Katı Malzemeleri Kapsülleyen Bakteriyel Selüloz Küreler

Özet

Bu protokol, bakteriyel selüloz (BC) küreleri oluşturmak için kolay ve ucuz bir yöntem sunar. Bu biyomalzeme, biyoşarç, polimer küreler ve maden atıkları da dahil olmak üzere katı malzemeler için bir kapsülleme aracı olarak işlev görür.

Özet

Bakteriyel selüloz (BC) küreleri, M.Ö.'nün yeni bir materyal olarak popülerleşmesinden bu yana giderek daha fazla araştırılmaktadır. Bu protokol BC küre üretimi için uygun fiyatlı ve basit bir yöntem sunar. Bu kürelerin üretilmesinin yanı sıra katı parçacıklar için bir kapsülleme yöntemi de tanımlanmıştır. BC küreleri üretmek için su, siyah çay, şeker, sirke ve bakteri kültürü şaşkın bir şişede birleştirilir ve içeriği tedirgin edilir. BC küre oluşumu için uygun kültür koşulları belirlendikten sonra, katı parçacıkları kapsülleme yetenekleri biyoşarç, polimer boncuklar ve maden atıkları kullanılarak test edildi. Küreler ImageJ yazılımı ve termal gravimetrik analiz (TGA) kullanılarak karakterize edildi. Sonuçlar, 7,5 mm çapında kürelerin 7 günde yapılabileceğini göstermektedir. Çeşitli parçacıklar eklemek BC kapsüllerinin ortalama boyut aralığını artırır. Küreler kuru kütlelerinin % 10-20'sini kaplar. Bu yöntem, kolayca elde edilebilen malzemelerle mümkün olan düşük maliyetli küre üretimini ve kapsüllemlerini gösterir. BC küreleri gelecekte kirletici kaldırma yardımı, kontrollü salınımlı gübre kaplaması veya toprak değişikliği olarak kullanılabilir.

Giriş

Bakteriyel selüloz (BC), mekanik mukavemeti, yüksek saflığı ve kristalitesi, su tutma yetenekleri ve karmaşık lif yapısı 1 , 2 ,^3,4nedeniyle potansiyel endüstri kullanımı ile dikkat çekti. Bu özellikler BC'yi biyomedikal, gıda işleme ve çevresel iyileştirme kullanımları da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için elverişli bir biyomalzeme haline getirir¹. Bir BC filminin oluşumu, fermente bir çay içeceği olan kombucha⁵için kullanılanlar gibi tek organizma kültürleri veya karışık kültürlerle yapılabilir. Kombucha demleme, yaygın olarak SCOBY olarak bilinen "Simbiyotik Bakteri ve Maya Kültürü"ne dayanır. Organizmaların bu simbiyotik kültürünü kullanarak, BC küreleri oluşturmak için benzer bir teknik kullanılır. Bu biyomalzeme, çevresel kirleticilerin izole edilmesine ve daha verimli mahsul üretimi elde etmek için biyoşarş gibi tarımsal değişikliklerin demirlemesine yardımcı olmak için kullanılabilir.

Önceki literatür, M.Ö.'nün tedirgin koşullarda üretilen özelliklerinin sabit bir kültürde üretilen BC ile karşılaştırıldığında nasıl olduğunu tartışmıştır. Sabit bir kültür, sıvı hava arayüzünde oluşan bir filmle sonuçlanırken, sarsılmış bir kültür, sıvı⁶içinde asılı olan çeşitli BC parçacıkları, iplikçikler ve kürelerle sonuçlanır. Birçok çalışma, BC'nin ticari üretiminin dinamik koşullarda daha uygulanabilir olduğu iddiasına atıfta bulundu^6,7, bu makalenin yöntemini uygulamak için rasyonel sağlar. Ayrıca, BC kürelerinin yapısı ve özellikleri hakkında çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Toyosaki ve ark.^6, tedirgin BC üretimlerinde şaşkın ve pürüzsüz duvarlı Erlenmeyer şişelerini karşılaştırdı. Hu ve Catchmark⁴ tarafından yapılan bir çalışmada, mevcut BC küre üretim süreci için kılavuz olarak kullanılan BC küreleri için koşullar belirlendi ve sonuçları küre boyutunun 60 saat sonra artmaya devam etmediğini gösteriyor. Mohammad ve ark.¹ tarafından BC üretiminin gözden geçirilmesi, BC kültürünün sarsılmasının, başarılı BC büyümesi için gerekli olan oksijen tedarikini ve dağıtımını bile sağladığını göstermektedir. Holland ve ark.^8, X-ışını kırınımı ve Fourier transform kızılötesi spektroskopi kullanarak M.Ö.'nün kristalitesini ve kimyasal yapısını incelemiştir. BC kapsüllerinin benzer özellikler sergileyeceği ve gelecekteki araştırmaların yapısal özellikleri araştıracağı varsayılmaktadır. Çalışmalar ayrıca gelişmiş biyokompozitler üretmek için BC kullanmanın yararlı etkilerini de araştırmıştır. Epoksi-reçineyi baz olarak kullanan araştırmacılar, BC'nin eklenmesinin yorulma ömrü, kırılma tokluğu ve çekme ve bükülme mukavemeti^9,10gibi malzeme özelliklerini geliştirdiğini göstermiştir. Geçmiş ve mevcut araştırmalarda gösterildiği gibi, birçoğu BC kullanımını ticarileştirmekle ilgilenmektedir.

Birçok araştırmacı kontrollü salınım sistemlerinde bakteriyel selülozu araştırdı ve burada açıklanan yöntem kontrollü salınım sistemleri olarak kullanılabilecek kapsüller üretiyor. Bu araştırmanın çoğu biyomedikal alanda kontrollü salınıma ve kontrollü salınımlı gübre (CRF) yönetiminde bazı keşiflere odaklanmıştır. BC'nin kontrollü amoksisilin salınımının başarısına dayanarak¹¹, lidokrin¹²ve ibuprofen¹³, BC, peletlenmiş gübre gibi diğer maddelerle benzer teslimat özellikleri gösterebilir. Shaviv ve Mikkelsen¹⁴ tarafından CRF'lere genel bir bakış, CRF'lerin daha verimli olduğunu, işgücünden tasarruf ettiğini ve genellikle geleneksel gübre uygulamasına göre daha az çevresel bozulmaya neden olduğunu kabul eder. Bakteriyel selüloz CRF'ler için uygun bir kapsülleme malzemesi olarak çalışabilir. Gübreler BC membranlarından süzebilir veya BC biyobozunur^15,16olarak deşarj olabilir. BC'nin yüksek su şişme kapasitesi de yararlı bir toprak değişikliği olarak işlev görebilebilir^17,18,19 çünkü hem gübre besin maddeleri hem de nem BC kürelerinin uygulanması yoluyla toprağa salınabilir. Bu özelliklerle, BC küre kapsülleme tarafından oluşturulan bir CRF, üretim ve bertaraf aşamalarında olumsuz etkileri olabilecek diğer gübre kaplama malzemelerine göre avantajlı olabilir. BC'nin gübre kaplamasına uyarlanmış olarak uyarlanmış haline getirildirilebilir ve CRF teknolojileri daha da geliştirilebilir. Gübre salınım oranını düşürerek, mahsuller gübreyi almak ve su kütlelerine fazla akıntıyı önlemek için yeterli zamana sahip olacak ve böylece ötrofikasyonu veoksijen olmayan bölgeleri azaltacaktır. Benzer yavaş salınımlı gübreler, polimer kaplamalar kullanılarak hazırlanmış ve pilotlanmıştır²⁰.

Önceki araştırmalarda belirtilen protokollerin aksine, bu yüksek selüloz verimi yerine tek tip, uyumlu küre üretimine odaklanmaktadır. Ayrıca, bc kapsülleme diğer katı madde selüloz filmler ile çalışılmıştır, ancak küreler²¹. Bakteriyel selüloz küreleri üzerindeki araştırma genişletilerek, BC'nin çevreye duyarlı özellikleri nedeniyle faydalı olan M.Ö.'nün ticari olarak üretilmesi için daha fazla adım atılabilir. BC küre imalatının bu yöntemi ucuz, hazır mutfak malzemelerini kullanır. İlk montajdan sonra, BC küreleri 2 gün içinde parazit olmadan oluşmaya başlar. Bu strateji ile BC küreleri üretmek çok az alan gerektirir ve yenilebilir bir yan ürüne sahiptir, fermente çay 'kombucha'. Diğer çalışmalarda bahsedilen kapsülleme teknikleri arasında faz inversiyon tekniği^{22 , 23,}matris oluşumu^24,sprey kurutma²⁵ve sentez sırasında doğrudan kapsülleme ile oluşturulan kaplamalar²⁶bulunur. Bu yazıda özetlenen doğrudan kapsülleme yöntemi, hazır malzemeler kullanan kolay ve ucuz bir süreç isteyenler için yararlıdır.

Bu araştırma ile BC küre üretimi ve kapsülleme için başarılı bir protokol oluşturulmuştur. BC küreleri, biyoşark, mayın atıkları ve polistiren mikrobeadların katı parçacıklarını kendi bükme yapıları içinde kapsülleyebilir. Henüz endüstride yaygın olarak kullanılmasa da, BC gelecekteki uygulamalar için kullanılabilecek pratik, sürdürülebilir ve doğal olarak meydana gelen bir malzemedir.

Protokol

1. Bakteriyel selüloz başlangıç kültürünün oluşturulması ve sürdürülmesi

1. Bir SCOBY şeklinde yaklaşık 50 g bakteriyel selülozun başlangıç kültürünü elde edin. Ticari olarak satın alınabilir (örneğin, Sağlık için Kültürler'den). SCOBY'yi kağıt havlu ile kaplanmış 1 L beherin içine yerleştirin.
2. 700 mL deiyonize suyu kaynatın, SCOBY içerenden ayrı bir kapta aktarın ve 85 g sakkaroz ekleyin.
3. Sakkaroz çözüldükten sonra, 2 torba siyah çay (4.87 g) ekleyin. Çayı 1 saat dikin, ardından bir karıştırma çubuğu kullanarak çay poşetlerini dikkatlice çıkarın.
4. Çaya 200 mL damıtılmış beyaz sirke ekleyin. Karışımı 25 °C'ye kadar soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra, SCOBY içeren kabın içine 700 mL oda sıcaklığında çay ekleyin.
   DİkKAT: Asidik çayın çok sıcakken eklenmesi SCOBY'deki organizmalara zarar verebilir.
5. Kabı bir kağıt havlu ile örtün ve elastik bir bantla sabitleyin ve kabı 25 ° C sıcaklıkta bir depolama alanına yerleştirin. Bu gemi genellikle stok kültürü veya otel olarak adlandırılır.
6. SCOBY'yi sağlıklı tutmak için ayda yaklaşık 2 kez bakım yapılması gerekir.
   1. SCOBY paspaslarını tutmak için eldivenli eller kullanarak, sıvıyı otelden ayrı bir kabın içine boşaltın. Sıvı ile kapta, toplam 700 mL çözelti için yeterli asidik çay ekleyin.
   2. 65 g sakkaroziyi asitli çayla kapta çözün. Sakkarozun çözülmesini beklerken, SCOBY paspaslarını DI suyunda dikkatlice durulayın.
   3. Sakkaroz tamamen çözüldükten sonra, sıvı durulanmış SCOBY paspaslarını içeren behere eklenebilir. Kabı örtün ve kuluçka alanına geri verin.

2. Bakteriyel selüloz kürelerinin üretimi

NOT: Kaynar su ile çalışırken dikkatli olun. Cam eşyaların kaynar su sıcaklıklarına dayanabildiğinden, kusurlardan arındırılabildiğinden ve uygun boyutta olduğundan emin olun. BC kürelerinin üretimini açıklayan bir şema Şekil 1'de verilmiştir.

1. Çaydanlık kullanarak 350 mL deiyonize su kaynatın. Sıcak suyu 500 mL'lik bir kabına aktarın. 42,5 g toz sukozunun bir karıştırma çubuğu kullanarak sıcak suya çözün.
2. Sakkaroz tamamen çözüldüğünde, sakkaroz ve 1 saat su içeren şişeye dik 1 torba siyah çay (2,54 g). Bundan sonra, çay poşetini bir karıştırma çubuğu ile çıkarın, çay poşetini kırmamaya dikkat edin ve ardından çöpe atın.
3. Kabın içine 100 mL damıtılmış beyaz sirke ekleyin ve ardından karışımı iyice karıştırın. Asidik çay karışımının 80 mL'lik kısmını 250 mL'lik şaşkın bir şişeye aktarın. Çay karışımının oda sıcaklığına, 20 - 25 °C'ye soğumasını bekleyin.
   NOT: Bu noktada, karışım bir gecede veya bir sonraki adım için hazırlanana kadar soğumaya bırakılabilir.
4. Sıvı sıcaklığı oda sıcaklığına (20 - 25 °C) geldikten sonra, şaşkın şişeye 20 mL mikrobiyal başlangıç kültürü sıvısı ekleyin. Bu sıvı bir SCOBY otelinden temin edilebilir. Matarayı parafilm ile örtün.
5. Şaşkın şişeyi yörüngesel bir sallama masasına yerleştirin ve hızı dakikada 125 dönüşe (rpm) ayarlayın. M.Ö. küreleri üretmek için karışımın 20 - 25 ° C sıcaklıkta bir odada veya inkübatörde 3 gün boyunca sallanmasına izin verin.
   NOT: Matara içeriğinde düzensiz şekiller oluşursa veya selüloz kümeleri şişenin duvarlarına yapışırsa, daha fazla düzensiz BC kütlesinin oluşmasını önlemek için çıkarılmalıdır. İnce teller, halkalar, boru şeklindeki şekiller ve diğer açıkça küresel olmayan şekiller de dahil olmak üzere istenmeyen BC kütlelerini kaldırmak için cımbız kullanın.
6. Küreler oluştuktan sonra, şişeden hafifçe dökün ve bu makalede özetlenmiş olmayan bir şekilde analiz edin, atın veya kullanın.

3. Parçacıkları veya kirleticileri kapsüllemek için bakteriyel selüloz küreleri kullanma

1. Yukarıdaki 2.1-2.5 adımlarını izleyin.
2. 3 gün boyunca salladıktan sonra, şaşkın şişeye yaklaşık 0,01 g ince öğütülmüş partikül madde ekleyin. Uygun katı maddeler arasında biyoşark (260 ± 140 μm), maden atıkları (350 ± 140 μm) ve polistiren mikrobeadlar (3 μm) bulunur. Bu materyallerin verileri Temsili Sonuçlar bölümünde özetlenmiştir. Biyoşarç, maden atıkları ve mikrobeadların daha fazla açıklaması için lütfen ekli Malzeme Tablosuna bakın.
3. Matarayı tekrar parafilm ile örtün ve 3 gün daha aynı hız ve ortam sıcaklığını (20 - 25 ° C) kullanarak yörüngesel bir çalkalayıcıya geri yerleştirin. Analiz, bertaraf veya diğer kullanımlar için BC kapsüllenmiş parçacıkları çıkarın.

Şekil 1. Bakteriyel selüloz küre imalatı ve katı parçacıkların kapsüllenmesi. Adım 1, bakteri stok kültürünü siyah çay, şeker ve sirke ortamı ile şaşkın bir şişede birleştirmeyi içerir. Stok kültüründeki diskler BC paspaslarını temsil eder. Daha sonra, şaşkın şişe 3 gün boyunca yörüngesel bir sallama masasına yerleştirilir. Orta adım, M.Ö. küreleri oluştuktan sonra şişeye katıların eklendiğini gösterir. Şişe 3 gün daha çalkalanır. Son adımda, BC kürelerinin boyutu artmaya devam etti ve katı parçacıkları kapsülledi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

BC küreleri kültürün ilk 48 h'si boyunca en hızlı büyüme hızına sahiptir (Şekil 2). Şekil 2 ayrıca kürelerin maksimum ortalama boyuta ulaşma ve daha sonra sabit kalma eğilimini de göstermektedir. Bu deneyde küreler ortalama 7,5 ± 0,2 mm çapa ulaştı. BC küreleri 10 günlük büyüme süresi içinde hiçbir zaman tamamen bozulmasa da, sekizinci gün boyunca kürenin ana gövdesinden uzanan tendriller oluşturmaya başladı. Bu şekil

Tartışmalar

Bu protokol, yürütülmesi kolay ve uygun maliyetli BC küre üretimi ve kapsülleme yöntemlerini özetlemektedir. Orijinal protokolde yapılan çeşitli ayarlamalar sayesinde yeterli bir süreç belirlenmiştir. Uygulanabilir kürelerin sağlanması için kritik adımlar atılmalıdır. BC oluşumunda yer alan tüm bileşenler kürelerin sağlığında ve dayanıklılığında önemli bir rol oynar. Sakkaroz organizmaları besler, çay azot sağlar ve sirke istenmeyen kirleticileri önlemek için pH'ı en uygun koşul...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL graduated cylinder
1000 mL beaker
25 mL graduated cylinder
250 mL Erlenmeyer baffled flask	Chemglass	CLS-2040-02
500 mL beaker
Balance
Biochar			Ponderosa pine heat treated under argon gas, heated at 15 °C per minute to 800 °C
Black tea
Deionized water
Distilled white vinegar
Elastic band
Microbial starter culture	Cultures for Health
Mine waste			Collected from Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Mine waste contains soil and metals originating from past copper mining. Mn, Si, Ca, Al, and Fe were the five most prevalent elements measured in the mine waste through x-ray diffraction.
Mortar and pestle
Orbital shaker			Used various brands
Paper towel
Polystyrene microbeads	Polybead	17138	3 micron diameter
Stir rod
Sucrose
Tea kettle
TGA	TA Instruments	TA Q500	400 °C/min to 800 °C, 100 mL/min N2
Thermometer
XRF Analyzer	ThermoFisher Scientific	10131166