Misurazione quantitativa assistita da software dello spessore osseo subcondrale osteoartritico

Riepilogo

Questo articolo metodologico presenta un protocollo di misurazione quantitativa assistito da software per quantificare lo spessore osseo subcondrale istologico nelle articolazioni del ginocchio osteoartritico murino e nelle articolazioni normali del ginocchio come controlli. Questo protocollo è altamente sensibile all'ispessimento sottile ed è adatto per rilevare i primi cambiamenti osteoartritici dell'osso subcondrale.

Abstract

L'ispessimento osseo subcondrale e la sclerosi sono i principali segni distintivi dell'osteoartrite (OA), sia nei modelli animali che negli esseri umani. Attualmente, la gravità dell'ispessimento osseo subcondrale istologico è per lo più determinata da sistemi di classificazione semi-quantitativi basati sulla stima visiva. Questo articolo presenta un protocollo riproducibile e facilmente eseguibile per misurare quantitativamente lo spessore dell'osso subcondrale in un modello murino di OA del ginocchio indotto dalla destabilizzazione del menisco mediale (DMM). Questo protocollo utilizzava il software ImageJ per quantificare lo spessore dell'osso subcondrale su immagini istologiche dopo aver definito una regione di interesse nel condilo femorale mediale e nel plateau tibiale medico in cui l'ispessimento osseo subcondrale di solito si verifica nell'OA del ginocchio indotta da DMM. Le immagini istologiche delle articolazioni del ginocchio con una procedura fittizia sono state utilizzate come controlli. L'analisi statistica ha indicato che il sistema di misurazione quantitativa dell'osso subcondrale di recente sviluppo era altamente riproducibile con basse variabilità intra- e inter-osservatore. I risultati suggeriscono che il nuovo protocollo è più sensibile all'ispessimento osseo subcondrale sottile o lieve rispetto ai sistemi di classificazione visiva ampiamente utilizzati. Questo protocollo è adatto per rilevare cambiamenti osteoartritici subcondrali sia precoci che progressivi dell'osso subcondrale e per valutare l'efficacia in vivo dei trattamenti OA di concerto con la classificazione della cartilagine OA.

Introduzione

L'osteoartrite (OA), caratterizzata radiograficamente dal restringimento dello spazio articolare dovuto alla perdita di cartilagine articolare, osteofiti e sclerosi dell'osso subcondrale (SCB), è la forma più comune di ^artrite1,2. Sebbene il ruolo dell'osso peri-articolare nell'eziologia dell'OA non sia completamente compreso, la formazione di osteofiti e la sclerosi SCB sono generalmente ritenute i risultati del processo patologico piuttosto che fattori causali, ma i cambiamenti nell'architettura / forma ossea peri-articolare e nella biologia possono contribuire allo sviluppo e alla progressione di ^OA3,4 . Lo sviluppo di un sistema di classificazione OA accurato e facilmente eseguibile, compresa la misurazione SCB, è fondamentale per studi comparativi tra laboratori di ricerca e per valutare l'efficacia di agenti terapeutici progettati per prevenire o attenuare la progressione dell'OA.

SCB è costruito con una sottile piastra ossea a cupola e uno strato sottostante di osso trabecolare. La piastra SCB è la lamella corticale, che giace parallela e immediatamente sotto la cartilagine calcificata. Piccoli rami di vasi arteriosi e venosi, così come i nervi, penetrano attraverso i canali nella piastra SCB, comunicando tra la cartilagine calcificata e l'osso trabecolare. L'osso trabecolare subcondrale contiene vasi sanguigni, nervi sensoriali, midollo osseo ed è più poroso e metabolicamente attivo rispetto alla piastra SCB. Pertanto, SCB esercita funzioni di assorbimento degli urti e di supporto ed è anche importante per l'apporto di nutrienti della cartilagine e il metabolismo nelle articolazioni normali5,6,7,8.

L'ispessimento SCB (in istologia) e la sclerosi (in radiografia) sono i principali tratti distintivi dell'OA e delle aree di ricerca chiave della fisiopatologia dell'OA. La misurazione dell'ispessimento SCB è una componente importante delle valutazioni istologiche della gravità dell'OA. La microradiografia digitale precedentemente riportata per la misurazione della densità minerale SCB dei ^roditori9 e la misurazione quantitativa SCB basata sulla micro-computergrafia (micro-CT) in modelli di roditori di OA10,11,12,13 hanno migliorato la nostra comprensione della struttura SCB e il ruolo dei cambiamenti SCB nella fisiopatologia OA. L'area e lo spessore SCB sono stati inoltre quantificati con vetrini istologici utilizzando un sofisticato sistema informatico con specifico e costoso software di istomorfometria ^ossea14. Tuttavia, i sistemi di classificazione OA semi-quantitativi basati su stime visive, tra cui la classificazione di ispessimento SCB, sono attualmente più ampiamente utilizzati della micro-TC perché i sistemi di classificazione sono facili da usare, in particolare per lo screening di numerose immagini istologiche. Tuttavia, la maggior parte dei sistemi di classificazione OA esistenti si concentra principalmente sui cambiamenti della cartilagine15,16,17. Un metodo di classificazione dello spessore SCB osteoartritico ampiamente utilizzato che classifica l'ispessimento SCB come lieve, moderato e grave è in gran parte soggettivo e la sua affidabilità non è stata completamente ^{convalidata15}. Un protocollo di misurazione dello spessore SCB osteoartritico passo-passo affidabile e facilmente eseguibile non è completamente sviluppato o non standardizzato.

Questo studio mirava a sviluppare un protocollo riproducibile, sensibile e facilmente eseguibile per misurare quantitativamente lo spessore SCB in un modello murino di OA. I nostri rigorosi test di misurazione e analisi statistica hanno dimostrato che questo protocollo di misurazione quantitativa assistito dal software ImageJ potrebbe quantificare lo spessore SCB nelle articolazioni del ginocchio sia normali che osteoartritiche. Il protocollo di nuova concezione è riproducibile e più sensibile ai lievi cambiamenti SCB rispetto ai sistemi di classificazione visiva ampiamente utilizzati. Può essere utilizzato per rilevare i primi cambiamenti osteoartritici dell'SCB e per valutare l'efficacia in vivo dei trattamenti OA di concerto con la classificazione della cartilagine OA.

Protocollo

Tutte le procedure animali incluse in questo protocollo sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'University of Kansas Medical Center, in conformità con tutte le leggi e i regolamenti federali e statali.

1. Creazione di OA del ginocchio nei topi

1. Creare un modello murino di OA del ginocchio mediante destabilizzazione chirurgica del menisco mediale (DMM) come descritto da Glasson et ^al.18 in 22 topi BALB/c wild-type a 10-11 settimane di età. Eseguire un intervento chirurgico fittizio come procedura di controllo su otto topi con lo stesso background ed età.
   NOTA: Entrambi i sessi sono stati utilizzati per il progetto originale per soddisfare il requisito NIH per considerare il sesso come variabile biologica, sebbene l'esame della differenza di sesso non sia lo scopo di questo protocollo.
2. Anestetizzare gli animali per inalazione di isoflurano. Controllare la profondità dell'anestesia monitorando la frequenza respiratoria / sforzo e la mancanza di risposta al pizzico di punta / coda. Metti gli animali in posizione supina.
3. Radere la pelle nella zona del ginocchio e pulire la pelle con Povidone-Iodio + scrub cutaneo alcolico; tre cicli alternati.
4. Eseguire la procedura DMM sul ginocchio destro al microscopio chirurgico. Esporre l'articolazione del ginocchio attraverso un'incisione parapatellare mediale (1,2-1,5 cm di lunghezza) e incidere la capsula articolare. Mantenere intatti la rotula e il tendine rotuleo. Dopo un'attenta esposizione del legamento meniscotibiale mediale (MML) che ancorano il menisco mediale al plateau tibiale, transettarlo con forbici microchirurgiche per destabilizzare il menisco mediale.
5. Eseguire un intervento chirurgico fittizio sul ginocchio destro come procedura di controllo, in cui l'MML è stato visualizzato ma non transettato.
6. Chiudere la capsula articolare con 8-0 suture di poliglactina assorbibili e incisione cutanea con 7-0 suture non riassorbibili per entrambe le procedure DMM e sham per assicurare un uso corretto del ginocchio una volta avvenuta la guarigione.
7. Iniettare SR Buprenorfina (0,20-0,5 mg/kg) per via sottocutanea (SC) immediatamente prima della procedura chirurgica per l'analgesia, che fornisce sollievo dal dolore fino a 72 ore dopo una singola iniezione. Monitorare gli animali operati dopo l'intervento chirurgico.
8. Eutanasia degli animali utilizzando una camera a _CO2 a 2, 8 e 16 settimane dopo l'intervento chirurgico. Dopo l'incoscienza, confermare la morte degli animali con un metodo fisico (apertura della cavità toracica). Questi metodi di eutanasia sono coerenti con le raccomandazioni del gruppo di esperti scientifici sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association (AVMA).
9. Raccogliere le articolazioni del ginocchio per le analisi istologiche a 2, 8 e 16 settimane dopo l'intervento chirurgico DMM e a 2 e 16 settimane dopo l'intervento chirurgico Sham per ottenere articolazioni del ginocchio del topo con diversi gradi di gravità OA o ispessimento SCB.

2. Preparazione di sezioni tissutali e immagini istologiche

1. Fissare i campioni di tessuto dell'articolazione del ginocchio del topo in paraformaldeide al 2%, decalcificarli in acido formico al 25%, incorporarli nella paraffina e sezionare coronalmente per esaminare sia i compartimenti mediali che laterali.
2. Tagliare i campioni di ginocchio dal lato posteriore del ginocchio usando un microtomo e raccogliere sezioni di tessuto che hanno uno spessore di 5 μm a intervalli di 70-80 μm per ottenere circa 40 vetrini di tessuto attraverso l'intera articolazione del ginocchio. Una stima assistita da micromemometri suggerisce che i numeri di diapositiva 1-6 provengono dall'estremo posteriore, 11-18 dalla parte medio-posteriore, 23-30 dalla parte medio-anteriore e 35-40 dalla porzione anteriore dell'articolazione del ginocchio. Scartare o raccogliere le sezioni intermedie per ulteriori macchie.
3. Eseguire Safranin-O e macchie verdi veloci secondo le istruzioni del produttore per identificare in modo specifico le cellule e le matrici della cartilagine su ogni cinque diapositive. Eseguire la colorazione Di ematossilina-Eosina secondo le istruzioni del produttore per esaminare le articolazioni del ginocchio a livello cellulare e tissutale come descritto in precedenza19,20,21,22.
4. Acquisire immagini istologiche con un microscopio dotato di fotocamera digitale. L'analisi istopatologica generale e la classificazione istologica dell'OA sono state condotte come descritto in precedenza15,19,20,21,22.

3. Misurazione quantitativa dell'osso subcondrale osteoartritico con il software ImageJ

1. Scarica il software ImageJ e apri le immagini istologiche di interesse.
   1. Scarica ImageJ in bundle con Java 1.8.0_172 da https://imagej.nih.gov/ij/.
   2. Aprire il programma ImageJ. Fare clic sulla scheda File sulla barra multifunzione e fare clic sull'opzione Apri per aprire l'immagine istologica.
   3. Individuare l'indirizzo della directory del file, selezionare il file di immagine e fare clic su Apri.
2. Calibrare ImageJ con il micrometro sulle immagini istologiche.
   1. Utilizzate lo strumento linea retta per tracciare un'unità di lunghezza sul micrometro e fate clic su Analizza > (quindi) Imposta scala (Set scale). Impostate la distanza nota e le proporzioni pixel su 1 e fate clic su OK. ImageJ può convertire la lunghezza dei pixel nella lunghezza dell'unità sul micrometro.
   2. Impostare il fattore misurato su area. Fare clic su Analizza > casella Imposta misurazione e seleziona Area e Limita alla soglia nella nuova finestra. Questo passaggio imposta ImageJ per misurare il parametro "Area" all'interno della "Soglia" selezionata.
3. Misurare l'area di interesse dell'osso subcondrale totale (SCB).
   1. Definire la regione di interesse SCB (ROI) come mostrato nelle caselle arancioni della Figura 1A, che copre la piastra corticale SCB e una porzione dell'osso trabecolare sottostante adiacente alla piastra corticale nel condilo femorale mediale (MFC) e nel plateau tibiale mediale (MTP) con dimensioni specifiche per ciascun ROI. L'ispessimento SCB osteoartritico di solito si verifica in queste aree. Definire il ROI SCB con la stessa forma e dimensione in ogni MFC o MTP per tutti i giunti esaminati per garantire che la stessa dimensione del ROI specifico sia stata misurata per tutti gli animali.
   2. Tracciate il contorno dell'area SCB totale di interesse utilizzando lo strumento di selezione Poligono sotto la finestra principale di ImageJ.
      NOTA: gli strumenti di selezione forniscono al sistema una soglia per limitare l'area misurata.
   3. Misurare l'area SCB totale: dopo aver selezionato la soglia, fare clic su Analizza > Misura. Si aprirà una finestra "Risultati" con la misurazione dell'area.
4. Misurare l'area della sostanza ossea contenente osso solido senza midollo osseo.
   1. Fate clic su Modifica (Edit) > Cancella (Clear Outside) per escludere l'area esterna dell'area SCB totale.
      NOTA: solo l'area SCB totale è visibile dopo aver fatto clic sull'opzione Cancella esterno . L'immagine al di fuori dell'area SCB totale diventerà nera. Questo passaggio consente agli osservatori di concentrarsi sull'area della sostanza ossea all'interno dell'area di interesse.
   2. Fai clic su Immagine > Regola > soglia colore per aprire la finestra "Colore soglia". Fare clic su Originale nella parte inferiore della finestra "Colore soglia" per ripristinare l'immagine allo stato originale. Utilizzare gli strumenti di selezione nel passaggio 3.3.2 per disegnare una piccola scatola nella regione della sostanza ossea. Fare clic sull'opzione Campione nella parte inferiore della finestra "Colore soglia" per definire l'area della sostanza ossea.
      NOTA: l'opzione "Campione" nella finestra "Colore soglia" consente a ImageJ di selezionare tutti gli stessi pixel sull'area SCB totale dell'area del campione di sostanza ossea. L'area della sostanza ossea selezionata diventerà rossa.
   3. Fare clic su Seleziona nella parte inferiore della finestra di bilanciamento del colore della soglia per creare una soglia di misurazione dell'area. Fare clic su Analizza > Misura nel menu principale di ImageJ e il risultato della misurazione dell'area della sostanza ossea verrà visualizzato nella finestra "Risultati".
   4. Salvare i dati dell'area SCB totale e dell'area della sostanza ossea.
5. Calcolare il rapporto tra l'area della sostanza ossea (^mm2) e l'area SCB totale (^mm2) di interesse che rappresenta lo spessore della sostanza ossea (^mm2/1,0 ^mm2) all'interno dell'area SCB totale.
6. Misurare lo spessore SCB delle sezioni/immagini istologiche (come descritto nei passaggi 3.1-3.5) delle aree extra-posteriori, medio-posteriori, medio-anteriori e molto anteriori (come descritto nel passaggio 2.2) dell'OA indotta da DMM per valutare lo spessore SCB area-specifico di 6 articolazioni del ginocchio (Figura 1B).
   NOTA: Questo può convalidare l'affidabilità di questo protocollo di misurazione quantitativa perché è noto che i cambiamenti osteoartritici SCB co-localizzano con lesioni cartilaginee e che il danno alla cartilagine osteoartritica con ispessimento SCB è più grave nelle aree portanti (porzione centrale) delle articolazioni del ginocchio dei ^{roditori14,15}. Pertanto, è opportuno utilizzare sezioni intermedie per la misurazione quantitativa dell'ispessimento SCB osteoartritico.

4. Statistiche

1. Eseguire analisi statistiche utilizzando i dati della misurazione quantitativa e della classificazione visiva dello spessore SCB. Determinare la variabilità e la riproducibilità tra e intra-osservatore mediante le analisi dei coefficienti di correlazione di Pearson.
2. Determinare il significato delle differenze tra i gruppi di studio utilizzando i t-test dello studente o ANOVA unidirezionale, seguiti da un test post-hoc (Tukey) utilizzando un software per fogli di calcolo. Si consideri un valore p inferiore a 0,05 statisticamente significativo.

Risultati

Confronto di riproducibilità tra la classificazione della stima visiva e la misurazione quantitativa assistita da ImageJ:
Lo spessore SCB in 48 regioni di interesse (ROI) (24 MFC e 24 MTP), definito da una sezione centrale di ciascun ginocchio da 24 ginocchia/ animali, è stato valutato da tre individui indipendenti utilizzando lo schema di punteggio visivo 0-3 esistente come descritto in ^{letteratura15,23}, dove 0 = normale (nessun ispessiment...

Discussione

La misurazione dell'ispessimento SCB è una componente importante delle valutazioni istologiche della gravità dell'OA. La maggior parte dei sistemi di classificazione OA esistenti si concentra principalmente sui cambiamenti della cartilagine15,16,17. Un metodo di classificazione dello spessore SCB osteoartritico murino ampiamente utilizzato che classifica l'ispessimento SCB come lieve, moderato e grave è in gran parte soggetti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS216
Eosin	Sigma-Aldrich	E4382
illustrator	Adobe	Not applicable