Misurazione della migrazione e della formazione di biofilm di vari batteri

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo pratico per l'isolamento e l'identificazione di microrganismi all'interno dell'ospite. In questo modo, vengono chiaramente descritte le proprietà fisico-chimiche dei microrganismi e i possibili modi di vivere nell'ospite.

Abstract

Poiché i microbi che prosperano nel corpo ospite hanno principalmente capacità adattative che facilitano la loro sopravvivenza, i metodi per classificare e identificare la loro natura sarebbero utili per facilitare la loro caratterizzazione. Attualmente, la maggior parte degli studi si concentra solo su un metodo di caratterizzazione specifico; Tuttavia, l'isolamento e l'identificazione di microrganismi dall'ospite è un processo continuo e di solito richiede diversi metodi di caratterizzazione combinatoria. In questo articolo, descriviamo i metodi per identificare la capacità microbica di formare biofilm, lo stato di respirazione microbica e il loro comportamento chemiotassico. I metodi sono stati utilizzati per identificare cinque microbi, tre dei quali sono stati isolati dal tessuto osseo di ratti Sprague-Dawley (SD) (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus ed Enterococcus faecalis) e due dall'American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923 ed Enterococcus faecalis V583. I microbi isolati dal tessuto osseo di ratto SD includono i microbi gram-positivi. Questi microbi si sono adattati a prosperare in ambienti stressanti e limitanti i nutrienti all'interno della matrice ossea. Questo articolo ha lo scopo di fornire ai lettori il know-how specifico per determinare la natura e il comportamento dei microbi isolati all'interno di un ambiente di laboratorio.

Introduzione

L'ospite mammifero rappresentato dal corpo umano contiene un gran numero di microrganismi. Questi microrganismi sono ampiamente distribuiti nella bocca, nel tratto digestivo, nell'intestino e nel sangue dell'ospite e hanno effetti diversi sulla salute dell'ospite. La cavità orale ospita una pletora di microbi in grado di modulare la suscettibilità dell'ospite alle infezioni. Microbi come gli streptococchi (ad esempio, S. mitis/oralis, S. pseudopneumoniae e S. infantis) e Prevotella spp. colonizzano la cavità orale, formando un biofilm multispecie sulla superficie della lingua causando l'alitosi e funzionando come serbatoio microbico per l'infezione microbica. Questi agenti patogeni possono infettare l'osso mascellare infiltrandosi nei legamenti parodontali che trattengono la radice del dente nell'osso mascellare¹. La caratterizzazione di questi microbi isolati dal corpo ospite è spesso un processo noioso, in particolare quando i microbi mostrano tratti individuali che richiedono un trattamento specifico e condizioni di crescita. I microbi, come il patogeno Helicobacter pylori, il Clostridium difficile e il Fusobacterium nucleatum, prosperano nell'ambiente ostile dell'intestino, con specifici requisiti di ossigeno, nutrienti e crescita, presentando una sfida nei processi di caratterizzazione, in particolare nello studio della patogenicità di questi microbi. Pertanto, è necessario un metodo standardizzato per isolare e studiare questi microrganismi affinché gli scienziati e i medici sviluppino nuovi trattamenti medici.

Questo protocollo utilizza microbi che prosperano nella matrice ossea dei ratti. Tradizionalmente, ad eccezione del sistema osseo rappresentato dalla mandibola, dove la presenza di denti rende la matrice ossea più suscettibile alle infezioni rispetto ad altre ossa¹, si ritiene generalmente che l'osso sano dell'ospite sia un ambiente sterile. Tuttavia, gli studi hanno scoperto che i microrganismi entrano nella circolazione sistemica attraverso la parete intestinale, influenzando in ultima analisi la mineralizzazione ossea². Come prova di concetto, utilizziamo il protocollo descritto per caratterizzare le proprietà biochimiche degli isolati microbici dal femore e dalla tibia di ratti SD sani (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. ed Enterococcus faecalis). Questi isolati microbici sono stati selezionati poiché l'osso è un ambiente chiuso e ipossico e caratterizzare questi microbi dall'osso può essere un compito impegnativo. Vari articoli hanno dettagliato i processi utilizzati nello studio di questi microbi; Tuttavia, sono pochi quelli che forniscono un protocollo completo per identificare i microrganismi isolati dall'ospite.

Nello stabilire le condizioni di coltura adeguate, i requisiti di ossigeno del microbo devono essere compresi attraverso l'uso del terreno di tioglicolato fluido (FTM). I microbi con diversi requisiti di ossigeno formano strati stratificati nel liquido FTM trasparente³. Sulla base del profilo di stratificazione, il fabbisogno di ossigeno del microbo viene quindi utilizzato per studiare la crescita delle cellule. I microbi che prosperano sulla superficie del liquido FTM sono aerobi obbligati, mentre i microbi che crescono sul fondo sono anaerobi obbligati. I microbi che crescono come sospensione nel liquido FTM sono anaerobi facoltativi o aerotolleranti. Il tasso di crescita microbica viene stabilito osservando la fase di crescita esponenziale delle cellule microbiche. Il profilo di crescita viene quindi confrontato con la formazione del biofilm del microbo. I biofilm sono in gran parte composti da più specie che influenzano direttamente e indirettamente la salute l'una dell'altra. Durante questo processo, le interazioni benefiche tra le comunità microbiche selezionano per l'attaccamento, fornendo una struttura spaziale che favorisce l'evoluzione delle interazioni reciproche attive. Ad esempio, la co-coltura di Paenibacillus amylolyticus e Xanthomonas retroflexus mostra interazioni simbiotiche facoltative in un ambiente statico, promuovendo una rapida crescita del biofilm¹³. I microbi si adattano ai tessuti dell'ospite attraverso la formazione di biofilm per una localizzazione sostenuta, proteggendosi dagli ambienti difficili ed eludendo il sistema immunitario dell'ospite 4,5,6,7. I biofilm sono solitamente strutture dense e multistrato che aiutano i microrganismi a resistere agli stimoli subcritici esterni; ad esempio, E. faecalis nella polpa dentale migliora la sua resistenza agli antibiotici aumentando la formazione di biofilm di fronte a sottoconcentrazioni di tetraciclina e vancomicina⁸.

La chemiotassi consente ai microrganismi di muoversi in base a gradienti chimici e le vie di segnalazione sono ampiamente distribuite in una varietà di batteri patogeni. Alcuni microrganismi patogeni migrano in siti specifici, sotto la guida di segnali chimici, per causare malattie infettive¹⁴. Ad esempio, Xanthomonas spp. esprimono 19 proteine chemocettrici e 11 flagelline nell'ospite, innescando il legame batterico e, infine, l'ulcerazione¹⁵. Ci sono anche proteine specifiche nei batteri (proteine leganti la pectina) che guidano la migrazione specifica dei batteri verso i nutrienti, che può portare a una migliore crescita¹⁶. Questo è fondamentale anche per i batteri che possono esistere in ambienti poveri di nutrienti. Le cellule microbiche spesso si affidano alla motilità chemiotattica per attirare se stesse in un ambiente di crescita favorevole, eludendo altre cellule predatorie e tossine che danneggiano la vitalità cellulare. Sulla base di approcci di agar morbido precedentemente stabiliti per determinare la chemiotassi, sviluppiamo un metodo diffusibile per generare un gradiente chemioattrattivo per testare la chemiotassi microbica.

Questo articolo descrive i metodi per determinare le condizioni di crescita, la formazione del biofilm e il tropismo chimico dei batteri, utilizzando come esempi Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 ed Enterococcus faecalis V583 (vedi Figura 1). L'ottimizzazione delle condizioni di crescita microbica utilizza l'FTM per determinare il fabbisogno di ossigeno del microbo, mentre la formazione del biofilm utilizza superfici di vetro come supporto solido e la massa del biofilm è controcolorata con cristallovioletto. Il tropismo chimico del microbo si basa sul suo comportamento chemiotattico, dove attraverso la stampa 3D (Figura supplementare S1), viene utilizzato un metodo standardizzato per generare un serbatoio chimico per il chemioattrattivo in una matrice di agar morbido (Figura supplementare S2).

Protocollo

NOTA: Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo. Utilizzare tecniche asettiche per evitare la contaminazione.

1. Recupero batterico per ottenere una singola colonia

1. Preparare piastre di agar solide.
   1. Preparare un terreno Terrific Broth (TB) contenente agar, con ogni litro di liquido contenente 11,8 g di triptone, 23,6 g di estratto di lievito, 9,4 g di K₂HPO₄, 2,2 g di KH₂PO₄ e 15 g di agar, pH = 7.
   2. Autoclavare la soluzione a 121 °C per 20 minuti utilizzando un tappo permeabile all'aria o una pellicola sigillante per flaconi con sfiato d'aria.
   3. Prima che il liquido si raffreddi e si solidifichi, versare il brodo TB contenente agar in piastre di Petri di plastica da 10 cm a un volume di 25 ml per piastra.
      NOTA: Il brodo deve essere versato nella piastra prima che si solidifichi a temperature inferiori a 60 °C. Utilizzare tecniche asettiche per prevenire la contaminazione.
2. Inoculazione batterica alla piastra
   1. Estrarre i ceppi bersaglio conservati a -80 °C e scongelarli a temperatura ambiente in una cabina di sicurezza biologica.
   2. Utilizzare una pipetta da 10 μl per prelevare 10 μl di sospensione batterica e distribuirla sulla piastra TB mediante strisciature.
   3. Sigillare la piastra per evitare contaminazioni. Porre la piastra in un incubatore biochimico a 37 °C. Controlla visivamente la crescita della colonia dopo ~24 ore. Scegli singole colonie e amplificale mediante PCR per confermare che contengono un solo tipo di batterio.

2. Da coltura batterica liquida a fase di crescita logaritmica

1. Preparare il terreno di coltura liquido.
   1. Fare riferimento alla preparazione di piastre di agar solide al punto 1.1.1. per preparare il terreno liquido TB, 1 L del quale contiene 11,8 g di triptone, 23,6 g di estratto di lievito, 9,4 g di K₂HPO₄ e 2,2 g di KH₂PO₄, pH ~7.
      NOTA: Non aggiungere agar. I batteri crescono più velocemente in un ambiente nutriente liquido.
   2. Autoclavare la soluzione a 121 °C per 20 minuti utilizzando un tappo permeabile all'aria o una pellicola sigillante per flaconi con sfiato d'aria.
   3. Conservare il terreno di coltura liquido a 4 °C.
2. Inoculazione e coltivazione batterica
   1. Nella cabina di sicurezza biologica, prelevare una singola colonia con un'ansa di inoculazione o una pipetta da 10 μl e inoculare i batteri nel terreno liquido preparato per la tubercolosi in un pallone di Erlenmeyer.
   2. Sigillare il pallone di Erlenmeyer con una garza e metterlo in uno shaker (200 giri/min) a 37 °C per coltivare i batteri.
      NOTA: Il mezzo liquido diventa gradualmente torbido nell'arco di 5 ore; Il tempo impiegato per diventare torbido varia a seconda dei diversi batteri.

3. Esperimento FTM e determinazione della curva di crescita

1. Preparazione del terreno fluido di tioglicolato (FTM)
   1. Preparare il Terreno di Tiolglicolato (TM), ogni litro del quale contiene 15 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di glucosio, 0,5 g di L-cisteina, 0,5 g di tioglicolato di sodio, 2,5 g di cloruro di sodio, 0,001 g di resazurina e 0,75 g di agar.
      NOTA: Il terreno solido disponibile in commercio può essere facilmente ricostituito con acqua e sterilizzato (Passaggio 3.1.2.).
   2. Pesare 29,3 g di Tioglicolato Solido Medium, aggiungere 1 L di acqua distillata, scaldare e mescolare fino a completa dissoluzione e fino a quando la soluzione diventa rosa.
   3. Aggiungere TM (19 mL) a una provetta con un tappo di chiusura. Dopo la sigillatura, sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 °C per 20 minuti utilizzando un tappo permeabile all'aria o una pellicola sigillante per flaconi con sfiato d'aria.
      NOTA: Dopo il riscaldamento, la soluzione diventa giallo chiaro.
2. Inoculazione, coltivazione e osservazione dei batteri
   1. Preparare la sospensione batterica in modo che cresca fino a OD 0,6-0,8 in terreno liquido per la TB (vedere il passaggio 2.2.).
   2. Aprire il tappo di chiusura della provetta in condizioni asettiche nella camera di sicurezza biologica, aggiungere 1 mL di coltura batterica alla provetta contenente FTM il prima possibile e sigillare immediatamente la provetta.
   3. Agitare delicatamente la provetta per assicurarsi che i batteri siano distribuiti in modo omogeneo nel liquido e posizionare la provetta a 37 °C per la coltura statica.
   4. Dopo 48 ore di incubazione, osservare la crescita di diversi batteri in FTM in varie provette e scattare fotografie.
3. Determinazione della curva di crescita in condizioni aerobiche
   1. Preparare la coltura batterica iniziale con un valore OD adeguato (vedere il passaggio 2.2.) e coltivare i batteri fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica.
      NOTA: Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 ed Enterococcus faecalis V583 utilizzati in questo protocollo hanno impiegato ~5 ore per raggiungere la fase logaritmica.
   2. Aggiungere 200 μl di coltura batterica (dalla fase 3.3.1) in terreno liquido TB a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti in triplicato. Utilizzare un lettore di micropiastre per determinare il valore OD a 600 nm e diluire le diverse colture batteriche in modo che la differenza OD tra i diversi pozzetti contenenti batteri e il mezzo liquido TB (bianco) sia compresa tra 0,01 e 0,02.
   3. Prendere una nuova piastra da 96 pozzetti, aggiungere il terreno per la tubercolosi, trasferire le diverse colture batteriche diluite dal passaggio 3.3.2., in triplice copiato, alla piastra e posizionarla su un banco di lavoro ultra-pulito.
   4. Sigillare la piastra a 96 pozzetti con del nastro sigillante, inserirla nel lettore di micropiastre e impostare il programma come segue:
      1. Impostare la temperatura a 37 °C ± 0,5.
      2. Imposta il Kinetic Loop su un totale di 60 cicli, ciascuno per 30 minuti.
      3. Impostare l'assorbanza a 600 nm.
      4. Impostare Agitazione a 1.600 s in un ciclo.
      5. Esegui il programma e interrompilo quando la curva di crescita si stabilizza.
4. Determinazione della curva di crescita in condizioni anaerobiche
   1. Seguire il passaggio 3.3. ma conservare la piastra a 96 pozzetti con il mezzo TB e le sospensioni batteriche in un incubatore anaerobico prima di sigillare la piastra con nastro sigillante. Pompare e riempire la scatola anaerobica con azoto per ridurre la concentrazione di ossigeno al <3%. Sigillare la piastra a 96 pozzetti con nastro sigillante e lasciarla nella scatola anaerobica.

4. Test di capacità di formazione del biofilm

1. Coltivare i batteri fino alla fase di crescita logaritmica in mezzo liquido.
   1. Fare riferimento alla Sezione 2 per inoculare i batteri nel mezzo liquido della TBC.
   2. Coltivare i batteri per una notte in uno shaker a 37 °C, assicurandosi che il diametro esterno₆₀₀ del terreno di coltura batterica sia compreso tra 0,6 e 0,8.
2. Dividi la coltura batterica e coltiva in condizioni diverse.
   1. Quando l'OD₆₀₀ della coltura batterica è compreso tra 0,6 e 0,8, aggiungere 10 ml di questa sospensione batterica in una provetta di vetro.
   2. Dividi ogni coltura batterica in due gruppi: condizioni aerobiche e anaerobiche ed esegui tutte le operazioni in triplice copia.
      1. Per il gruppo aerobico, avvolgere la provetta contenente la sospensione batterica con carta stagnola e incubarla in un bagno d'acqua a 37 °C a temperatura costante.
      2. Per il gruppo anaerobico, avvolgere la provetta contenente la sospensione batterica con carta stagnola e trasferirla in un incubatore anaerobico. Rimuovere la carta stagnola nell'incubatrice anaerobica e ridurre la concentrazione di ossigeno nell'incubatrice al <3% pompandola e riempiendola di azoto. Chiudere la provetta con un tappo di vetro smerigliato, estrarla dopo averla sigillata e incubarla a bagnomaria a 37 °C.
   3. Ogni 6 ore, prelevare tre provette da ciascuno dei due gruppi (aerobico/anaerobico) per osservare la crescita del biofilm sul fondo e colorare seguendo il passaggio 4.3.
3. Scartare la sospensione batterica e asciugare il biofilm.
   1. Estrarre le provette in momenti diversi e aspirare con cura lo strato superiore della sospensione batterica. Osservare il biofilm bianco che aderisce al fondo della provetta.
      NOTA: Fare attenzione a non disturbare il biofilm durante l'aspirazione della sospensione batterica.
   2. Aggiungere con cautela 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) lungo la parete della provetta, agitarla delicatamente per lavare via i batteri planctonici adsorbiti nel biofilm e aspirare con cura il tampone PBS.
   3. Mettere la provetta con il biofilm adsorbito sul fondo nel forno ad asciugare per 30 minuti.
4. Macchiatura
   1. Estrarre le provette, aggiungere 2 ml di soluzione colorante cristallovioletto allo 0,1% a ciascuna provetta e colorare i biofilm per 30 minuti a temperatura ambiente.
   2. Utilizzare una pipetta per aspirare con cura la soluzione di colorante cristallovioletto. Aggiungere con cura acqua distillata lungo la parete della provetta per lavare via la soluzione di colorante cristallovioletto rimanente, ripetendo 3x-5x fino a quando l'acqua distillata aggiunta non è diventata quasi incolore. Osservare il biofilm viola sul fondo della provetta.
   3. Asciugare nuovamente la provetta.
5. Sciogliere il biofilm con etanolo al 95% e misurare l'OD₆₀₀ della soluzione di biofilm.
   1. Estrarre la provetta essiccata, aggiungere 10 ml di etanolo al 95% a ciascuna provetta e agitare accuratamente per assicurarsi che il cristallovioletto sia completamente disciolto nell'etanolo.
   2. Con un volume di 200 μl per pozzetto, aggiungere il cristallovioletto in etanolo a una piastra a 96 pozzetti e misurarne l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 600 nm.
      NOTA: Secondo la legge di Beer-Lambert, l'assorbanza è linearmente correlata alla concentrazione della soluzione, quindi il valore di OD₆₀₀ può riflettere la concentrazione di cristallovioletto, che riflette la quantità di biofilm nella sospensione batterica in momenti diversi.

5. Test di chemiotassi batterica

1. Preparare piastre di agar eutrofiche differenziali.
   1. Fare riferimento al passaggio 1 per preparare un mezzo MH a mezza dose contenente lo 0,5% di agar, ogni litro del quale contiene 11,8 g di triptone, 23,6 g di estratto di lievito, 9,4 g di K₂HPO₄, 2,2 g di KH₂PO₄ e 5 g di agar, pH ~7.
   2. Fare riferimento al passaggio 1 per preparare 5 TB di terreno contenente lo 0,5% di agar, ogni litro dei quali contiene 59 g di triptone, 118 g di estratto di lievito, 47 g di K₂HPO₄, 11 g di KH₂PO₄ e 5 g di agar, pH ~7.
   3. Autoclavare la soluzione a 121 °C per 20 minuti utilizzando un tappo permeabile all'aria o una pellicola sigillante per flaconi con sfiato d'aria.
   4. Prima che il liquido si raffreddi e si solidifichi, versare 25 ml di brodo MH a metà dose (contenente lo 0,5% di agar) per piastra, coprire la piastra con un coperchio stampato in 3D e metterla in una cabina di sicurezza biologica. Dopo il raffreddamento, rimuovere il coperchio per osservare il pozzetto cilindrico (1,4 cm di diametro) nel mezzo semisolido.
      NOTA: Il coperchio stampato in 3D con materiale in resina non può essere sterilizzato utilizzando vapore ad alta temperatura. Per uccidere i batteri superficiali, può essere spruzzato con etanolo al 95% e poi irradiato con una lampada UV per 30 minuti in una cappa di sicurezza biologica. Quando si rimuove il coperchio, applicare forza in direzione verticale e sollevarlo con cautela per evitare danni all'agar semisolido.
   5. Prima che il brodo 5x TB (contenente lo 0,5% di Agar) si solidifichi, utilizzare una pipetta per aggiungere il brodo 5x TB al pozzetto della piastra semisolida fino a quando il brodo non è a filo con la superficie del terreno.
   6. Raffreddare la piastra in una cabina di sicurezza biologica per ottenere una piastra di agar semisolida contenente corpi eutrofici. Fare attenzione a evitare la contaminazione delle piastre da parte di microrganismi ambientali.
      NOTA: Il mezzo semisolido è ancora un po' fluido e, quindi, deve essere completamente raffreddato prima di essere conservato capovolto.
2. Inoculazione, coltivazione e fotografia batterica
   1. Posizionare la piastra di agar con il terreno di coltura semisolido in una cappa di sicurezza biologica e raffreddarla per ~30 minuti sotto irradiazione UV per prevenire la contaminazione batterica.
   2. Utilizzare una pipetta da 10 μl per prelevare 4 μl di sospensione batterica coltivata a un diametro esterno di ~0,6-0,8, inserire la punta della pipetta al centro delle piastre di Petri in plastica e pipettare la sospensione batterica.
   3. Attendere che la sospensione batterica venga assorbita nel terreno per 1 minuto. Quando la sospensione batterica è stata completamente assorbita, dividere la piastra in due gruppi (aerobico/anaerobico) in triplicato.
   4. Sigillare il gruppo aerobico con del nastro sigillante e posizionare le piastre capovolte in un incubatore biochimico a 37 °C per coltura statica. Sigillare il gruppo anaerobico in una scatola anaerobica come descritto al punto 4.2, capovolgendo le piastre a 37 °C per la crescita.
   5. Controllare la diffusione e la migrazione dei batteri ogni 12 ore (a 0 ore, 12 ore, 24 ore, 36 ore e 48 ore) e utilizzare il sistema di imaging per acquisire immagini della piastra.
3. Utilizza il software ImageJ per calcolare le distanze di migrazione batterica.
   1. Importare il file immagine acquisito utilizzando il sistema di imaging.
   2. Imposta la barra della scala e applicala a tutte le immagini.
      1. Quando si scattano immagini, aggiungere un righello, creare un segmento di linea, selezionare un segmento di linea retta (ad esempio, 1 cm, quindi impostare la lunghezza di questo segmento di linea su 1 cm) e contrassegnare la lunghezza della tavola.
      2. Aprire la finestra Imposta scala ; clicca su Analizza | Imposta scala.
      3. Digitare la lunghezza effettiva in Distanza nota e Unità di lunghezza.
      4. Controlla Globale.
      5. Immettere l'indirizzo della cartella dell'immagine originale e l'indirizzo del file di output.
   3. Utilizzare lo strumento linea retta per selezionare le comunità una per una e regolare la tolleranza fino a quando la linea retta dell'utensile non si adatta al confine della colonia batterica che si estende su entrambi i lati.
   4. Misura la distanza di migrazione della colonia dal centro a entrambe le estremità separatamente e ricava la lunghezza della linea retta facendo clic su Analizza | Misurare.
   5. Ripetere i passaggi 5.3.3-5.3.4 fino a quando tutte le comunità non sono state misurate e salvare i risultati in un file .csv per ulteriori analisi.

Risultati

Questo lavoro descrive gli approcci adottati per caratterizzare i microbi isolati dal microbioma ospite (Figura 1). Come prova di concetto, tre microbi sono stati isolati dall'ospite del ratto SD (C. stationis, S. cohnii ed E. faecalis) e due microrganismi acquisiti commercialmente (S. aureus ATCC 25923 ed E. faecalis V583) sono stati testati utilizzando questo protocollo. Per stabilire il fabbisogno di ossigeno d...

Discussione

Abbiamo isolato e identificato cinque specie di batteri con metodi sequenziali. La crescita dei batteri ha un fabbisogno minimo di nutrienti: il mezzo minimo è un terreno contenente solo sali inorganici, una fonte di carbonio e acqua. Sebbene i batteri nel gruppo sperimentale siano stati trovati su piastre solide MH, abbiamo utilizzato un mezzo MH a metà dose per verificare la chemiotassi dei batteri e abbiamo ottenuto buoni risultati. Tuttavia, abbiamo anche eseguito esperimenti di co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical/Solution
1% crystal violet dye solution	Solarbio	G1062	100 mL
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	Used to obtain semi-solid plates, 20 g
Centrifuge tube	Corning	430790	15 mL
Fluid thioglycollate medium	Kinghunt	K0001	29.3 g
Mueller Hinton II Broth medium	Solarbio	NO.11865	100 g
Petri dishes	Bkman	B-SLPYM90-15	Plastic Petri dishes, circular, 90 mm x 15 mm
Potassium Chloride	VETEC	WXBC4493V	0.2 g
Potassium Dihydrogen Phosphate	aladdin	04-11-7758	0.24 g
Sodium chloride	Macklin	S805275	8.0 g
Sodium phosphate dibasic	aladdin	7558-79-4	1.44 g
Terrific Broth medium	Solarbio	LA2520	200 g
Kits/ Equipment
Anaerobic incubator	Longyue
Biochemical incubator	Blue pard	LRH-70
Microplate reader	Spark
Tanon 5200multi imaging system	Tanon	5200CE
Thermostatic water bath	Jinghong	DK-S28