Osteoartrit Subkondral Kemik Kalınlığının Yazılım Destekli Nicel Ölçümü

Özet

Bu metodoloji makalesi, murine osteoartrit diz eklemlerinde ve normal diz eklemlerinde histolojik subkondral kemik kalınlığını kontrol olarak ölçmek için yazılım destekli nicel ölçüm protokolü sürmektedir. Bu protokol ince kalınlaşmaya karşı oldukça hassastır ve erken osteoartrit subkondral kemik değişikliklerini tespit etmek için uygundur.

Özet

Subkondral kemik kalınlaşma ve skleroz, hem hayvan modellerinde hem de insanlarda osteoartritin (OA) başlıca ayırt edici özellikleridir. Günümüzde histolojik subkondral kemik kalınlaştırmasının şiddeti çoğunlukla görsel tahmine dayalı yarı nicel not sistemleri ile belirlenmiştir. Bu makalede, medial menisküsün (DMM) istikrarsızlaştırılmasıyla indüklenen diz OA fare modelinde subkondral kemik kalınlığını nicel olarak ölçmek için tekrarlanabilir ve kolayca yürütülen bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, subkondral kemik kalınlaştırmasının genellikle DMM kaynaklı diz OA'sında meydana geldiği medial femoral kondyle ve tıbbi tibial platoda ilgi çekici bir bölge tanımladıktan sonra histolojik görüntülerde subkondral kemik kalınlığını ölçmek için ImageJ yazılımını kullandı. Kontrol olarak diz eklemlerinden sham işlemi ile histolojik görüntüler kullanıldı. İstatistiksel analizler, yeni geliştirilen nicel subkondral kemik ölçüm sisteminin düşük intra-ve gözlemciler arası değişkenliklerle yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu gösterdi. Sonuçlar, yeni protokolün ince veya hafif subkondral kemik kalınlaşmaya karşı yaygın olarak kullanılan görsel derecelendirme sistemlerinden daha hassas olduğunu göstermektedir. Bu protokol hem erken hem de ilerleyen osteoartrit subkondral kemik değişikliklerini tespit etmek ve OA kıkırdak derecelendirmesi ile uyumlu olarak OA tedavilerinin in vivo etkinliğini değerlendirmek için uygundur.

Giriş

Eklem kıkırdak, osteofitler ve subkondral kemik (SCB) skleroz kaybına bağlı eklem alanı daralması ile radyografik olarak karakterize osteoartrit (OA), artritin en sık görülen ^şeklidir1,2. Peri-artiküler kemiğin OA etiyolojislerindeki rolü tam olarak anlaşılamasa da osteofit oluşumu ve SCB sklerozun genellikle etken faktörlerden ziyade hastalık sürecinin bir sonucu olduğu düşünülmektedir, ancak peri-eklem kemik mimarisi/şekli ve biyolojislerindeki değişiklikler OA3,4'ün gelişimine ve ilerlemesine katkıda bulunabilir^. . SCB ölçümü de dahil olmak üzere doğru ve kolay yürütülen bir OA derecelendirme sisteminin geliştirilmesi, araştırma laboratuvarları arasında karşılaştırmalı çalışmalar ve OA ilerlemesini önlemek veya zayıflamak için tasarlanmış terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.

SCB, ince kubbe benzeri bir kemik plakası ve alttaki trabeküler kemik tabakası ile inşa edilir. SCB plakası, kireçlenmiş kıkırdaklara paralel ve hemen altında yatan kortikal lameldir. Arteriyel ve venöz damarların küçük dalları ve sinirler, kireçlenmiş kıkırdak ve trabeküler kemik arasında iletişim kurarak SCB plakasındaki kanallardan nüfuz eder. Subkondral trabeküler kemik kan damarları, duyusal sinirler, kemik iliği içerir ve SCB plakasından daha gözenekli ve metabolik olarak aktiftir. Bu nedenle, SCB şok emici ve destekleyici işlevler uygular ve normal eklemlerde kıkırdak besin kaynağı ve metabolizması için de ^{önemlidir5,6,7,8}.

SCB kalınlaşma (histolojide) ve skleroz (radyografide) OA'nın ve OA patofizyolojisinin önemli araştırma alanlarının başlıca ayırt edici özellikleridir. SCB kalınlaştırıcılığının ölçülmesi, OA şiddetinin histolojik değerlendirmelerinin önemli bir bileşenidir. Daha önce bildirilen kemirgen SCB mineral yoğunluğunu ölçmek için dijital mikroradyografi9 ve ^{OA10,11,12,13} kemirgen modellerinde mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) bazlı nicel SCB ölçümü, SCB yapısını ve SCB değişikliklerinin OA patofizyolojisolojislerindeki rolünü iyileştirdi. SCB alanı ve kalınlığı, belirli ve pahalı kemik histomomorfometri yazılımına sahip sofistike bir bilgisayar sistemi kullanılarak histolojik slaytlarla da ^{ölçülmüştir14}. Bununla birlikte, SCB kalınlaştırıcı derecelendirme de dahil olmak üzere görsel tahmin tabanlı yarı nicel OA derecelendirme sistemleri, şu anda mikro BT'den daha yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü derecelendirme sistemlerinin kullanımı kolaydır, özellikle çok sayıda histolojik görüntü taramak için. Bununla birlikte, mevcut OA derecelendirme sistemlerinin çoğu esas olarak kıkırdak değişikliklerine odaklanmaktadır15,16,17. SCB kalınlaştırmasını hafif, orta ve şiddetli olarak kategorize eden yaygın olarak kullanılan bir osteoartrit SCB kalınlığı derecelendirme yöntemi büyük ölçüde özneldir ve güvenilirliği tam olarak ^{doğrulanmamıştır15}. Güvenilir ve kolayca yürütülen adım adım osteoartrit SCB kalınlığı ölçüm protokolü tam olarak gelişmemiş veya standartlaştırılmamıştır.

Bu çalışma, OA'nın bir fare modelinde SCB kalınlığını nicel olarak ölçmek için tekrarlanabilir, hassas ve kolayca yürütülen bir protokol geliştirmeyi amaçlamıştır. Titiz ölçüm testlerimiz ve istatistiksel analizlerimiz, bu ImageJ yazılım destekli nicel ölçüm protokolünün hem normal hem de osteoartrit diz eklemlerindeki SCB kalınlığını ölçebileceğini göstermiştir. Yeni geliştirilen protokol tekrarlanabilir ve hafif SCB değişikliklerine karşı yaygın olarak kullanılan görsel derecelendirme sistemlerinden daha hassastır. Erken osteoartrit SCB değişikliklerini tespit etmek ve OA kıkırdak derecelendirmesi ile uyumlu olarak OA tedavilerinin in vivo etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Protokol

Bu protokolde yer alan tüm hayvan prosedürleri, Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından tüm federal ve eyalet yasa ve yönetmeliklerine uygun olarak onaylanmıştır.

1. Farelerde diz OA'sının oluşturulması

1. ^10-11 haftalık 22 vahşi tip BALB/c faresinde Glasson ve ark.18 tarafından tanımlandığı gibi medial menisküs (DMM) cerrahi istikrarsızlaştırma ile diz OA bir fare modeli oluşturun. Aynı arka plan ve yaşa sahip sekiz fare üzerinde kontrol prosedürü olarak sham ameliyatı gerçekleştirin.
   NOT: Her iki cinsiyet de orijinal proje için cinsiyetin biyolojik bir değişken olarak değerlendirilmesi için NIH gereksinimini karşılamak için kullanılmıştır, ancak cinsiyet farkının incelenmesi bu protokolün kapsamı değildir.
2. Isoflurane'nin solunmasıyla hayvanları uyuşturun. Solunum hızlarını/eforlarını ve parmak/kuyruk sıkışmasına yanıt eksikliğini izleyerek anestezinin derinliğini kontrol edin. Hayvanları supine pozisyonuna getirin.
3. Diz bölgesindeki cildi tıraş edin ve Povidone-İyot + alkol cilt ovma ile cildi temizleyin; üç alternatif döngü.
4. DMM prosedürünü sağ dizde cerrahi mikroskop altında gerçekleştirin. Diz eklemini medial parapateller kesiden (1,2-1,5 cm uzunluğunda) maruz bırakın ve eklem kapsülü incise. Patella ve patellar tendonu sağlam tutun. Medial menisküsleri tibial platoya tutturan medial meniskotibiyal ligamentin (MML) dikkatli bir şekilde maruz kalmasından sonra, medial menisküs dengesini bozmak için mikro cerrahi makasla transekte edin.
5. MML'nin görselleştirildiği ancak transekte olmadığı bir kontrol prosedürü olarak sağ dizde sham ameliyatı gerçekleştirin.
6. Eklem kapsülü 8-0 ile kapatın emilebilir poliglactin dikişleri ve cilt kesisi ile 7-0 emilemez dikişler hem DMM hem de sham prosedürleri için iyileşme gerçekleştikten sonra dizinin doğru kullanımını sağlamak için.
7. Tek bir enjeksiyondan sonra 72 saate kadar ağrı kesici sağlayan analjezi için cerrahi işlemden hemen önce SR Buprenorfin (0.20-0.5 mg/kg) deri altı (SC) enjekte edin. Ameliyattan sonra ameliyat edilen hayvanları izleyin.
8. Ameliyat sonrası 2, 8 ve 16 haftalık bir _CO2 odası kullanarak hayvanları ötenazi. Bilinçsizlikten sonra, hayvanların ölümünü fiziksel bir yöntemle doğrulayın (göğüs boşluğunu açmak). Bu ötanazi yöntemleri, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (AVMA) Ötanazi Paneli'nin önerileriyle uyumludur.
9. DMM ameliyatından 2, 8 ve 16 hafta sonra ve Sham ameliyatından 2 ve 16 hafta sonra histolojik analizler için diz eklemlerini hasat ederek farklı derecelerde OA şiddeti veya SCB kalınlaşma derecelerine sahip fare diz eklemleri elde edin.

2. Doku bölümlerinin ve histolojik görüntülerin hazırlanması

1. Fare diz eklem dokusu örneklerini% 2 paraformaldehitte sabitlayın, % 25 formik asitte kireçten arındırın, parafin içine gömün ve hem medial hem de lateral bölmeleri incelemek için bölüm koronal olarak.
2. Diz örneklerini bir mikrotom kullanarak dizinin arka tarafından kesin ve tüm diz eklemi boyunca yaklaşık 40 doku kaydırağı elde etmek için 70-80 μm aralıklarla 5-μm kalınlığında doku bölümlerini toplayın. Mikrometre destekli bir tahmin, 1-6 slayt numaralarının uzak posteriordan, 11-18'in orta posteriordan, 23-30'un ön kısımdan ve 35-40'ın diz ekleminin uzak ön kısmından olduğunu göstermektedir. Ek lekeler için araya giren bölümleri atın veya toplayın.
3. Her beş slaytta kıkırdak hücrelerini ve matrisleri özel olarak tanımlamak için üreticinin talimatlarına göre Safranin-O ve hızlı yeşil lekeler gerçekleştirin. Daha önce açıklandığı gibi hücresel ve doku seviyelerinde diz eklemlerini incelemek için üreticinin talimatlarına göre Hematoksilin-Eosin boyama gerçekleştirin19,20,21,22.
4. Dijital kamera ile donatılmış bir mikroskopla histolojik görüntüler elde edin. Genel histopatolojik analiz ve histolojik OA derecelendirmesi daha önce açıklandığı gibi yapılmıştır15,19,20,21,22.

3. ImageJ yazılımı ile osteoartrit subkondral kemiğin nicel ölçümü

1. ImageJ yazılımını indirin ve ilgi çekici histolojik görüntüleri açın.
   1. Java 1.8.0_172 ile birlikte gelen ImageJ'i https://imagej.nih.gov/ij/'dan indirin.
   2. ImageJ programını açın. Şeritteki Dosya sekmesini tıklatın ve histolojik resmi açmak için Aç seçeneğini tıklatın.
   3. Dosya dizini adresini bulun, resim dosyasını seçin ve Aç'ı tıklatın.
2. ImageJ'i histolojik görüntülerdeki mikrometre ile kalibre edin.
   1. Mikrometrede bir uzunluk birimi çizmek için düz çizgi aracını kullanın ve > Analiz Et (sonra) Ölçeği ayarla'yı tıklatın. Bilinen mesafe ve Piksel en boy oranını 1 olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. ImageJ piksel uzunluğunu mikrometredeki birim uzunluğa dönüştürebilir.
   2. Ölçülen faktörü alana ayarlayın. Ölçümü Ayarla > Çözümle'yi tıklatın ve yeni pencerenin altındaki Alan ve Eşikle Sınırla kutusunu işaretleyin. Bu adım, ImageJ'yi seçili "Eşik" içindeki "Alan" parametresini ölçecek şekilde ayarlar.
3. Toplam subkondral kemik (SCB) ilgi alanını ölçün.
   1. SCB kortikal plakasını ve medial femoral kondyle (MFC) ve medial tibial platodaki (MTP) kortikal plakaya bitişik alttaki trabeküler kemiğin bir kısmını kapsayan Şekil 1A'nın turuncu kutularında gösterildiği gibi ilgi çekici SCB bölgesini (ROI) tanımlayın. Osteoartrit SCB kalınlaşma genellikle bu bölgelerde görülür. Belirli bir yatırım getirisinin tüm hayvanlar için aynı boyutta ölçüldüğünden emin olmak için incelenen tüm eklemler için her MFC veya MTP'de aynı şekil ve boyuta sahip SCB yatırım getirisini tanımlayın.
   2. ImageJ ana penceresinin altındaki Çokgen seçim aracını kullanarak toplam SCB ilgi alanının ana hatlarını çizin.
      NOT: Seçim araçları, sisteme ölçülen alanı sınırlamak için bir eşik verir.
   3. Toplam SCB alanını ölçün: Eşik seçildikten sonra > Ölçü analiz et'i tıklatın. Alan ölçümü içeren bir "Sonuçlar" penceresi açılacaktır.
4. Kemik iliği olmadan katı kemik içeren kemik madde bölgesini ölçün.
   1. Toplam SCB alanının dışındaki alanı dışlamak için Düzenle > Dışarıyı Temizle'yi tıklatın.
      NOT: Dışla seçeneği tıklatılanınca yalnızca toplam SCB alanı görünür. Toplam SCB alanının dışındaki resim siyaha döner. Bu adım, gözlemcilerin ilgi alanı içindeki kemik madde alanına odaklanmalarını sağlar.
   2. " Eşik Rengi" penceresini açmak için Görüntü > > Renk eşiğini Ayarla'yı tıklatın. Resmi özgün durumuna geri yüklemek için "Eşik Rengi" penceresinin altındaki Orijinal'i tıklatın. Kemik maddesi bölgesinde küçük bir kutu çizmek için 3.3.2 adımındaki seçim araçlarını kullanın. Kemik madde alanını tanımlamak için "Eşik Rengi" penceresinin altındaki Örnek seçeneğini tıklatın.
      NOT: "Eşik Rengi" penceresindeki "Örnek" seçeneği, ImageJ'in toplam SCB alanında kemik maddesi örnek alanıyla aynı pikselleri seçmesini sağlar. Seçilen kemik maddesi alanı kırmızıya dönecektir.
   3. Alan ölçümü eşiği oluşturmak için eşik renk dengesi penceresinin altındaki Seç'i tıklatın. ImageJ ana menüsünde > Ölçüyü Analiz Et'i tıklatıp kemik maddesi alanı ölçüm sonucu "Sonuçlar" penceresinde gösterilir.
   4. Toplam SCB alanı ve kemik maddesi alanının verilerini kaydedin.
5. Toplam SCB alanı içindeki kemik madde kalınlığını (^mm2/1,0 ^mm2) temsil eden kemik madde bölgesinin (^mm2) toplam SCB alanına (^mm2) oranını hesaplayın.
6. 6 diz ekleminin alana özgü SCB kalınlığını değerlendirmek için DMM kaynaklı OA'nın uzak posterior, orta posterior, orta ön ve uzak ön alanlarının histolojik bölümlerinin/görüntülerinin (3.1-3.5 adımlarında açıklandığı gibi) SCB kalınlığını ölçün (Şekil 1B).
   NOT: Bu, bu nicel ölçüm protokolünün güvenilirliğini doğrulayabilir, çünkü osteoartrit SCB değişikliklerinin kıkırdak lezyonları ile birlikte lokalize olduğu ve SCB kalınlaşma ile osteoartrit kıkırdak hasarının kemirgen diz eklemlerinin ağırlık taşıyan bölgelerinde (orta kısım) daha şiddetli olduğu ^{bilinmektedir14,15}. Bu nedenle, osteoartrit SCB kalınlaşmanın nicel ölçümü için orta bölümlerin kullanılması uygundur.

4. İstatistikler

1. SCB kalınlığının nicel ölçümünden ve görsel derecelendirmesinden elde edilen verileri kullanarak istatistiksel analizler gerçekleştirin. Pearson'ın korelasyon katsayısı analizleri ile gözlemciler arası değişkenliği ve tekrarlanabilirliği belirleyin.
2. Öğrenci'nin t-testlerini veya tek yönlü ANOVA'yı kullanarak çalışma grupları arasındaki farklılıkların önemini belirleyin ve ardından elektronik tablo yazılımı kullanarak geçici bir test (Tukey). 0,05'ten küçük bir p değerinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu düşünün.

Sonuçlar

Görsel tahmin derecelendirmesi ile ImageJ destekli nicel ölçüm arasında tekrarlanabilirlik karşılaştırması:
24 diz/hayvandan her dizinin orta bölümünden tanımlanan 48 ilgi bölgesinde (ROI) (24 MFC ve 24 MTP) SCB kalınlığı, literatürde açıklandığı gibi mevcut 0-3 görsel puanlama şeması kullanılarak üç bağımsız kişi tarafından puanlanmıştır15,23, burada 0 = normal (SCB kalınlaşması yok), 1 = hafif, 2 = o...

Tartışmalar

SCB kalınlaştırıcılığının ölçülmesi, OA şiddetinin histolojik değerlendirmelerinin önemli bir bileşenidir. Mevcut OA derecelendirme sistemlerinin çoğu esas olarak kıkırdak değişikliklerine odaklanmaktadır15,16,17. SCB kalınlaştırmasını hafif, orta ve şiddetli olarak kategorize eden yaygın olarak kullanılan bir murine osteoartrit SCB kalınlığı derecelendirme yöntemi büyük ölçüde özneldir ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS216
Eosin	Sigma-Aldrich	E4382
illustrator	Adobe	Not applicable