Tüp bebek pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu

Özet

Bu protokol, insan diş pulpası kök hücrelerini (hDC'ler) pankreas soylarına in vitroolarak ayırt etmek için iki farklı indüksiyon protokolü arasında bir karşılaştırma sunar: bütünleştirici protokol ve bütünleştirici olmayan protokol. Bütünleştirici protokol daha fazla insülin üreten hücre (IPC) üretir.

Özet

2000 yılı itibariyle, tip I diabetes mellitus tedavisinde Edmonton protokolünü kullanarak pankreas adacık naklinin başarısı hala bazı engellerle karşı karşıya kaldı. Bunlar arasında sınırlı sayıda kadavra pankreas bağışçısı ve immünsüpresanların uzun süreli kullanımı saydır. Mezenkimal kök hücreler (MSC' ler) adacık benzeri hücre neslinin alternatif bir kaynağı olarak potansiyel bir aday olarak kabul edilmiştir. Önceki raporlarımız, insan diş hamuru kök hücrelerini (hDC'ler) insülin üreten hücrelere (IPC' ler) ayırt etmek için indüksiyon protokollerinin oluşturulmasını başarıyla ortaya koymuştur. Bununla birlikte, indüksiyon verimliliği büyük ölçüde değişti. Bu yazıda, hDPSC türevli IPC'ler (hDPSC-IPC'ler) sunmak için bütünleştirici (mikroçevresel ve genetik manipülasyon) ve bütünleştirici olmayan (mikroçevronmental manipülasyon) indüksiyon protokolleri yoluyla hDPSC'lerin pankreas indüksiyon verimliliğinin karşılaştırılması gösterilmiştir. Sonuçlar, 3 boyutlu koloni yapısı, verim, pankreas mRNA belirteçleri ve çok dozajlı glikoz zorluğu üzerine fonksiyonel özellik açısından hem indüksiyon yaklaşımları için belirgin indüksiyon verimliliği göstermektedir. Bu bulgular, klinik olarak uygulanabilir bir IPC'lerin ve pankreas soy üretim platformunun gelecekteki kurulmasını destekleyecektir.

Giriş

Diabetes mellitus devam eden küresel bir endişe kaynağıdır. Uluslararası Diyabet Federasyonu (IDF) raporunda, diyabetin küresel prevalansının 2000 yılında 151 milyondan 2015 yılında 415 milyona yükseleceği tahmin edilmektedir^1,2. Epidemiyoloji temelli en son çalışma, dünya çapında tahmini diyabet prevalansının 2017'de 451 milyondan 2045'te 693 milyona yükseleceğini öngörtü^1. Edmonton protokolü kullanılarak pankreas adacık naklinin başarısı ilk olarak 2000 yılında, tip I diyabetik hastalarda endojen insülin üretiminin sürdürülmesi ve normoglisemik durumun stabilize edildiği gösterildiğin....

Protokol

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi ve Chulalongkorn Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi İnsan Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı. İnsan DPSC'leri (hDC'ler), yirmilik diş sorunları nedeniyle hem premolarlardan hem de azı dişlerinden çıkarılan insan diş hamuru dokularından izole edildi. Onaylı bir protokol (HREC-DCU 2018/054) kapsamında hastalardan bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

1. Bütünleştirici indüksiyon protokolü

1. PDX1 taşıyan lentiviral vektörün hazırlanması
   1. Viral paketleme için insan embriyonik böbrek (HEK) 293FT hücreleri kullanın. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (D....

Sonuçlar

Bu makalede, her iki indüksiyon protokolünün sonuçları karşılaştırılmıştır. Her iki indüksiyon protokolünün diyagramları Şekil 2A,C'de gösterilmiştir. Her iki protokolde de değerlendirme ışık mikroskobu altında yapıldı ve görüntüler ImageJ ile analiz edildi. hDC'ler her iki indüksiyon protokolünde de indüksiyonun ilk gününden itibaren koloni benzeri yapılar oluşturabildiler. Koloninin morfolojisi yuvarlak ve yoğundu ve tüm koloniler ind.......

Tartışmalar

MSC'lerden daha yüksek IPC üretimi elde etmek diyabet tedavisinde önemli bir rol oynar. Bütünleştirici protokolün kritik adımları, transdüksiyon için kullanılacak hücrelerin kalitesine ve transdüklenmiş hücrelerin kalitesine dayanır. Başarılı transdüksiyon için kontrol edilmesi gereken bazı hücre gereksinimleri, hücre sağlığını, hücre bankacılığı yönetimini ve hücrelerin mitotik olarak aktif bir durumda olmasını sağlamaktır. Ayrıca, transdüklenmiş hücrelerin canlılığını i.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific Corporation, USA	15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish	Corning®	430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific Corporation	12800017
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Corporation	10270106
GlutaMAX™	Thermo Fisher Scientific Corporation	35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific Corporation	25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter	Merck Millipore, USA	UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid	Addgene	12256	Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm	Merck Millipore	SLHV033RB
pMD2.G plasmid	Addgene	12259	Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck Millipore	TR-1003-G
psPAX2 plasmid	Addgene	12260	Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein	Merck Millipore	GF300
Beta-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific Corporation	21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1	Sigma-Aldrich	G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Invitrogen	41400-045
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs)	Thermo Fisher Scientific Corporation	11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm	Eppendorf	30701011
Sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625