In vitro Induction de cellules souches de pulpe dentaire humaine vers des lignées pancréatiques

Résumé

Ce protocole présente une comparaison entre deux protocoles d’induction différents pour différencier les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) vers des lignées pancréatiques in vitro: le protocole intégratif et le protocole non intégratif. Le protocole intégratif génère plus de cellules productrices d’insuline (PI).

Résumé

En 2000, le succès de la transplantation d’îlots pancréatiques à l’aide du protocole d’Edmonton pour traiter le diabète sucré de type I se heurte encore à certains obstacles. Il s’agit notamment du nombre limité de donneurs de pancréas cadavérique et de l’utilisation à long terme d’immunosuppresseurs. Les cellules souches mésenchymateuses (CSE) ont été considérées comme un candidat potentiel en tant que source alternative de génération de cellules de type îlot. Nos rapports précédents ont illustré avec succès l’établissement de protocoles d’induction pour différencier les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (hDPSC) des cellules productrices d’insuline (PI). Cependant, l’efficacité d’induction variait considérablement. Dans cet article, nous démontrons la comparaison de l’efficacité de l’induction pancréatique des hDPSC par le biais de protocoles d’induction intégratifs (manipulation microenvironnementale et génétique) et non intégratifs (manipulation microenvironnementale) pour l’octroi de CPI dérivés de hDPSC (hDPSC-IPC). Les résultats suggèrent une efficacité d’induction distincte pour les deux approches d’induction en termes de structure de colonie en 3 dimensions, de rendement, de marqueurs d’ARNm pancréatique et de propriété fonctionnelle en cas de défi de glucose multidose. Ces résultats soutiendront la mise en place future d’une plate-forme de production de CPI et de lignée pancréatique cliniquement applicable.

Introduction

Le diabète sucré est une préoccupation mondiale constante. Un rapport de la Fédération internationale du diabète (FID) a estimé que la prévalence mondiale du diabète augmenterait de 151 millions en 2000 à 415 millions en 2015^1,2. La dernière étude épidémiologique a prédit que la prévalence mondiale estimée du diabète passera de 451 millions en 2017 à 693 millions en 2045^1. Le succès de la transplantation d’îlots pancréatiques à l’aide du protocole d’Edmonton a été démontré pour la première fois en 2000, lorsqu’il a été démontré qu’il maintenait la production endogène d’insuline et stabilisait l’état normoglycémique chez les patients diabétiques de type I^3. Cependant, l’application du protocole d’Edmonton se heurte toujours à un problème de goulot d’étranglement. Le nombre limité de donneurs de pancréas cadavérique est le principal problème puisque chaque patient atteint de diabète de type I a besoin d’au moins 2 à 4 donneurs d’îlots. En outre, l’utilisation à long terme d’agents immunosuppresseurs peut provoquer des effets secondaires potentiellement mortels^4,5. Pour y remédier, le développement d’un traitement potentiel pour le diabète au cours de la dernière décennie s’est principalement concentré sur la génération de cellules productrices d’insuline (PI) efficaces à partir de diverses sources de cellules souches⁶.

Les cellules souches sont devenues un traitement alternatif dans de nombreuses maladies, y compris le diabète de type I, qui est causé par la perte de cellules bêta. La transplantation d’PI est la nouvelle méthode prometteuse pour contrôler la glycémie chez ces patients⁷. Deux approches pour générer des PI, les protocoles d’induction intégratifs et non intégratifs, sont présentées dans cet article. Le protocole d’induction imitait le processus naturel de développement pancréatique pour obtenir les PI matures et fonctionnels^8,9.

Pour cette étude, les hDPSC ont été caractérisés par cytométrie en flux pour la détection des marqueurs de surface MSC, le potentiel de différenciation multilignage et la RT-qPCR pour déterminer l’expression de la propriété de stemness et des marqueurs de gènes prolifératifs (données non montrées)^8,9,10. Les hDPSC ont été induits vers des cellules bêta ou PI endodermiques, endodermiques pancréatiques, endocriniens pancréatiques et pancréatiques définitifs(Figure 1),respectivement^7. Pour induire les cellules, une approche d’induction en trois étapes a été utilisée comme protocole de base. Ce protocole a été appelé protocole non intégratif. Dans le cas du protocole intégratif, le facteur de transcription pancréatique essentiel, PDX1, a été surexprimé dans les hDPSC, suivi de l’induction de PDX1 surexprimé dans les hDPSC à l’aide d’un protocole de différenciation en trois étapes. La différence entre le protocole non intégratif et le protocole intégratif est la surexpression de PDX1 dans le protocole intégratif et non dans le protocole non intégratif. La différenciation pancréatique a été comparée entre les protocoles intégratifs et non intégratifs de cette étude.

Protocole

Ce travail a été effectué conformément à la Déclaration d’Helsinki et approuvé par le Comité d’éthique de la recherche humaine, Faculté de médecine dentaire, Université Chulalongkorn. Les DPSC humains (hDPSC) ont été isolés à partir de tissus de pulpe dentaire humaine extraits à la fois des prémolaires et des molaires en raison de problèmes de dents de sagesse. Le consentement éclairé a été obtenu des patients dans le cadre d’un protocole approuvé (HREC-DCU 2018/054).

1. Protocole d’induction intégrative

1. Préparation du vecteur lentiviral porteur de PDX1
   1. Utilisez des cellules 293FT de rein embryonnaire humain (HEK) pour l’emballage viral. Culture et maintien de ces cellules dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de L-glutamine et 1% d’antibiotiques-antimycotiques.
   2. Générer des vecteurs PDX1-lentivirus par co-transfection de 10 μg chacun des plasmides d’emballage et d’enveloppe et de 20 μg du plasmide génétique ciblé dans des cellules HEK293FT à l’aide d’un système de transfection de phosphate de calcium, par exemple, psPAX2, pMD2. G, et humain pWPT-PDX1¹¹. Assurez-vous que les cellules sont confluentes à 80% à 90% pendant la période d’infection.
   3. Recueillir le milieu contenant des particules lentivirales à 48 et 72 h après la transfection.
   4. Filtrer le milieu recueilli à l’intérieur d’un filtre de 0,45 μm; concentrer les virus à l’avec un filtre centrifuge à un seuil de poids moléculaire nominal de 100 kDa (NMWCO).
2. Surexpression PDX1
   1. Utilisez le passage 3-5 hDPSC qui sont confluents à 70-80%. Trypsiniser et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Ensemencez 1 x^{10 6} hDPSC sur un plat de 60 mm traité par culture tissulaire et incubez pendant la nuit.
   2. 24 h plus tard, ajouter des particules virales fraîches obtenues à partir de l’étape 1.1.4 pour transduire des cellules prétraitées en polybrène (4 μg/mL de polybrene, 30 min sous 37 °C et 5 % de CO₂₎à la multiplicité d’infection souhaitée (MOI). Par exemple, dans ce cas, le MOI utilisé est de 20. Maintenir les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 h à 37 °C avec 5% de CO_2.
   3. Après la période d’infection de 24 heures, jeter le milieu contenant des particules virales. Ajouter des milieux de culture frais et continuer à faire pousser les cellules pendant 48 h. Toutes les cultures sont maintenues à 37 °C et 5 % de CO_2.
   4. Vérifiez la morphologie agrégée des cellules transfectées avant de passer à l’étape d’induction. La transduction de PDX1 est confirmée par une analyse del’expression génique( Figure supplémentaire 1 ).
      REMARQUE: Vérifiez la morphologie de la cellule au microscope avant de passer aux étapes suivantes.
   5. Récoltez et passez à un protocole d’induction en trois étapes (étape 1.3) en tant qu’approche d’induction microenvironnementale.
3. Protocole d’induction en trois étapes
   REMARQUE: Le protocole d’induction en trois étapes a abouti à la série de différenciation pancréatique des hDPSC en endoderme définitif, endoderme pancréatique / endocrinien et cellules bêta pancréatiques / IPC en utilisant respectivement un milieu sans sérum (SFM) A, SFM-B et SFM-C.
   1. Jeter le milieu de culture, puis laver les hDPSC transductés avec 1x solution tamponnée au phosphate (PBS).
   2. Ajouter la solution de trypsine-EDTA à 0,25 % aux cellules et incuber pendant 1 min à 37 °C, 5 % de CO_2.
   3. Ajouter le milieu de culture pour arrêter l’activité de la trypsine et rincer doucement les cellules pour obtenir la suspension unicellulaire. Comptez les cellules et aliquote 1 x 10⁶ cellules dans chaque tube collecteur.
   4. Centrifuger la suspension de la cellule à 468 x g (Force centrifuge relative: RCF), 4 °C, pendant 5 min. Jetez le surnageant et conservez la pastille de cellule.
   5. Resuspendez la pastille dans 3 mL du premier milieu d’induction pancréatique, c’est-à-dire un milieu sans sérum (SFM)-A. Ensemencez les cellules sur une plaque de culture à faible fixation (60 mm). Maintenir les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 3 jours.
      REMARQUE: Observez la morphologie des cellules sous un microscope inversé avant de passer à l’étape suivante.
   6. Retirez SFM-A et ajoutez 3 mL du deuxième milieu d’induction, c’est-à-dire SFM-B. Maintenir les cellules pendant les 2 prochains jours à 37 °C, 5 % de CO_2.
      REMARQUE: Observez la morphologie des cellules sous un microscope inversé avant de passer à l’étape suivante.
   7. Retirer le SFM-B et ajouter 3 mL du troisième milieu d’induction, c’est-à-dire le SFM-C. Maintenir les cellules pendant les 5 prochains jours dans un incubateur de culture cellulaire maintenu à 37 °C avec 5% de CO_2. Changez le support toutes les 48 h. Observez leur morphologie après 5 jours.
      REMARQUE: Chaque milieu d’induction est complété par différents réactifs comme décrit; SFM-A : 1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 1x insuline-transferrine-sélénium (ITS), 4 nM d’activine A, 1 nM de butyrate de sodium et 50 μM de bêta-mercaptoéthanol ; SFM-B : 1 % de BSA, 1x ITS et 0,3 mM de taurine ; et SFM C : 1,5 % de BSA, 1x ITS, 3 mM de taurine, 100 nM de peptide de type glucagon (GLP)-1, 1 mM de nicotinamide et 1x acides aminés non essentiels (AEN).
   8. Assurez-vous de vérifier la morphologie cellulaire sous un microscope inversé après chaque étape. Les cellules deviendront plus agrégées et flotteront en colonies.
   9. Recueillir les colonies cellulaires pour une analyse plus approfondie. Vérifiez la morphologie et la taille de la colonie. Effectuer une analyse de l’expression des marqueurs géniques pancréatiques et une analyse fonctionnelle (test de sécrétion de peptide C stimulé par le glucose).

2. Protocole d’induction non intégratif

REMARQUE: Le protocole non intégratif est le protocole de base pour la livraison des PI avec le processus d’induction en trois étapes en tant qu’approche d’induction microenvironnementale^8,9.

1. Utilisez les passages 3-5 hDPSC à 70% de confluence.
2. Jetez le milieu de culture et lavez les hDPSC avec 1x PBS.
3. Ajouter la solution de trypsine-EDTA à 0,25 % sur les cellules et incuber pendant 1 min à 37 °C, 5 % de CO_2.
4. Ajouter le milieu de culture pour arrêter l’activité de la trypsine et pipeter doucement les cellules pour obtenir la suspension unicellulaire. Comptez les cellules et aliquote 1 x 10⁶ cellules dans chaque tube de collecte.
   1. Centrifuger la suspension de la cellule à 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Jetez le surnageant.
   2. Resuspendez la pastille en SFM-A et ensemencez-la sur une plaque de culture à faible fixation (60 mm). Culturez les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 3 jours. Vérifiez la morphologie cellulaire au microscope inversé.
   3. Retirez SFM-A, ajoutez SFM-B (Jour 3) puis maintenez les cellules pendant les 2 jours suivants sous 37 °C, 5% CO₂.
   4. Retirez SFM-B, ajoutez SFM-C (Jour 5) puis maintenez les cellules pendant les 5 jours suivants sous 37 °C, 5% co₂. SFM-C est changé toutes les 48 h.
      REMARQUE: Chaque milieu d’induction est complété par différents réactifs comme décrit; SFM-A : 1 % de BSA, 1x ITS, 4 nM d’activine A, 1 nM de butyrate de sodium et 50 μM de bêta-mercaptoéthanol; SFM-B : 1 % de BSA, 1x ITS et 0,3 mM de taurine ; et SFM C : 1,5 % de BSA, 1x ITS, 3 mM de taurine, 100 nM de GLP-1, 1 mM de nicotinamide et 1x NEA.
   5. Assurez-vous de vérifier la morphologie cellulaire au microscope inversé après chaque étape et au jour 10.
      REMARQUE: Les cellules deviendront plus agrégées et flotteront en colonies.
   6. Recueillir les colonies cellulaires pour une analyse plus approfondie. Vérifiez la morphologie et la taille de la colonie. Effectuer une analyse de l’expression des marqueurs géniques pancréatiques et une analyse fonctionnelle (test de sécrétion de peptide C stimulé par le glucose).

Résultats

Dans cet article, les résultats des deux protocoles d’induction ont été comparés. Les diagrammes des deux protocoles d’induction sont illustrés à la Figure 2A,C. Dans les deux protocoles, l’évaluation a été réalisée au microscope optique et les images ont été analysées avec ImageJ. Les hDPSC ont pu former des structures de type colonie dès le premier jour d’induction dans les deux protocoles d’induction. La morphologie de la colonie était ronde et d...

Discussion

L’augmentation de la production de CPI à partir des CSAM joue un rôle essentiel dans le traitement du diabète. Les étapes critiques du protocole intégratif reposent sur la qualité des cellules à utiliser pour la transduction et la qualité des cellules transduisons. Certaines exigences cellulaires qui devraient être vérifiées pour une transduction réussie sont d’assurer la santé des cellules, la gestion des banques de cellules et les cellules sont dans un état mitotiquement actif. En outre, la surveillan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific Corporation, USA	15240062
Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish	Corning®	430166
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific Corporation	12800017
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific Corporation	10270106
GlutaMAX™	Thermo Fisher Scientific Corporation	35050061
Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific Corporation	25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter	Merck Millipore, USA	UFC910024
Human pWPT-PDX1 plasmid	Addgene	12256	Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm	Merck Millipore	SLHV033RB
pMD2.G plasmid	Addgene	12259	Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck Millipore	TR-1003-G
psPAX2 plasmid	Addgene	12260	Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260
Three-step Induction Protocol
Activin A Recombinant Human Protein	Merck Millipore	GF300
Beta-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific Corporation	21985-023
Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A6003
Glucagon-like peptide (GLP)-1	Sigma-Aldrich	G3265
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Invitrogen	41400-045
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-Essential Amino Acids (NEAAs)	Thermo Fisher Scientific Corporation	11140-050
Non-treated cell culture dish, 60mm	Eppendorf	30701011
Sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625