Çeşitli Bakterilerin Migrasyonunun ve Biyofilm Oluşumunun Ölçülmesi

Özet

Burada, konak içindeki mikroorganizmaların izolasyonu ve tanımlanması için pratik bir yöntem sunuyoruz. Bu şekilde, mikroorganizmaların fizikokimyasal özellikleri ve konakta olası yaşam biçimleri açıkça tanımlanmaktadır.

Özet

Konakçı vücutta gelişen mikroplar öncelikle hayatta kalmalarını kolaylaştıran uyarlanabilir yeteneklere sahip olduklarından, doğalarını sınıflandırma ve tanımlama yöntemleri, karakterizasyonlarını kolaylaştırmada faydalı olacaktır. Şu anda, çoğu çalışma yalnızca belirli bir karakterizasyon yöntemine odaklanmaktadır; Bununla birlikte, mikroorganizmaların konakçıdan izolasyonu ve tanımlanması sürekli bir süreçtir ve genellikle birkaç kombinatoryal karakterizasyon yöntemi gerektirir. Burada, mikrobiyal biyofilm oluşturma yeteneğini, mikrobiyal solunum durumunu ve kemotaksis davranışlarını belirleme yöntemlerini açıklıyoruz. Yöntemler, üçü Sprague-Dawley (SD) sıçanlarının kemik dokusundan (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus ve Enterococcus faecalis) ve ikisi Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve Enterococcus faecalis'ten izole edilen beş mikrobu tanımlamak için kullanılır V583 (İngilizce). SD sıçan kemik dokusundan izole edilen mikroplar, gram pozitif mikropları içerir. Bu mikroplar, kemik matrisi içindeki stresli ve besin sınırlayıcı ortamlarda gelişmeye adapte olmuşlardır. Bu makale, okuyuculara laboratuvar ortamında izole edilen mikropların doğasını ve davranışını belirleme konusunda özel bilgi birikimi sağlamayı amaçlamaktadır.

Giriş

İnsan vücudu tarafından temsil edilen memeli konakçı, çok sayıda mikroorganizma içerir. Bu mikroorganizmalar, konakçının ağzında, sindirim sisteminde, bağırsağında ve kanında yaygın olarak bulunur ve konakçının sağlığı üzerinde farklı etkilere sahiptir. Ağız boşluğu, konakçının enfeksiyonlara karşı duyarlılığını değiştirebilen çok sayıda mikroba ev sahipliği yapar. Streptokok (örneğin, S. mitis / oralis, S. pseudopneumoniae ve S. infantis) ve Prevotella spp. ağız boşluğunu kolonize ederek dil yüzeyinde çok türlü bir biyofilm oluşturur ve ağız kokusuna neden olur ve mikrobiyal enfeksiyon için mikrobiyal bir rezervuar olarak işlev görür. Bu patojenler, diş kökünü çene kemiğinde tutan periodontal ligamentlere sızarak çene kemiğini enfekte edebilir¹. Konakçı vücuttan izole edilen bu mikropların karakterizasyonu, özellikle mikroplar özel tedavi ve büyüme koşulları gerektiren bireysel özellikler sergilediğinde, genellikle sıkıcı bir süreçtir. Patojenik Helicobacter pylori, Clostridium difficile ve Fusobacterium nucleatum gibi mikroplar, bağırsağın zorlu ortamında, spesifik oksijen, besin ve büyüme gereksinimleriyle gelişir ve karakterizasyon süreçlerinde, özellikle de bu mikropların patojenitesinin araştırılmasında bir zorluk teşkil eder. Bu nedenle, bilim adamlarının ve tıp pratisyenlerinin yeni tıbbi tedaviler geliştirmeleri için bu mikroorganizmaları izole etmek ve araştırmak için standart bir yönteme ihtiyaç vardır.

Bu protokol, sıçanların kemik matrisinde gelişen mikropları kullanır. Geleneksel olarak, dişlerin varlığının kemik matrisini diğer kemiklere göre enfeksiyona daha duyarlı hale getirdiği çene tarafından temsil edilen kemik sistemi hariç¹, genellikle konakçının sağlıklı kemiğinin steril bir ortam olduğuna inanılmaktadır. Bununla birlikte, çalışmalar, mikroorganizmaların bağırsak duvarı yoluyla sistemik dolaşıma girdiğini ve sonuçta kemik mineralizasyonunu etkilediğini bulmuştur². Bir kavram kanıtı olarak, sağlıklı SD sıçanların (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. ve Enterococcus faecalis) uyluk kemiği ve tibiasından mikrobiyal izolatların biyokimyasal özelliklerini karakterize etmek için açıklanan protokolü kullanıyoruz. Bu mikrobiyal izolatlar, kemiğin kapalı ve hipoksik bir ortam olması ve bu mikropları kemikten karakterize etmenin zorlu bir görev olabileceği için seçilmiştir. Çeşitli makaleler, bu mikropların incelenmesinde kullanılan süreçleri detaylandırmıştır; Bununla birlikte, konak tarafından izole edilen mikroorganizmaları tanımlamak için tam bir protokol sağlayan çok az şey vardır.

Uygun kültür koşullarının oluşturulmasında, mikrobun oksijen gereksinimlerinin Sıvı Tiyoglikolat Ortamı (FTM) kullanılarak anlaşılması gerekir. Farklı oksijen gereksinimlerine sahip mikroplar, berrak FTM sıvısında^tabakalı katmanlar oluşturur 3. Tabakalaşma profiline dayanarak, mikrobun oksijen ihtiyacı daha sonra hücrelerin büyümesini araştırmak için kullanılır. FTM sıvısının yüzeyinde gelişen mikroplar zorunlu aeroblardır, oysa altta büyüyen mikroplar zorunlu anaeroblardır. FTM sıvısında süspansiyon olarak büyüyen mikroplar ya fakültatif ya da aerotolerant anaeroblardır. Mikrobiyal büyüme hızı, mikrobiyal hücrelerin üstel büyüme fazını gözlemleyerek belirlenir. Büyüme profili daha sonra mikrobun biyofilm oluşumu ile karşılaştırılır. Biyofilmler büyük ölçüde birbirlerinin sağlığını doğrudan ve dolaylı olarak etkileyen birden fazla türden oluşur. Bu süreç sırasında, mikrobiyal topluluklar arasındaki faydalı etkileşimler, aktif karşılıklı etkileşimlerin evrimini destekleyen mekansal bir yapı sağlayarak bağlanmayı seçer. Örneğin, Paenibacillus amylolyticus ve Xanthomonas retroflexus'un ko-kültürü, statik bir ortamda fakültatif simbiyotik etkileşimler sergileyerek hızlı biyofilm büyümesini teşvik eder¹³. Mikroplar, sürekli lokalizasyon için biyofilm oluşumu yoluyla konakçı dokulara adapte olurlar, kendilerini zorlu ortamlara karşı korurlar ve konakçının bağışıklık sisteminden kaçarlar 4,5,6,7. Biyofilmler genellikle mikroorganizmaların dış kritik altı uyaranlara direnmesine yardımcı olan yoğun ve çok katmanlı yapılardır; örneğin, diş pulpasındaki E. faecalis, tetrasiklin ve vankomisin⁸ alt konsantrasyonları ile karşı karşıya kaldığında biyofilm oluşumunu artırarak antibiyotiklere karşı direncini arttırır.

Kemotaksis, mikroorganizmaların kimyasal gradyanlara göre hareket etmesini sağlar ve sinyal yolları, çeşitli patojenik bakterilerde yaygın olarak dağıtılır. Bazı patojenik mikroorganizmalar, bulaşıcı hastalıklara neden olmak için kimyasal sinyallerin rehberliğinde belirli bölgelere göç eder¹⁴. Örneğin, Xanthomonas spp. konakta 19 kemoreseptör ve 11 flagellin proteinini eksprese eder, bakteriyel bağlanmayı ve nihayetinde ülserasyonu^{tetikler 15}. Bakterilerde ayrıca bakterilerin besinlere spesifik göçünü yönlendiren ve daha iyi büyümeye yol açabilen spesifik proteinler (pektin bağlayıcı proteinler) vardır¹⁶. Bu aynı zamanda besin açısından fakir ortamlarda bulunabilecek bakteriler için de kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal hücreler, hücresel canlılığa zarar veren diğer yırtıcı hücrelerden ve toksinlerden kaçarken, kendilerini elverişli bir büyüme ortamına çekmek için genellikle kemotaktik motiliteye güvenirler. Kemotaksisi belirlemek için önceden belirlenmiş yumuşak agar yaklaşımlarına dayanarak, mikrobiyal kemotaksisi test etmek için bir kemoatraksant gradyanı oluşturmak için yayılabilir bir yöntem geliştiriyoruz.

Bu makale, örnek olarak Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 ve Enterococcus faecalis V583 kullanılarak bakterilerin büyüme koşullarını, biyofilm oluşumunu ve kimyasal tropizmini belirleme yöntemlerini açıklamaktadır (bkz. Şekil 1). Mikrobiyal büyüme koşullarının optimizasyonu, mikrobun oksijen gereksinimlerini belirlemek için FTM'yi kullanırken, biyofilm oluşumu katı bir destek olarak cam yüzeyleri kullanır ve biyofilm kütlesi kristal viyole ile karşı boyanır. Mikrobun kimyasal tropizmi, 3D baskı yoluyla (Ek Şekil S1), yumuşak bir agar matrisinde kemoatraktan için kimyasal bir rezervuar oluşturmak için standartlaştırılmış bir yöntemin kullanıldığı kemotaktik davranışına dayanır (Ek Şekil S2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Kontaminasyonu önlemek için aseptik teknikler kullanın.

1. Tek bir koloni elde etmek için bakteri kazanımı

1. Katı agar plakaları hazırlayın.
   1. Her litre sıvı 11.8 g tripton, 23.6 g maya özütü, 9.4 g K₂HPO₄, 2.2 g KH₂PO₄ ve 15 g agar, pH = 7 içeren agar içeren Müthiş Et Suyu (TB) ortamı hazırlayın.
   2. Çözeltiyi 121 °C'de 20 dakika boyunca hava geçirgen bir kapak veya havalandırma deliği olan şişe sızdırmazlık filmi kullanarak otoklavlayın.
   3. Sıvı soğumadan ve katılaşmadan önce, agar içeren TB suyunu plaka başına 25 mL hacminde 10 cm'lik plastik Petri kaplarına dökün.
      NOT: Et suyu, 60 °C'den daha düşük sıcaklıklarda katılaşmadan önce tabağa dökülmelidir. Kontaminasyonu önlemek için aseptik teknikler kullanın.
2. Plakaya bakteri aşılaması
   1. -80 °C'de saklanan hedef suşları çıkarın ve oda sıcaklığında biyolojik bir güvenlik kabininde çözdürün.
   2. 10 μL'lik bir pipet kullanarak 10 μL bakteri süspansiyonu alın ve çizerek TB plakasına yayın.
   3. Kirlenmeyi önlemek için plakayı kapatın. Plakayı 37 °C'de bir biyokimyasal inkübatöre yerleştirin. ~ 24 saat sonra koloni büyümesini görsel olarak kontrol edin. Tek kolonileri seçin ve yalnızca bir tür bakteri içerdiklerini doğrulamak için bunları PCR ile çoğaltın.

2. Logaritmik büyüme fazına bakteriyel sıvı kültür

1. Sıvı kültür ortamı hazırlayın.
   1. Adım 1.1.1'deki katı agar plakalarının hazırlanmasına bakın. 1 L'si 11.8 g tripton, 23.6 g maya özütü, 9.4 g_K2HPO4ve 2.2 g KH₂PO₄, pH ~ 7 içeren TB sıvı ortamı hazırlamak için.
      NOT: Agar eklemeyin. Bakteriler sıvı besin ortamında daha hızlı büyür.
   2. Çözeltiyi 121 °C'de 20 dakika boyunca hava geçirgen bir kapak veya havalandırma deliği olan şişe sızdırmazlık filmi kullanarak otoklavlayın.
   3. Sıvı kültür ortamını 4 °C'de saklayın.
2. Bakteri aşılama ve yetiştirme
   1. Biyolojik güvenlik kabininde, bir aşılama halkası veya 10 μL'lik bir pipet ile tek bir koloni seçin ve bakterileri bir Erlenmeyer şişesinde hazırlanan TB sıvı ortamında aşılayın.
   2. Erlenmeyer şişesini gazlı bezle kapatın ve bakterileri yetiştirmek için 37 °C'de bir çalkalayıcıya (200 rpm) yerleştirin.
      NOT: Sıvı ortam 5 saat içinde kademeli olarak bulanıklaşır; Bulanık hale gelmek için geçen süre farklı bakterilere göre değişir.

3. FTM deneyi ve büyüme eğrisi belirleme

1. Sıvı Tiyoglikolat Ortamı (FTM) hazırlama
   1. Her litresi 15 g tripton, 5 g maya özütü, 5 g glikoz, 0.5 g L-sistein, 0.5 g sodyum tiyoglikolat, 2.5 g sodyum klorür, 0.001 g resazurin ve 0.75 g agar içeren Tiyolglikolat Ortamı (TM) hazırlayın.
      NOT: Ticari olarak temin edilebilen katı ortam, su ile kolayca sulandırılabilir ve sterilize edilebilir (Adım 3.1.2.).
   2. 29.3 g katı Tiyoglikolat Ortamı tartın, 1 L damıtılmış su ekleyin, ısıtın ve tamamen eriyene kadar ve çözelti pembeye dönene kadar karıştırın.
   3. Sızdırmazlık tapalı bir test tüpüne TM (19 mL) ekleyin. Mühürlemeden sonra, hava geçirgen bir kapak veya hava deliği olan şişe sızdırmazlık filmi kullanarak çözeltiyi 121 °C'de 20 dakika otoklavlayın.
      NOT: Isıtıldıktan sonra çözelti açık sarı olur.
2. Bakterilerin aşılanması, yetiştirilmesi ve gözlemlenmesi
   1. Bakteriyel süspansiyonu sıvı TB ortamında OD 0.6-0.8'e kadar büyüyecek şekilde hazırlayın (bkz. Adım 2.2.).
   2. Biyolojik güvenlik kabinindeki aseptik koşullar altında test tüpü sızdırmazlık tapasını açın, FTM içeren test tüpüne mümkün olan en kısa sürede 1 mL bakteri kültürü ekleyin ve test tüpünü hemen tekrar kapatın.
   3. Bakterilerin sıvı içinde homojen bir şekilde dağıldığından emin olmak için tüpü hafifçe çalkalayın ve statik kültür için test tüpünü 37 °C'ye yerleştirin.
   4. 48 saatlik inkübasyondan sonra, çeşitli test tüplerinde FTM'deki farklı bakterilerin büyümesini gözlemleyin ve fotoğraf çekin.
3. Aerobik koşullar altında büyüme eğrisinin belirlenmesi
   1. İlk bakteri kültürünü uygun bir OD değeri ile hazırlayın (bkz. Adım 2.2.) ve bakterileri logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar kültürleyin.
      NOT: Bu protokolde kullanılan Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 ve Enterococcus faecalis V583'ün log fazına ulaşması ~ 5 saat sürdü.
   2. Üç nüsha halinde 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna TB sıvı ortamında 200 μL bakteri kültürü (Adım 3.3.1'den itibaren) ekleyin. 600 nm'de OD değerini belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanın ve farklı bakteri kültürlerini, farklı bakteri içeren kuyucuklar ile TB sıvı ortamı (boş) arasındaki OD farkı 0.01 ile 0.02 arasında olacak şekilde seyreltin.
   3. 96 oyuklu yeni bir plaka alın, TB besiyeri ekleyin, Adım 3.3.2.'deki farklı seyreltilmiş bakteri kültürlerini üç nüsha halinde plakaya aktarın ve ultra temiz bir tezgah üzerine yerleştirin.
   4. 96 oyuklu plakayı sızdırmazlık bandı ile kapatın, mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve programı aşağıdaki gibi ayarlayın:
      1. Sıcaklığı 37 °C'ye ± 0,5'e ayarlayın.
      2. Kinetik Döngüyü, her biri 60 dakika olan toplam 30 döngüye ayarlayın.
      3. Absorbansı 600 nm'ye ayarlayın.
      4. Sallamayı bir döngüde 1,600 s'ye ayarlayın.
      5. Programı çalıştırın ve büyüme eğrisi platoları olduğunda durdurun.
4. Anaerobik koşullar altında büyüme eğrisinin belirlenmesi
   1. Adım 3.3'ü izleyin. ancak plakayı sızdırmazlık bandı ile kapatmadan önce 96 oyuklu plakayı TB ortamı ve bakteri süspansiyonları ile anaerobik bir inkübatörde tutun. Oksijen konsantrasyonunu %<3'e düşürmek için anaerobik kutuyu nitrojenle pompalayın ve doldurun. 96 oyuklu plakayı sızdırmazlık bandı ile kapatın ve anaerobik kutuda bırakın.

4. Biyofilm oluşturma yeteneği testi

1. Bakterileri sıvı ortamda logaritmik büyüme fazına kültürleyin.
   1. Bakterileri TB sıvı ortamında aşılamak için Bölüm 2'ye bakın.
   2. Bakterileri gece boyunca 37 °C'de bir çalkalayıcıda büyütün ve bakteri kültürü ortamının OD_600'ünün 0,6 ile 0,8 arasında olduğundan emin olun.
2. Bakteri kültürünü bölün ve farklı koşullar altında yetiştirin.
   1. Bakteri kültürünün OD_600'ü 0.6 ile 0.8 arasında olduğunda, bu bakteri süspansiyonunun 10 mL'sini bir cam test tüpüne ekleyin.
   2. Her bakteri kültürünü iki gruba ayırın: aerobik ve anaerobik koşullar ve tüm işlemleri üç nüsha halinde gerçekleştirin.
      1. Aerobik grup için, bakteri süspansiyonunu içeren test tüpünü kalay folyo ile sarın ve sabit bir sıcaklıkta 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin.
      2. Anaerobik grup için, bakteri süspansiyonunu içeren tüpü kalay folyo ile sarın ve anaerobik bir inkübatöre aktarın. Anaerobik inkübatördeki kalay folyoyu çıkarın ve inkübatördeki oksijen konsantrasyonunu pompalayıp nitrojenle doldurarak %<3'e düşürün. Test tüpünü buzlu bir cam tıpa ile kapatın, kapattıktan sonra çıkarın ve 37 °C'de bir su banyosunda inkübe edin.
   3. Her 6 saatte bir, alttaki biyofilmin büyümesini gözlemlemek için iki grubun her birinden (aerobik / anaerobik) üç test tüpü alın ve Adım 4.3'ü takip ederek boyayın.
3. Bakteriyel süspansiyonu atın ve biyofilmi kurutun.
   1. Test tüplerini farklı zaman noktalarında çıkarın ve bakteri süspansiyonunun üst tabakasını dikkatlice aspire edin. Test tüpünün dibine yapışan beyaz biyofilmi gözlemleyin.
      NOT: Bakteriyel süspansiyonu aspire ederken biyofilmi bozmamaya dikkat edin.
   2. Test tüpünün duvarı boyunca dikkatlice 2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin, biyofilmde adsorbe edilen planktonik bakterileri yıkamak için hafifçe çalkalayın ve PBS tamponunu dikkatlice aspire edin.
   3. Altta biyofilm adsorbe edilmiş test tüpünü 30 dakika kuruması için fırına koyun.
4. Boy -ama
   1. Test tüplerini çıkarın, her test tüpüne 2 mL% 0.1 kristal viyole boyama solüsyonu ekleyin ve biyofilmleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boyayın.
   2. Kristal viyole boya çözeltisini dikkatlice aspire etmek için bir pipet kullanın. Kalan kristal viyole boya çözeltisini yıkamak için test tüpünün duvarı boyunca dikkatlice damıtılmış su ekleyin, eklenen damıtılmış su neredeyse renksiz hale gelene kadar 3x-5x tekrarlayın. Test tüpünün altındaki mor biyofilmi gözlemleyin.
   3. Test tüpünü tekrar kurutun.
5. Biyofilmi %95 etanol ile çözün ve biyofilm çözeltisinin OD_600'ünü ölçün.
   1. Kurutulmuş test tüpünü çıkarın, her test tüpüne 10 mL %95 etanol ekleyin ve kristal menekşenin etanol içinde tamamen çözündüğünden emin olmak için iyice çalkalayın.
   2. Oyuk başına 200 μL'lik bir hacimle, 96 oyuklu bir plakaya etanol içinde kristal viyole ekleyin ve emilimini 600 nm dalga boyunda ölçün.
      NOT: Beer-Lambert yasasına göre, absorbans, çözeltinin konsantrasyonu ile doğrusal olarak ilişkilidir, bu nedenle OD₆₀₀ değeri, farklı zamanlarda bakteri süspansiyonundaki biyofilm miktarını yansıtan kristal viyole konsantrasyonunu yansıtabilir.

5. Bakteriyel kemotaksis testi

1. Diferansiyel ötrofik agar plakaları hazırlayın.
   1. Her litresi 11.8 g tripton, 23.6 g maya özütü, 9.4_gK2HPO₄, 2.2 g KH₂PO₄ ve 5 g agar, pH ~ 7 içeren% 0.5 agar içeren yarım doz bir MH ortamı hazırlamak için Adım 1'e bakın.
   2. Her litresi 59 g tripton, 118 g maya özütü, 47 g K₂HPO₄, 11 g KH₂PO₄ ve 5 g agar, pH ~ 7 içeren% 0,5 agar içeren 5x TB ortamı hazırlamak için Adım 1'e bakın.
   3. Çözeltiyi 121 °C'de 20 dakika boyunca hava geçirgen bir kapak veya havalandırma deliği olan şişe sızdırmazlık filmi kullanarak otoklavlayın.
   4. Sıvı soğutulmadan ve katılaşmadan önce, plaka başına 25 mL yarım doz MH suyu (% 0.5 agar içerir) dökün, plakayı 3D baskılı bir kapakla örtün ve biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin. Soğuduktan sonra, yarı katı ortamdaki silindirik kuyuyu (1,4 cm çapında) gözlemlemek için kapağı çıkarın.
      NOT: Reçine malzemeli 3D baskılı kapak, yüksek sıcaklıkta buhar kullanılarak sterilize edilemez. Yüzey bakterilerini öldürmek için% 95 etanol ile püskürtülebilir ve daha sonra biyolojik bir güvenlik kabininde 30 dakika boyunca bir UV lambası ile ışınlanabilir. Kapağı çıkarırken, dikey yönde kuvvet uygulayın ve yarı katı agarın zarar görmesini önlemek için dikkatlice kaldırın.
   5. 5x TB suyu (% 0.5 Agar içeren) katılaşmadan önce, 5x TB suyunu yarı katı plakadaki kuyuya eklemek için bir pipet kullanın, et suyu ortamın yüzeyi ile aynı hizaya gelene kadar.
   6. Ötrofik cisimler içeren yarı katı bir agar plakası elde etmek için plakayı biyolojik bir güvenlik kabininde soğutun. Çevresel mikroorganizmalar tarafından plaka kontaminasyonunu önlemeye özen gösterin.
      NOT: Yarı katı ortam hala biraz akışkandır ve bu nedenle baş aşağı depolanmadan önce tamamen soğutulmalıdır.
2. Bakteri aşılaması, yetiştirme ve fotoğrafçılık
   1. Yarı katı kültür ortamının bulunduğu agar plakasını biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için UV ışınlaması altında ~ 30 dakika soğutun.
   2. ~ 0.6-0.8'lik bir OD'ye kültürlenmiş bakteri süspansiyonunun 4 μL'sini almak için 10 μL'lik bir pipet kullanın, pipet ucunu plastik Petri kaplarının ortasına yerleştirin ve bakteri süspansiyonunu pipetleyin.
   3. Bakteriyel süspansiyonun ortama emilmesi için 1 dakika bekleyin. Bakteriyel süspansiyon tamamen emildiğinde, plakayı üç nüsha halinde iki gruba (aerobik/anaerobik) bölün.
   4. Aerobik grubu sızdırmazlık bandı ile kapatın ve bu plakaları statik kültür için 37 ° C'lik bir biyokimyasal inkübatöre baş aşağı yerleştirin. Anaerobik grubu, Adım 4.2'de açıklandığı gibi anaerobik bir kutuya kapatın ve büyüme için plakaları 37 °C'de ters çevirin.
   5. Her 12 saatte bir (0 saat, 12 saat, 24 saat, 36 saat ve 48 saatte) bakterilerin yayılmasını ve göçünü kontrol edin ve plakanın görüntülerini almak için görüntüleme sistemini kullanın.
3. Bakteri göç mesafelerini hesaplamak için ImageJ yazılımını kullanın.
   1. Görüntüleme sistemi kullanılarak elde edilen görüntü dosyasını içe aktarın.
   2. Ölçek çubuğunu ayarlayın ve tüm görüntülere uygulayın.
      1. Görüntü çekerken bir cetvel ekleyin, bir çizgi parçası oluşturun, bir düz çizgi parçası seçin (örneğin, 1 cm ve ardından bu çizgi parçasının uzunluğunu 1 cm olarak ayarlayın) ve tahtanın uzunluğunu işaretleyin.
      2. Ölçeği Ayarla penceresini açın; Analiz Et'e tıklayın | Ölçeği ayarlayın.
      3. Gerçek uzunluğu Bilinen uzaklık ve Uzunluk birimi alanına yazın.
      4. Global'i kontrol edin.
      5. Orijinal görüntünün klasör adresini ve çıktı dosyası adresini girin.
   3. Toplulukları tek tek seçmek için düz çizgi aracını kullanın ve düz takım çizgisi, her iki tarafa uzanan bakteri kolonisinin sınırına uyana kadar toleransı ayarlayın.
   4. Koloninin merkezden her iki uca olan göç mesafesini ayrı ayrı ölçün ve Analiz Et | Ölçün.
   5. Tüm topluluklar ölçülene kadar 5.3.3-5.3.4 Adımlarını tekrarlayın ve daha fazla analiz için sonuçları bir .csv dosyasına kaydedin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu çalışma, konakçı mikrobiyomundan izole edilen mikropları karakterize etmek için alınan yaklaşımları açıklamaktadır (Şekil 1). Kavram kanıtı olarak, SD sıçan konakçısından (C. stationis, S. cohnii ve E. faecalis) üç mikrop izole edildi ve ticari olarak edinilmiş iki mikroorganizma (S. aureus ATCC 25923 ve E. faecalis V583) bu protokol kullanılarak test edildi. FTM kullanarak bireysel mi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Ardışık yöntemlerle beş bakteri türünü izole ettik ve tanımladık. Bakterilerin büyümesi minimum besin gereksinimlerine sahiptir: minimum ortam-yalnızca inorganik tuzlar, bir karbon kaynağı ve su içeren bir ortam. Deney grubundaki bakteriler MH solid plakalar üzerinde bulunmasına rağmen, bakterilerin kemotaksisini doğrulamak için yarım doz MH besiyeri kullandık ve iyi sonuçlar elde ettik. Bununla birlikte, minimum ortam kullanarak kontrol deneyleri de gerçekleşti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical/Solution
1% crystal violet dye solution	Solarbio	G1062	100 mL
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	Used to obtain semi-solid plates, 20 g
Centrifuge tube	Corning	430790	15 mL
Fluid thioglycollate medium	Kinghunt	K0001	29.3 g
Mueller Hinton II Broth medium	Solarbio	NO.11865	100 g
Petri dishes	Bkman	B-SLPYM90-15	Plastic Petri dishes, circular, 90 mm x 15 mm
Potassium Chloride	VETEC	WXBC4493V	0.2 g
Potassium Dihydrogen Phosphate	aladdin	04-11-7758	0.24 g
Sodium chloride	Macklin	S805275	8.0 g
Sodium phosphate dibasic	aladdin	7558-79-4	1.44 g
Terrific Broth medium	Solarbio	LA2520	200 g
Kits/ Equipment
Anaerobic incubator	Longyue
Biochemical incubator	Blue pard	LRH-70
Microplate reader	Spark
Tanon 5200multi imaging system	Tanon	5200CE
Thermostatic water bath	Jinghong	DK-S28