico F-127 per passivare la superficie e prevenire la crescita altrove. Il metodo risolve la limitazione sopra descritta perché, segmentando la crescita cellulare, gli EC sperimentano un solo tipo di profilo di taglio e non sono influenzati da secretomi di EC esposti ad altri profili altrove nel pozzo.

Protocollo

1. Fabbricazione di dispositivi e preparazione di reagenti

1. Fabbricazione di moduli in acciaio inossidabile
   1. Fabbricare il modulo in acciaio inossidabile da un acciaio inossidabile di grado 316 utilizzando una fresatrice CNC secondo il disegno ingegneristico fornito(Figura 1).
2. Stampa 3D di uno stampo polidimetilsilossano (PDMS)
   1. Preparare un modello CAD (Computer Aided Design) 3D dello stampo PDMS utilizzando SolidWorks in base al disegno ingegneristico fornito (Figura 2).
   2. Esportate il modello CAD in un file STL e importate il file STL in Cura 2.6.2.
   3. Affettare il modello a strati con una velocità di stampa di 50 mm/s e una densità di riempimento del 60%.
   4. Esportare il file come codice G e caricarlo su una stampante 3D Ultimaker² per la stampa. Utilizzare l'acido polilattico (PLA) come materiale di stampa.
3. Fusione dell'anello PDMS
   1. Mescolare la base PDMS e l'agente polimerizzante (sia da un kit di elastomero siliconico) con il rapporto del 90,9% di base e del 9,1% di agente polimerizzante.
   2. Versare circa 2,6 mL della soluzione ben miscelata nello stampo stampato in 3D.
   3. Rimuovere le bolle in una camera di degassamento sottovuoto.
   4. Polimerirlo per 1 h in un forno a 80 °C.
   5. Lasciare raffreddare l'anello PDMS a temperatura ambiente, quindi rimuovere accuratamente l'anello PDMS stagionato dallo stampo. Il disegno ingegneristico dell'anello PDMS è illustrato nella figura 3.
4. Preparazione dell'1% pluronico F-127
   1. Pesare 5 g di Pluronic F-127, versarlo in una bottiglia di vetro, quindi aggiungere 100 ml di acqua sterile nella bottiglia di vetro. Questo dà una soluzione Pluronic F-127 al 5%.
   2. Assicurarsi che tutta la polvere Pluronic F-127 sia immersa nell'acqua, chiudere il tappo e autoclave utilizzando un programma di ciclo di sterilizzazione liquido.
   3. Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente prima dell'uso.
   4. Aggiungere 10 mL di soluzione Pluronic F-127 al 5% a 40 mL di acqua sterile autoclavata per fare soluzione 1% Pluronica F-127. Eseguire la diluizione in un armadio di biosicurezza (BSC).
   5. Conservare sia l'1% che il 5% di Pluronic F-127 a temperatura ambiente.
5. Preparazione del 4% di paraformaldeide (PFA)
   1. Aggiungere 800 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a un bicchiere di vetro e scaldarlo a 60 °C mescolando (continuare a mescolare dal passaggio da 1.5.1 a 1.5.5).
   2. Pesare 40 g di polvere di PFA e aggiungerlo alla soluzione PBS calda.
      ATTENZIONE: PFA è pericoloso, eseguire i passaggi da 1.5.2 a 1.5.6 in una cappa aspirante.
   3. Aggiungere 1 M idrossido di sodio (NaOH) lentamente dropwise nella soluzione PFA fino a quando le soluzioni non si chiarisce.
   4. Regolare il pH della soluzione di PFA a circa 7,4 con 1 M di acido cloridrico (HCl).
   5. Ricaricare la soluzione a 1 L con 1X PBS. Ciò dà 1 L del 4% di PFA.
   6. Filtrare la soluzione PFA con filtri da 0,2 μm per rimuovere eventuali particolato, aliquota e congelare in un congelatore a -20 °C.
6. Preparazione dello 0,1% di Tritone-X
   1. Aggiungere 50 μL di Triton-X puro in 50 mL di PBS per fare soluzione Triton-X allo 0,1%.
7. Preparazione dell'albumina del siero bovino all'1% (BSA)
   1. Pesare 0,5 g di BSA, versarlo in un tubo di centrifuga da 50 ml, quindi aggiungere 50 mL di PBS nel tubo.
   2. Lasciare rotolare per 1 h a temperatura ambiente su un rullo per dissolversi.
   3. Conservare l'1% di BSA a 4 °C per un massimo di due settimane.

2. Rivestimento di una piastra a 6 po porsi

1. Modulo autoclave in acciaio inossidabile, anello PDMS e pinzette prima dell'uso. Eseguire tutte le procedure successive in una cappa BSC e osservare le tecniche asettiche per garantire la sterilità.
2. Posizionare l'anello PDMS in un po 'di 6 pozzine usando una pinzetta. Utilizzate il bordo esterno dell'anello PDMS per allineare l'anello PDMS concentricamente con il pozzo.
   NOTA: Devono essere utilizzate solo piastre di coltura non tissutale trattate bene.
3. Posizionare il modulo in acciaio inossidabile sopra l'anello PDMS utilizzando una pinzetta.
4. Inserire le punte delle pinze ad anello di fissaggio interne nei fori di presa dell'anello di fissaggio, spremere il supporto per ridurre il diametro dell'anello di fissaggio. Inserirlo nel pozzo 6, premerlo saldamente sul modulo in acciaio inossidabile e rilasciare le pinze per fissare l'anello PDMS nel pozzo.
5. Aggiungere 1 mL di fibronectina 5 μg/mL al centro o al bordo del pozzo (a seconda della regione di interesse) attraverso l'apertura dell'anello PDMS e del modulo in acciaio inossidabile.
6. Ruotare la piastra per assicurarsi che la soluzione di fibronectina copra tutta la regione di interesse.
7. Incubare per 30 min a 37 °C in un incubatore umidificato sotto il 95% di aria/5% di CO₂.
8. Rimuovere la soluzione di fibronectina dal pozzo e lavare due volte con PBS. Rimuovere completamente il PBS dal pozzo.
9. Rimuovere l'anello di fissaggio, il modulo in acciaio inossidabile e l'anello PDMS dal pozzo.
10. Aggiungere 1,5 mL di 1% di Pluronic F-127 al centro o al bordo del pozzo (superficie non rivestita) e incubare per 1 h a temperatura ambiente per passivare la superficie non rivestita.
11. Rimuovere la soluzione Pluronic F-127 dal pozzo e lavare tre volte con PBS.
12. Utilizzare immediatamente il pozzo rivestito o conservarlo a 4 °C per un massimo di due settimane con uno strato di PBS nel pozzo rivestito.

3. Semina di HUVEC

1. Utilizzare gli HUVEC al di sotto del passaggio 5 nell'esperimento.
2. Rimuovere tutti i mezzi di coltura e lavare le celle una volta con PBS.
3. Aggiungere 3 mL di 0,05% di tripside e incubare per 3 minuti a 37 °C in un incubatore umidificato sotto il 95% di aria/5% di CO₂. Toccare delicatamente il pallone per rimuovere le cellule.
   NOTA: Questo protocollo è stato testato utilizzando huvec e la concentrazione di tripina e il suo tempo di incubazione possono essere diversi per altri tipi di EC.
4. Trasferire la soluzione in un tubo di centrifuga da 15 ml e neutralizzare la tripina utilizzando 6 ml di terreno di coltura (ad esempio, Lonza EGM-2) preconsizionato a 37 °C.
5. Centrifuga a 200 x g per 5 min. Rimuovere la soluzione di tripside neutralizzata e rimorsire le celle con 1 mL di terreno di coltura prebellico.
6. Contare le cellule usando un emocitometro e seminare 180k cellule in una piastra rivestita a 6 porvili in 1,5 mL di mezzo di coltura prebellico.
7. Agitare lateralmente la piastra del pozzo per assicurarsi che le cellule distribuiscano uniformemente nel pozzo.
8. Lasciarlo in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 95% di aria / 5% di CO_{2 durante la} notte.
9. Rimuovere le celle non attaccate e il mezzo di coltura e sostituirli con 2 mL di mezzo di coltura prebellico.
   NOTA: sono attese molte cellule non attaccate che galleggiano nel mezzo.

4. Applicazione della sollecitazione di taglio utilizzando uno shaker orbitale

1. Gli HUVEC dovrebbero raggiungere la confluenza dopo 3 giorni di crescita. Sostituire il mezzo con 1,9 mL di mezzo di coltura prebellico (per raggiungere un'altezza di 2 mm).
2. Posizionare la piastra sulla piattaforma di uno shaker orbitale in un incubatore umidificato sotto il 95% di aria/5% di CO₂ e ruotarla a 150 giri/min per 3 giorni.
   NOTA: Pulire la superficie esterna dello shaker orbitale utilizzando il 70% di etanolo prima di posizionarlo nell'incubatore.
3. (Facoltativo) Dopo 2 giorni di taglio, le citochine possono essere aggiunte al mezzo di coltura per indagare l'interazione tra citochine e sollecitazione di taglio. Dopo il trattamento, tagliare le cellule per un altro giorno. In questo studio, il TNF-α è stato utilizzato per attivare le cellule.
4. Eseguire analisi dopo 3 giorni di applicazione della sollecitazione di taglio.

5. Colorazione e imaging delle cellule

1. Dopo 3 giorni di taglio, rimuovere la piastra dall'incubatrice e lavare le celle due volte con PBS.
2. Fissare le cellule aggiungendo 1,5 mL di 4% di PFA nel pozzo e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Rimuovere il 4% di PFA dal pozzo e lavare due volte con PBS.
4. Permeabilizzare le cellule aggiungendo lo 0,1% di Tritone-X nel pozzo e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Rimuovere la soluzione Triton-X allo 0,1% dal pozzo e aggiungere 1,5 mL di 1% di BSA nel pozzo per il blocco. Incubare le cellule con 1% di BSA per 1 h a temperatura ambiente.
6. Diluire l'anticorpo ZO-1 anti-umano del coniglio a una diluizione 1:200 nell'1% di BSA. Aggiungere 1,5 mL di anticorpo diluito nel pozzo e incubarlo con le cellule durante la notte a 4 °C.
7. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere l'anticorpo diluito e lavare le cellule tre volte con PBS.
8. Diluire l'anticorpo secondario IgG di capra etichettato Alexa Fluor 488 ad una diluizione 1:300 nel PBS. Aggiungere 1,5 mL di anticorpo secondario diluito nel pozzo e incubarlo con le cellule per 1 h a temperatura ambiente.
9. Rimuovere l'anticorpo secondario diluito e lavare le cellule due volte con PBS.
10. Diluire DRAQ5 con una diluizione di 1:1000 in PBS. Aggiungere 1,5 mL di DRAQ5 diluito nel pozzo e incubarlo con le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente per macchiare i nuclei cellulari.
11. Rimuovere il DRAQ5 diluito e lavare tre volte con PBS.
12. Eseguire una scansione delle piastrelle dal bordo al centro del pozzo con un microscopio confocale.

6. Quantificazione dell'indice di forma e del numero di cellule

1. Post elaborare le immagini utilizzando MATLAB R2016a.
2. Leggere il file LIF dal microscopio confocale in MATLAB e convertire la scansione del riquadro unito in un'immagine binaria, quindi sogliare l'immagine per area e intensità per distinguere i nuclei dallo sfondo.
3. Suddividi la scansione binaria delle piastrelle in segmenti radiali da 1 mm.
4. Adattare un'ellisse a ogni singolo nucleo.
5. Contare il numero di ellissi all'interno di ogni segmento radiale per assegnare un numero di cella.
6. Definire l'indice di forma = come SI = 4π x Area / Perimetro². Calcolare l'indice della forma per ogni ellisse¹⁸.

Risultati

L'adesione degli HUVEC alle regioni della piastra del pozzo non rivestita con fibronectina è stata abrogata dalla passivazione Pluronica F-127; la crescita è stata limitata alla regione rivestita con fibronectina anche dopo 72 ore di coltura, con e senza applicazione di sollecitazioni di taglio(figura 4A, figura 4C). Senza la passivazione Pluronica F-127, gli HUCOV attaccati alla superficie senza fibronectina e proliferati ulte...

Discussione

Il metodo del pozzo vorticoso è in grado di generare profili di flusso complessi in un unico pozzo : flusso multidirezionale di bassa magnitudo (LMMF) al centro e flusso uniassiale di alta magnitudine (HMUF) sul bordo del pozzo. Tuttavia, le secrezioni mediate dallo stress da taglio del mediatore solubile saranno mescolate nel mezzo vorticoso e influenzeranno le cellule in tutto il pozzo, mascherando potenzialmente il vero effetto di un particolare profilo di sollecitazione di taglio sulle cellule.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell and Media
Endothelial Growth Medium (EGM-2)	Lonza	cc-3162
Human Umbilical Vein Endothelial Cells	NA	NA	Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital
Reagents and Materials
Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG	Thermofisher Scientific	A11008
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-50G
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated	Scientific Laboratory Supplies Ltd	351146
Fibronectin from Bovine Plasma	Sigma-Aldrich	F1141-5MG
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Phosphate-Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-6X500ML
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Recombinant Human TNF-a	Peprotech	300-01A
RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg	RS	832-0264
Stainless Steel 316	Metal Supermarket	NA
Sylgard184 Silicone Elastomer kit	Farnell	101697
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody	Cell Signaling Technology	13663
DRAQ5 (5mM)	Bio Status	DR50200
Equipments
Grant Orbital Shaker PSU-10i	Scientific Laboratory Supplies Ltd	SHA7930
Leica TCS SP5 Confocal Microscope	Leica	NA
Retaining Ring Pliers	Misumi	RTWP32-58
Retaining Rings/Internal/C-Type	Misumi	RTWS35
Ultimaker 2+3-D printer	Ultimaker	NA
Softwares
Cura 2.6.2	Ultimaker	NA
MATLAB	The MathWorks	NA
Solidworks 2016	Dassault Systemes	NA