Medindo a migração e a formação de biofilme de várias bactérias

Resumo

Aqui, apresentamos um método prático para o isolamento e identificação de microrganismos dentro do hospedeiro. Desta forma, as propriedades físico-químicas dos microrganismos e possíveis formas de viver no hospedeiro são claramente descritas.

Resumo

Como os micróbios que prosperam no corpo hospedeiro têm principalmente habilidades adaptativas que facilitam sua sobrevivência, métodos para classificar e identificar sua natureza seriam benéficos para facilitar sua caracterização. Atualmente, a maioria dos estudos se concentra apenas em um método de caracterização específico; No entanto, o isolamento e identificação de microrganismos do hospedeiro é um processo contínuo e geralmente requer vários métodos de caracterização combinatória. Aqui, descrevemos métodos para identificar a capacidade de formação de biofilme microbiano, o estado de respiração microbiana e seu comportamento de quimiotaxia. Os métodos são usados para identificar cinco micróbios, três dos quais foram isolados do tecido ósseo de ratos Sprague-Dawley (SD) (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus e Enterococcus faecalis) e dois da American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Enterococcus faecalis V583. Os micróbios isolados do tecido ósseo do rato SD incluem os micróbios gram-positivos. Esses micróbios se adaptaram para prosperar em ambientes estressantes e limitantes de nutrientes dentro da matriz óssea. Este artigo tem como objetivo fornecer aos leitores o know-how específico para determinar a natureza e o comportamento dos micróbios isolados em um ambiente de laboratório.

Introdução

O hospedeiro mamífero representado pelo corpo humano contém um grande número de microrganismos. Esses microrganismos são amplamente distribuídos na boca, trato digestivo, intestino e sangue do hospedeiro e têm diferentes efeitos na saúde do hospedeiro. A cavidade oral hospeda uma infinidade de micróbios que podem modular a suscetibilidade do hospedeiro a infecções. Micróbios como Streptococcus (por exemplo, S. mitis/oralis, S. pseudopneumoniae e S. infantis) e Prevotella spp. colonizam a cavidade oral, formando um biofilme multiespécie na superfície da língua, causando mau hálito e funcionando como um reservatório microbiano para infecção microbiana. Esses patógenos podem infectar o maxilar infiltrando-se nos ligamentos periodontais que sustentam a raiz do dente no maxilar¹. A caracterização desses micróbios isolados do corpo hospedeiro costuma ser um processo tedioso, principalmente quando os micróbios exibem características individuais que requerem tratamento específico e condições de crescimento. Micróbios, como os patogênicos Helicobacter pylori, Clostridium difficile e Fusobacterium nucleatum, prosperam no ambiente hostil do intestino, com requisitos específicos de oxigênio, nutrientes e crescimento, apresentando um desafio nos processos de caracterização, particularmente na investigação da patogenicidade desses micróbios. Portanto, um método padronizado de isolamento e investigação desses microrganismos é necessário para que cientistas e médicos desenvolvam novos tratamentos médicos.

Este protocolo usa micróbios que prosperam na matriz óssea de ratos. Tradicionalmente, com exceção do sistema ósseo representado pela mandíbula, onde a presença de dentes torna a matriz óssea mais suscetível à infecção do que outros ossos¹, geralmente acredita-se que o osso saudável do hospedeiro seja um ambiente estéril. No entanto, estudos descobriram que os microrganismos entram na circulação sistêmica através da parede intestinal, afetando a mineralização óssea². Como prova de conceito, usamos o protocolo descrito para caracterizar as propriedades bioquímicas de isolados microbianos do fêmur e tíbia de ratos SD saudáveis (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. e Enterococcus faecalis). Esses isolados microbianos foram selecionados porque o osso é um ambiente fechado e hipóxico, e caracterizar esses micróbios do osso pode ser uma tarefa desafiadora. Vários artigos detalharam os processos usados no estudo desses micróbios; no entanto, são poucos os que fornecem um protocolo completo para identificar microrganismos isolados do hospedeiro.

Ao estabelecer as condições de cultura adequadas, as necessidades de oxigênio do micróbio precisam ser compreendidas por meio do uso de meio de tioglicolato fluido (FTM). Micróbios com diferentes necessidades de oxigênio formam camadas estratificadas no líquido FTM claro³. Com base no perfil de estratificação, a necessidade de oxigênio do micróbio é então usada para investigar o crescimento das células. Os micróbios que prosperam na superfície do líquido FTM são aeróbios obrigatórios, enquanto os micróbios que crescem na parte inferior são anaeróbios obrigatórios. Os micróbios que crescem como uma suspensão no líquido FTM são anaeróbios facultativos ou aerotolerantes. A taxa de crescimento microbiano é estabelecida pela observação da fase de crescimento exponencial das células microbianas. O perfil de crescimento é então comparado à formação de biofilme do micróbio. Os biofilmes são em grande parte compostos por várias espécies que afetam direta e indiretamente a saúde umas das outras. Durante esse processo, as interações benéficas entre as comunidades microbianas selecionam a fixação, fornecendo uma estrutura espacial que favorece a evolução das interações recíprocas ativas. Por exemplo, a co-cultura de Paenibacillus amylolyticus e Xanthomonas retroflexus exibe interações simbióticas facultativas em um ambiente estático, promovendo o rápido crescimento do biofilme¹³. Os micróbios se adaptam aos tecidos do hospedeiro por meio da formação de biofilme para localização sustentada, protegendo-se contra ambientes hostis e evitando o sistema imunológico do hospedeiro 4,5,6,7. Os biofilmes são geralmente estruturas densas e multicamadas que ajudam os microrganismos a resistir a estímulos subcríticos externos; por exemplo, E. faecalis na polpa dentária aumenta sua resistência a antibióticos, aumentando a formação de biofilme quando confrontado com subconcentrações de tetraciclina e vancomicina⁸.

A quimiotaxia permite que os microrganismos se movam de acordo com gradientes químicos, e as vias de sinalização são amplamente distribuídas em uma variedade de bactérias patogênicas. Alguns microrganismos patogênicos migram para locais específicos, sob a orientação de sinais químicos, para causar doenças infecciosas¹⁴. Por exemplo, Xanthomonas spp. expressam 19 proteínas quimiorreceptoras e 11 proteínas flagelinas no hospedeiro, desencadeando a ligação bacteriana e, por fim, a ulceração¹⁵. Existem também proteínas específicas nas bactérias (proteínas de ligação à pectina) que orientam a migração específica das bactérias para os nutrientes, o que pode levar a um melhor crescimento¹⁶. Isso também é crítico para bactérias que podem existir em ambientes pobres em nutrientes. As células microbianas geralmente dependem da motilidade quimiotática para se atrair para um ambiente propício ao crescimento, evitando outras células predadoras e toxinas que prejudicam a viabilidade celular. Com base em abordagens de ágar macio previamente estabelecidas para determinar a quimiotaxia, desenvolvemos um método difusível para gerar um gradiente de quimioatraente para testar a quimiotaxia microbiana.

Este artigo descreve os métodos para determinar as condições de crescimento, formação de biofilme e tropismo químico de bactérias, usando Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 e Enterococcus faecalis V583 como exemplos (ver Figura 1). A otimização das condições de crescimento microbiano usa FTM para determinar as necessidades de oxigênio do micróbio, enquanto a formação de biofilme usa superfícies de vidro como suporte sólido e a massa de biofilme é contracorada com cristal violeta. O tropismo químico do micróbio depende de seu comportamento quimiotático, onde através da impressão 3D (Figura Suplementar S1), um método padronizado é usado para gerar um reservatório químico para o quimioatraente em uma matriz de ágar macio (Figura Suplementar S2).

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Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos usados neste protocolo. Use técnicas assépticas para evitar contaminação.

1. Recuperação bacteriana para obter uma única colônia

1. Prepare placas de ágar sólidas.
   1. Prepare o meio Terrific Broth (TB) contendo ágar, com cada litro de líquido contendo 11,8 g de triptona, 23,6 g de extrato de levedura, 9,4 g de K₂HPO₄, 2,2 g de KH₂PO₄ e 15 g de ágar, pH = 7.
   2. Autoclave a solução a 121 °C durante 20 min utilizando uma cápsula permeável ao ar ou uma película de vedação do frasco com um respiradouro de ventilação.
   3. Antes que o líquido esfrie e solidifique, despeje o caldo TB contendo ágar em placas de Petri plásticas de 10 cm a um volume de 25 mL por placa.
      NOTA: O caldo deve ser despejado no prato antes de solidificar em temperaturas inferiores a 60 °C. Use técnicas assépticas para evitar contaminação.
2. Inoculação bacteriana na placa
   1. Retire as cepas alvo armazenadas a -80 °C e descongele-as à temperatura ambiente em uma cabine de segurança biológica.
   2. Use uma pipeta de 10 μL para absorver 10 μL de suspensão bacteriana e espalhe-a na placa de TB por estrias.
   3. Sele a placa para evitar contaminação. Colocar a placa numa incubadora bioquímica a 37 °C. Verifique o crescimento da colônia visualmente após ~ 24 h. Escolha colônias únicas e amplifique-as por PCR para confirmar que contêm apenas um tipo de bactéria.

2. Cultura líquida bacteriana até a fase de crescimento logarítmico

1. Prepare o meio de cultura líquido.
   1. Consulte a preparação de placas de ágar sólido na Etapa 1.1.1. para preparar o meio líquido TB, 1 L do qual contém 11,8 g de triptona, 23,6 g de extrato de levedura, 9,4 g de K₂HPO₄ e 2,2 g de KH₂PO₄, pH ~ 7.
      NOTA: Não adicione ágar. As bactérias crescem mais rápido em um ambiente de nutrientes líquidos.
   2. Autoclave a solução a 121 °C durante 20 min utilizando uma cápsula permeável ao ar ou uma película de vedação do frasco com um respiradouro de ventilação.
   3. Armazenar o meio de cultura líquido a 4 °C.
2. Inoculação e cultivo bacteriano
   1. Na cabine de segurança biológica, pegar uma única colônia com uma alça de inoculação ou uma pipeta de 10 μL e inocular as bactérias no meio líquido de TB preparado em um Erlenmeyer.
   2. Fechar o erlenmeyer com gaze e colocá-lo num agitador (200 rpm) a 37 °C para cultivar as bactérias.
      NOTA: O meio líquido torna-se gradualmente turvo ao longo de 5 h; O tempo necessário para se tornar turvo varia de acordo com as diferentes bactérias.

3. Experimento FTM e determinação da curva de crescimento

1. Preparação de meio de tioglicolato fluido (FTM)
   1. Prepare o meio de tiolglicolato (TM), cada litro contendo 15 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de glicose, 0,5 g de L-cisteína, 0,5 g de tioglicolato de sódio, 2,5 g de cloreto de sódio, 0,001 g de resazurina e 0,75 g de ágar.
      NOTA: O meio sólido disponível comercialmente pode ser facilmente reconstituído com água e esterilizado (Etapa 3.1.2.).
   2. Pesar 29,3 g de meio sólido de tioglicolato, adicionar 1 L de água destilada, aquecer e mexer até dissolver completamente e até que a solução fique rosa.
   3. Adicione TM (19 mL) a um tubo de ensaio com um tampão de vedação. Após a selagem, autoclave a solução a 121 °C durante 20 minutos utilizando uma cápsula permeável ao ar ou uma película de vedação de frascos com uma saída de ar.
      NOTA: Após o aquecimento, a solução torna-se amarelo claro.
2. Inoculação, cultivo e observação de bactérias
   1. Prepare a suspensão bacteriana para crescer até OD 0,6-0,8 em meio líquido TB (consulte a Etapa 2.2.).
   2. Abra o bujão de vedação do tubo de ensaio em condições assépticas no gabinete de segurança biológica, adicione 1 mL da cultura bacteriana ao tubo de ensaio contendo FTM o mais rápido possível e feche imediatamente o tubo de ensaio novamente.
   3. Agitar suavemente o tubo para se certificar de que as bactérias estão homogeneamente distribuídas no líquido e colocar o tubo de ensaio a 37 °C para cultura estática.
   4. Após 48 h de incubação, observe o crescimento de diferentes bactérias no FTM em vários tubos de ensaio e tire fotografias.
3. Determinação da curva de crescimento em condições aeróbias
   1. Preparar a cultura bacteriana inicial com um valor de DO adequado (ver Passo 2.2) e cultivar as bactérias até atingirem a fase de crescimento logarítmico.
      NOTA: Corynebacterium stationis, Staphylacoccus cohnii, Enterococcus faecalis, Staphylacoccus aureus ATCC 25923 e Enterococcus faecalis V583 usados neste protocolo levaram ~ 5 h para atingir a fase logarítmica.
   2. Adicione 200 μL da cultura bacteriana (da Etapa 3.3.1) em meio líquido TB a cada poço de uma placa de 96 poços em triplicata. Use um leitor de microplacas para determinar o valor de DO a 600 nm e dilua as diferentes culturas bacterianas de modo que a diferença de DO entre os diferentes poços contendo bactérias e o meio líquido TB (em branco) esteja entre 0,01 e 0,02.
   3. Pegue uma nova placa de 96 poços, adicione meio TB, transfira as diferentes culturas bacterianas diluídas da Etapa 3.3.2., em triplicata, para a placa e coloque-a em uma bancada ultralimpa.
   4. Sele a placa de 96 poços com fita de vedação, coloque-a no leitor de microplacas e defina o programa da seguinte forma:
      1. Defina a temperatura para 37 °C ± 0.5.
      2. Defina o Loop Cinético para um total de 60 ciclos, cada um por 30 min.
      3. Definir a absorvância para 600 nm.
      4. Defina Agitação para 1.600 s em um ciclo.
      5. Execute o programa e interrompa-o quando a curva de crescimento se estabilizar.
4. Determinação da curva de crescimento em condições anaeróbias
   1. Siga o Passo 3.3. mas mantenha a placa de 96 poços com o meio TB e as suspensões bacterianas em uma incubadora anaeróbica antes de selar a placa com fita adesiva. Bombeie e encha a caixa anaeróbica com nitrogênio para reduzir a concentração de oxigênio para <3%. Sele a placa de 96 poços com fita de vedação e deixe-a na caixa anaeróbica.

4. Teste de capacidade de formação de biofilme

1. Cultive a bactéria até a fase de crescimento logarítmico em meio líquido.
   1. Consulte a Seção 2 para inocular as bactérias no meio líquido TB.
   2. Cultive as bactérias durante a noite em um agitador a 37 °C, garantindo que o OD₆₀₀ do meio de cultura bacteriano esteja entre 0,6 e 0,8.
2. Divida a cultura bacteriana e cultive em diferentes condições.
   1. Quando o OD₆₀₀ da cultura bacteriana estiver entre 0,6 e 0,8, adicione 10 mL desta suspensão bacteriana a um tubo de ensaio de vidro.
   2. Divida cada cultura bacteriana em dois grupos: condições aeróbicas e anaeróbicas, e execute todas as operações em triplicata.
      1. Para o grupo aeróbio, envolver o tubo de ensaio que contém a suspensão bacteriana com folha de estanho e incubá-lo num banho-maria a 37 °C a temperatura constante.
      2. Para o grupo anaeróbico, enrole o tubo contendo a suspensão bacteriana com papel alumínio e transfira-o para uma incubadora anaeróbica. Remova a folha de estanho na incubadora anaeróbica e reduza a concentração de oxigênio na incubadora para <3%, bombeando-a e enchendo-a com nitrogênio. Feche o tubo de ensaio com uma rolha de vidro fosco, retire-o após a selagem e incube-o em banho-maria a 37 °C.
   3. A cada 6 h, pegue três tubos de ensaio de cada um dos dois grupos (aeróbio/anaeróbico) para observar o crescimento do biofilme na parte inferior e core seguindo a Etapa 4.3.
3. Descarte a suspensão bacteriana e seque o biofilme.
   1. Retire os tubos de ensaio em diferentes momentos e aspire cuidadosamente a camada superior da suspensão bacteriana. Observe o biofilme branco aderido ao fundo do tubo de ensaio.
      NOTA: Tome cuidado para não perturbar o biofilme ao aspirar a suspensão bacteriana.
   2. Adicione cuidadosamente 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ao longo da parede do tubo de ensaio, agite-o suavemente para lavar as bactérias planctônicas adsorvidas no biofilme e aspire cuidadosamente o tampão PBS.
   3. Coloque o tubo de ensaio com o biofilme adsorvido no fundo no forno para secar por 30 min.
4. Mancha
   1. Retire os tubos de ensaio, adicione 2 mL de solução de coloração violeta a 0,1% a cada tubo de ensaio e core os biofilmes por 30 min em temperatura ambiente.
   2. Use uma pipeta para aspirar cuidadosamente a solução de corante violeta cristalino. Adicione cuidadosamente água destilada ao longo da parede do tubo de ensaio para lavar a solução de corante violeta cristal restante, repetindo 3x-5x até que a água destilada adicionada se torne quase incolor. Observe o biofilme roxo na parte inferior do tubo de ensaio.
   3. Seque novamente o tubo de ensaio.
5. Dissolver o biofilme com etanol a 95% e medir a OD₆₀₀ da solução de biofilme.
   1. Retire o tubo de ensaio seco, adicione 10 mL de etanol a 95% a cada tubo de ensaio e agite bem para garantir que o cristal violeta esteja totalmente dissolvido no etanol.
   2. Com um volume de 200 μL por poço, adicione cristal violeta em etanol a uma placa de 96 poços e meça sua absorbância em um comprimento de onda de 600 nm.
      NOTA: De acordo com a lei de Beer-Lambert, a absorbância está linearmente relacionada à concentração da solução, de modo que o valor de OD₆₀₀ pode refletir a concentração de cristal violeta, que reflete a quantidade de biofilme na suspensão bacteriana em diferentes momentos.

5. Teste de quimiotaxia bacteriana

1. Preparar placas de ágar eutróficas diferenciais.
   1. Consulte a Etapa 1 para preparar um meio MH de meia dose contendo 0,5% de ágar, cada litro contendo 11,8 g de triptona, 23,6 g de extrato de levedura, 9,4 g de K₂HPO₄, 2,2 g de KH₂PO₄ e 5 g de ágar, pH ~ 7.
   2. Consulte a Etapa 1 para preparar 5x TB médio contendo 0.5% de ágar, cada litro contendo 59 g de triptona, 118 g de extrato de levedura, 47 g de K₂HPO₄, 11 g de KH₂PO₄ e 5 g de ágar, pH ~ 7.
   3. Autoclave a solução a 121 °C durante 20 min utilizando uma cápsula permeável ao ar ou uma película de vedação do frasco com um respiradouro de ventilação.
   4. Antes que o líquido seja resfriado e solidificado, despeje 25 mL de caldo MH de meia dose (contendo 0,5% de ágar) por prato, cubra o prato com uma tampa impressa em 3D e coloque-o em um armário de segurança biológica. Após o resfriamento, remova a tampa para observar o poço cilíndrico (1,4 cm de diâmetro) no meio semissólido.
      NOTA: A tampa impressa em 3D com material de resina não pode ser esterilizada com vapor de alta temperatura. Para matar as bactérias da superfície, ele pode ser pulverizado com etanol a 95% e depois irradiado com uma lâmpada UV por 30 minutos em um armário de segurança biológica. Ao remover a tampa, aplique força na direção vertical e levante-a com cuidado para evitar danos ao ágar semissólido.
   5. Antes que o caldo 5x TB (contendo 0,5% de ágar) solidifique, use uma pipeta para adicionar o caldo 5x TB ao poço na placa semissólida até que o caldo esteja nivelado com a superfície do meio.
   6. Resfrie a placa em um gabinete de segurança biológica para obter uma placa de ágar semissólida contendo corpos eutróficos. Tome cuidado para evitar a contaminação da placa por microrganismos ambientais.
      NOTA: O meio semissólido ainda é um pouco fluido e, portanto, deve ser totalmente resfriado antes de ser armazenado de cabeça para baixo.
2. Inoculação, cultivo e fotografia bacteriana
   1. Coloque a placa de ágar com o meio de cultura semissólido em um gabinete de segurança biológica e resfrie-a por ~ 30 min sob irradiação UV para evitar contaminação bacteriana.
   2. Use uma pipeta de 10 μL para absorver 4 μL da suspensão bacteriana cultivada a uma DO de ~0,6-0,8, insira a ponta da pipeta no centro das placas de Petri de plástico e pipete a suspensão bacteriana.
   3. Aguarde até que a suspensão bacteriana seja absorvida pelo meio por 1 min. Quando a suspensão bacteriana tiver sido totalmente absorvida, dividir a placa em dois grupos (aeróbio/anaeróbio) em triplicata.
   4. Selar o grupo aeróbio com fita de vedação e colocar essas placas de cabeça para baixo numa incubadora bioquímica a 37 °C para cultura estática. Selar o grupo anaeróbio numa caixa anaeróbia conforme descrito no passo 4.2, invertendo as placas a 37 °C para o crescimento.
   5. Verifique a propagação e migração de bactérias a cada 12 h (em 0 h, 12 h, 24 h, 36 h e 48 h) e use o sistema de imagem para tirar imagens da placa.
3. Use o software ImageJ para calcular as distâncias de migração bacteriana.
   1. Importe o arquivo de imagem adquirido usando o sistema de imagem.
   2. Defina a barra de escala e aplique-a a todas as imagens.
      1. Ao tirar fotos, adicione uma régua, crie um segmento de linha, selecione um segmento de linha reta (por exemplo, 1 cm e, em seguida, defina o comprimento desse segmento de linha para 1 cm) e marque o comprimento do quadro.
      2. Abra a janela Definir escala ; clique em Analisar | Definir escala.
      3. Digite o comprimento real em Distância conhecida e Unidade de comprimento.
      4. Verifique Global.
      5. Insira o endereço da pasta da imagem original e o endereço do arquivo de saída.
   3. Use a ferramenta de linha reta para selecionar as comunidades uma a uma e ajuste a tolerância até que a linha reta da ferramenta se ajuste ao limite da colônia bacteriana que se estende para ambos os lados.
   4. Meça a distância de migração da colônia do centro para ambas as extremidades separadamente e derive o comprimento da linha reta clicando em Analisar | Medir.
   5. Repita as etapas 5.3.3-5.3.4 até que todas as comunidades sejam medidas e salve os resultados em um arquivo .csv para análise posterior.

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Resultados

Este trabalho descreve as abordagens adotadas para caracterizar os micróbios isolados do microbioma hospedeiro (Figura 1). Como prova de conceito, três micróbios foram isolados do hospedeiro de ratos SD (C. stationis, S. cohnii e E. faecalis) e dois microrganismos adquiridos comercialmente (S. aureus ATCC 25923 e E. faecalis V583) foram testados usando este protocolo. Para estabelecer as necessidades de oxigên...

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Discussão

Isolamos e identificamos cinco espécies de bactérias por métodos sequenciais. O crescimento de bactérias tem necessidades mínimas de nutrientes: o meio mínimo - um meio contendo apenas sais inorgânicos, uma fonte de carbono e água. Embora as bactérias do grupo experimental tenham sido encontradas em placas sólidas de MH, usamos meio MH de meia dose para verificar a quimiotaxia das bactérias e obtivemos bons resultados. No entanto, também realizamos experimentos de controle us...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical/Solution
1% crystal violet dye solution	Solarbio	G1062	100 mL
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	Used to obtain semi-solid plates, 20 g
Centrifuge tube	Corning	430790	15 mL
Fluid thioglycollate medium	Kinghunt	K0001	29.3 g
Mueller Hinton II Broth medium	Solarbio	NO.11865	100 g
Petri dishes	Bkman	B-SLPYM90-15	Plastic Petri dishes, circular, 90 mm x 15 mm
Potassium Chloride	VETEC	WXBC4493V	0.2 g
Potassium Dihydrogen Phosphate	aladdin	04-11-7758	0.24 g
Sodium chloride	Macklin	S805275	8.0 g
Sodium phosphate dibasic	aladdin	7558-79-4	1.44 g
Terrific Broth medium	Solarbio	LA2520	200 g
Kits/ Equipment
Anaerobic incubator	Longyue
Biochemical incubator	Blue pard	LRH-70
Microplate reader	Spark
Tanon 5200multi imaging system	Tanon	5200CE
Thermostatic water bath	Jinghong	DK-S28