Mesure quantitative assistée par logiciel de l’épaisseur osseuse sous-chondrale ostéoarthritique

Résumé

Cet article méthodologique présente un protocole de mesure quantitative assisté par logiciel pour quantifier l’épaisseur osseuse sous-chondrale histologique dans les articulations du genou arthrosiques murines et les articulations normales du genou comme témoins. Ce protocole est très sensible à l’épaississement subtil et convient à la détection précoce des changements osseux sous-chondriques ostéoarthritiques.

Résumé

L’épaississement des os sous-chondraux et la sclérose sont les principales caractéristiques de l’arthrose (OA), à la fois chez les modèles animaux et chez l’homme. Actuellement, la gravité de l’épaississement histologique de l’os sous-chondral est principalement déterminée par des systèmes de classement semi-quantitatifs basés sur l’estimation visuelle. Cet article présente un protocole reproductible et facile à exécuter pour mesurer quantitativement l’épaisseur osseuse sous-chondrale dans un modèle murin d’arthrose du genou induite par la déstabilisation du ménisque médian (DMM). Ce protocole a utilisé le logiciel ImageJ pour quantifier l’épaisseur osseuse sous-chondrale sur des images histologiques après avoir défini une région d’intérêt dans le condyle fémoral médian et le plateau tibial médical où l’épaississement osseux sous-chondral se produit généralement dans l’arthrose du genou induite par la DMM. Des images histologiques des articulations du genou avec une procédure simulée ont été utilisées comme témoins. L’analyse statistique a indiqué que le nouveau système de mesure quantitative de l’os sous-chondral était hautement reproductible avec de faibles variabilités intra- et inter-observateurs. Les résultats suggèrent que le nouveau protocole est plus sensible à l’épaississement osseux sous-chondral subtil ou léger que les systèmes de classement visuel largement utilisés. Ce protocole est adapté pour détecter les changements osseux sous-chondrals ostéoarthritiques précoces et progressifs et pour évaluer l’efficacité in vivo des traitements de l’arthrose de concert avec le classement du cartilage de l’arthrose.

Introduction

L’arthrose (OA), caractérisée radiographiquement par un rétrécissement de l’espace articulaire dû à la perte de cartilage articulaire, d’ostéophytes et de sclérose osseuse sous-chondrale (SCB), est la forme la plus courante d’arthrite1,2. Bien que le rôle de l’os péri-articulaire dans l’étiologie de l’arthrose ne soit pas entièrement compris, la formation d’ostéophytes et la sclérose en SCB sont généralement considérées comme les résultats du processus de la maladie plutôt que des facteurs causaux, mais les changements dans l’architecture/la forme et la biologie des os péri-articulaires peuvent contribuer au développement et à la progression de ^l’ARTH3,4 . Le développement d’un système de classement de l’arthrose précis et facile à exécuter, y compris la mesure de l’ARTH, est essentiel pour les études comparatives entre laboratoires de recherche et pour évaluer l’efficacité des agents thérapeutiques conçus pour prévenir ou atténuer la progression de l’arthrose.

SCB est construit avec une fine plaque osseuse en forme de dôme et une couche sous-jacente d’os trabéculaire. La plaque SCB est la lamelle corticale, située parallèlement et immédiatement sous le cartilage calcifié. De petites branches des vaisseaux artériels et veineux, ainsi que des nerfs, pénètrent par les canaux de la plaque SCB, communiquant entre le cartilage calcifié et l’os trabéculaire. L’os trabéculaire sous-chondral contient des vaisseaux sanguins, des nerfs sensoriels, de la moelle osseuse et est plus poreux et métaboliquement actif que la plaque SCB. Par conséquent, le SCB exerce des fonctions d’absorption et de soutien des chocs et est également important pour l’apport en nutriments du cartilage et le métabolisme dans les articulations ^{normales5,6,7,8}.

L’épaississement du SCB (en histologie) et la sclérose (en radiographie) sont les principales caractéristiques de l’arthrose et des domaines de recherche clés de la physiopathologie de l’arthrose. La mesure de l’épaississement du SCB est un élément important des évaluations histologiques de la gravité de l’arthrose. La microradiographie numérique précédemment rapportée pour mesurer la densité minérale SCB des ^rongeurs9 ainsi que la mesure quantitative SCB basée sur la micro-tomodensitométrie (micro-CT) dans les modèles de rongeurs d’OA10,11,12,13 ont amélioré notre compréhension de la structure SCB et du rôle des changements SCB dans la physiopathologie de l’ARTH. La surface et l’épaisseur du SCB ont également été quantifiées à l’aide de lames histologiques à l’aide d’un système informatique sophistiqué doté d’un logiciel d’histomorphométrie osseuse spécifique et ^coûteux14. Néanmoins, les systèmes de classement semi-quantitatif de l’arthrose basés sur l’estimation visuelle, y compris le classement d’épaississement SCB, sont plus largement utilisés que la micro-tomodensitométrie à l’heure actuelle parce que les systèmes de classement sont faciles à utiliser, en particulier pour le criblage de nombreuses images histologiques. Cependant, la plupart des systèmes existants de classement de l’arthrose se concentrent principalement sur les changements du ^{cartilage15,16,17}. Une méthode de gradation de l’épaisseur SCB ostéoarthritique largement utilisée qui catégorise l’épaississement SCB comme léger, modéré et sévère est largement subjective, et sa fiabilité n’a pas été entièrement ^validée15. Un protocole de mesure d’épaisseur SCB ostéoarthritique fiable et facile à exécuter étape par étape n’est pas entièrement développé ou non normalisé.

Cette étude visait à développer un protocole reproductible, sensible et facile à exécuter pour mesurer quantitativement l’épaisseur du SCB dans un modèle murin d’arthrose. Nos tests de mesure rigoureux et nos analyses statistiques ont démontré que ce protocole de mesure quantitative assisté par logiciel ImageJ pouvait quantifier l’épaisseur du SCB dans les articulations normales et arthrosiques du genou. Le protocole nouvellement développé est reproductible et plus sensible aux changements légers de SCB que les systèmes de notation visuelle largement utilisés. Il peut être utilisé pour détecter les changements précoces de SCB ostéoarthritique et pour évaluer l’efficacité in vivo des traitements de l’arthrose de concert avec le classement du cartilage de l’arthrose.

Protocole

Toutes les procédures animales incluses dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre médical de l’Université du Kansas, conformément à toutes les lois et réglementations fédérales et étatiques.

1. Création d’arthrose du genou chez la souris

1. Créer un modèle murin d’arthrose du genou par déstabilisation chirurgicale du ménisque médian (DMM) tel que décrit par Glasson et ^al.18 chez 22 souris BALB/c de type sauvage à l’âge de 10 à 11 semaines. Effectuez une chirurgie simulée comme procédure de contrôle sur huit souris ayant le même arrière-plan et le même âge.
   NOTE: Les deux sexes ont été utilisés pour le projet initial afin de répondre à l’exigence des NIH pour la prise en compte du sexe en tant que variable biologique, bien que l’examen de la différence entre les sexes ne soit pas la portée de ce protocole.
2. Anesthésier les animaux par inhalation d’isoflurane. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en surveillant leur fréquence respiratoire / effort et leur manque de réponse au pincement de l’orteil / de la queue. Mettez les animaux en position couchée.
3. Raser la peau dans la région du genou et nettoyer la peau avec Povidone-Iode + gommage cutané à l’alcool; trois cycles alternés.
4. Effectuez la procédure DMM sur le genou droit sous un microscope chirurgical. Exposez l’articulation du genou à travers une incision parapatellaire médiale (1,2-1,5 cm de longueur) et incisez la capsule articulaire. Gardez la rotule et le tendon rotulien intacts. Après une exposition minutieuse du ligament méniscoptibial médian (LMM) qui ancre le ménisque médian au plateau tibial, transectez-le avec des ciseaux micro-chirurgicaux pour déstabiliser le ménisque médial.
5. Effectuez une chirurgie simulée sur le genou droit comme procédure de contrôle, dans laquelle la LMM a été visualisée mais non transectée.
6. Fermez la capsule articulaire avec 8-0 sutures de polyglactine résorbables et incision cutanée avec sutures non résorbables 7-0 pour les procédures DMM et sham afin d’assurer une utilisation correcte du genou une fois la guérison effectuée.
7. Injecter la BUprénorphine SR (0,20-0,5 mg / kg) par voie sous-cutanée (SC) immédiatement avant l’intervention chirurgicale pour l’analgésie, ce qui soulage la douleur jusqu’à 72 h après une seule injection. Surveiller les animaux opérés après la chirurgie.
8. Euthanasier les animaux à l’aide d’une chambre à _CO2 2, 8 et 16 semaines après la chirurgie. Après l’inconscience, confirmez la mort des animaux par une méthode physique (ouverture de la cavité thoracique). Ces méthodes d’euthanasie sont conformes aux recommandations du groupe scientifique sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association (AVMA).
9. Récoltez les articulations du genou pour des analyses histologiques à 2, 8 et 16 semaines après la chirurgie DMM et à 2 et 16 semaines après la chirurgie Sham pour obtenir des articulations du genou de souris avec différents degrés de gravité OA ou d’épaississement SCB.

2. Préparation de coupes tissulaires et d’images histologiques

1. Fixez des échantillons de tissu articulaire du genou de souris dans du paraformaldéhyde à 2%, décalcifiez-les dans de l’acide formique à 25%, incorporez-les dans de la paraffine et coupez coronalement pour examiner les compartiments médial et latéral.
2. Coupez des échantillons de genou du côté postérieur du genou à l’aide d’un microtome et prélevez des coupes de tissu de 5 μm d’épaisseur à des intervalles de 70 à 80 μm pour obtenir environ 40 lames de tissu sur l’ensemble de l’articulation du genou. Une estimation assistée par micromètre suggère que les numéros de diapositive 1 à 6 proviennent de l’extrême postérieur, 11 à 18 du milieu postérieur, 23 à 30 du milieu antérieur et 35 à 40 de la partie postérieure de l’articulation du genou. Jetez ou collectez les sections intermédiaires pour détecter d’autres taches.
3. Effectuez des taches safranin-O et des taches vertes rapides selon les instructions du fabricant pour identifier spécifiquement les cellules et les matrices cartilagineuses sur cinq lames. Effectuer la coloration de l’hématoxyline-éosine conformément aux instructions du fabricant pour examiner les articulations du genou aux niveaux cellulaire et tissulaire comme décrit précédemment19,20,21,22.
4. Acquérir des images histologiques avec un microscope équipé d’un appareil photo numérique. L’analyse histopathologique générale et le classement histologique de l’arthrose ont été effectués comme décrit précédemment15,19,20,21,22.

3. Mesure quantitative de l’os sous-chondral ostéoarthritique avec le logiciel ImageJ

1. Téléchargez le logiciel ImageJ et ouvrez les images histologiques d’intérêt.
   1. Téléchargez l’ImageJ fourni avec Java 1.8.0_172 à partir de https://imagej.nih.gov/ij/.
   2. Ouvrez le programme ImageJ. Cliquez sur l’onglet Fichier du ruban et cliquez sur l’option Ouvrir pour ouvrir l’image histologique.
   3. Recherchez l’adresse du répertoire de fichiers, sélectionnez le fichier image, puis cliquez sur Ouvrir.
2. Calibrer ImageJ avec le micromètre sur les images histologiques.
   1. Utilisez l’outil En ligne droite pour esquisser une unité de longueur sur le micromètre et cliquez sur Analyser > (puis) Définir l’échelle. Définissez la distance connue et le rapport L/H en pixels sur 1, puis cliquez sur OK. ImageJ peut convertir la longueur du pixel en longueur unitaire sur le micromètre.
   2. Définissez le facteur mesuré sur la surface. Cliquez sur Analyser > Définir la mesure et cochez la case Zone et Limite au seuil sous la nouvelle fenêtre. Cette étape permet à ImageJ de mesurer le paramètre « Area » dans le « Threshold » sélectionné.
3. Mesurer la zone d’intérêt de l’os sous-chondral total (SCB).
   1. Définissez la région d’intérêt (ROI) SCB comme indiqué dans les cases orange de la figure 1A, qui couvre la plaque corticale SCB et une partie de l’os trabéculaire sous-jacent adjacente à la plaque corticale dans le condyle fémoral médian (MFC) et le plateau tibial médian (MTP) avec des dimensions spécifiques pour chaque retour sur investissement. L’épaississement ostéoarthritique du SCB se produit généralement dans ces zones. Définissez le roi SCB avec la même forme et la même dimension dans chaque MFC ou MTP pour toutes les articulations examinées afin de s’assurer que la même taille du retour sur investissement spécifique a été mesurée pour tous les animaux.
   2. Esquissez le contour de la zone d’intérêt totale du SCB à l’aide de l’outil de sélection Polygone sous la fenêtre principale d’ImageJ.
      REMARQUE: Les outils de sélection donnent au système un seuil pour limiter la zone mesurée.
   3. Mesurer la surface totale du SCB : une fois le seuil sélectionné, cliquez sur Analyser > Mesure. Une fenêtre « Résultats » avec mesure de surface s’ouvrira.
4. Mesurez la zone de la substance osseuse contenant de l’os solide sans moelle osseuse.
   1. Cliquez sur Modifier > Effacer à l’extérieur pour exclure la zone en dehors de la zone SCB totale.
      REMARQUE: Seule la zone SCB totale est visible après avoir cliqué sur l’option Effacer l’extérieur . L’image à l’extérieur de la zone totale du SCB deviendra noire. Cette étape permet aux observateurs de se concentrer sur la zone de la substance osseuse dans la zone d’intérêt.
   2. Cliquez sur Image > Ajuster > seuil de couleur pour ouvrir la fenêtre « Couleur de seuil ». Cliquez sur Original en bas de la fenêtre « Couleur de seuil » pour restaurer l’image à l’état d’origine. Utilisez les outils de sélection de l’étape 3.3.2 pour dessiner une petite boîte dans la région de la substance osseuse. Cliquez sur l’option Échantillon en bas de la fenêtre « Couleur du seuil » pour définir la zone de la substance osseuse.
      REMARQUE: L’option « Échantillon » dans la fenêtre « Couleur de seuil » permet à ImageJ de sélectionner tous les mêmes pixels sur la zone totale SCB que la zone d’échantillon de substance osseuse. La zone de substance osseuse sélectionnée deviendra rouge.
   3. Cliquez sur Sélectionner en bas de la fenêtre de balance des couleurs du seuil pour créer un seuil de mesure de surface. Cliquez sur Analyser > mesure dans le menu principal d’ImageJ, et le résultat de la mesure de la zone de la substance osseuse s’affichera dans la fenêtre « Résultats ».
   4. Enregistrez les données de la zone totale de SCB et de la zone de substance osseuse.
5. Calculer le rapport entre la surface de la substance osseuse (^mm2) et la surface totale du SCB (^mm2) d’intérêt, qui représente l’épaisseur de la substance osseuse (^mm2/1,0 ^mm2) dans la surface totale du SCB.
6. Mesurer l’épaisseur SCB des sections/images histologiques (telles que décrites aux étapes 3.1 à 3.5) des zones extrêmement postérieures, mi-postérieures, mi-antérieures et antérieures (comme décrit à l’étape 2.2) de l’arthrose induite par le DMM pour évaluer l’épaisseur SCB spécifique à la zone de 6 articulations du genou (Figure 1B).
   REMARQUE: Cela peut valider la fiabilité de ce protocole de mesure quantitative car on sait que les changements ostéoarthritiques SCB co-localisent avec les lésions cartilagineuses et que les lésions du cartilage arthrosique avec épaississement SCB sont plus graves dans les zones de poids (partie médiane) des articulations du genou des ^{rongeurs14,15}. Par conséquent, il convient d’utiliser des sections médianes pour la mesure quantitative de l’épaississement ostéoarthritique du SCB.

4. Statistiques

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de données de mesure quantitative et de calibrage visuel de l’épaisseur SCB. Déterminer la variabilité et la reproductibilité entre et intra-observateurs par les analyses de coefficient de corrélation de Pearson.
2. Déterminez l’importance des différences entre les groupes d’étude à l’aide des tests t de Student ou de l’ANOVA unidirectionnelle, suivis d’un test post-hoc (Tukey) à l’aide d’un tableur. Considérez qu’une valeur de p inférieure à 0,05 est statistiquement significative.

Résultats

Comparaison de reproductibilité entre l’étalonnage d’estimation visuelle et la mesure quantitative assistée par ImageJ :
L’épaisseur du SCB dans 48 régions d’intérêt (ROI) (24 MFC et 24 MTP), définie à partir d’une section médiane de chaque genou à partir de 24 genoux / animaux, a été notée par trois individus indépendants en utilisant le schéma de notation visuelle 0-3 existant tel que décrit dans la ^{littérature15,23}

Discussion

La mesure de l’épaississement du SCB est un élément important des évaluations histologiques de la gravité de l’arthrose. La plupart des systèmes existants de classement de l’arthrose se concentrent principalement sur les changements du ^{cartilage15,16,17}. Une méthode de gradation de l’épaisseur SCB ostéoarthritique murine largement utilisée qui catégorise l’épaississement SCB comme léger, modéré et sévè...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS216
Eosin	Sigma-Aldrich	E4382
illustrator	Adobe	Not applicable