Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Özet

Entomopatojenik nematodlar bakterilerle simbiyoz içinde yaşarlar ve birlikte doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini zayıflatarak böcekleri başarılı bir şekilde enfekte ederler. Nematod enfeksiyonunun genetik temeli üzerine araştırmaları teşvik etmek için, entomopatojenik nematodları korumak ve genetik olarak manipüle etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Özet

Heterorhabditis ve Steinernema cinslerindeki entomopatojenik nematodlar, toprakta yaşayan böceklerin zorunlu parazitleridir. Yaşam döngülerinin temel özelliği, sırasıyla Photorhabdus ve Xenorhabdus bakterileri ile karşılıklı ilişkidir. Nematod parazitleri, uygun böcek konakçılarını bulabilir ve girebilir, böcek bağışıklık tepkisini bozabilir ve enfekte etmek için yeni böcek avını aktif olarak avlayacak yeni nesli üretmek için verimli bir şekilde çoğalabilir. Yaşam döngülerinin özellikleri nedeniyle, entomopatojenik nematodlar, yıkıcı tarımsal böcek zararlılarını kontrol etmek için böcek öldürücülerle birlikte kullanılan popüler biyolojik kontrol ajanlarıdır. Aynı zamanda, bu paraziter nematodlar, nematod patojenitesini ve konakçı anti-nematod yanıtlarını analiz etmek için bir araştırma aracını temsil eder. Bu araştırma, enfeksiyon sırasında nematod salgılanan moleküllerin rolünü anlamak için genetik tekniklerin ve transkriptomik yaklaşımların son zamanlarda geliştirilmesi ile desteklenmektedir. Burada, entomopatojenik nematodların korunması ve bir gen nakavt prosedürünün kullanılması konusunda ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Bu metodolojiler ayrıca entomopatojenik nematod enfeksiyon faktörlerinin fonksiyonel karakterizasyonunu teşvik etmektedir.

Giriş

Entomopatojenik nematodlar (EPN) üzerine yapılan araştırmalar, öncelikle bu parazitlerin entegre haşere yönetimi stratejilerindeki yararları ve temel biyomedikal araştırmalara katılımları nedeniyle son birkaç yılda yoğunlaşmıştır ^1,2. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, EPN'yi, enfeksiyon sürecinin farklı aşamalarında aktive olan nematod genetik bileşenlerini incelemek için model organizmalar olarak belirlemiştir. Bu bilgi, konakçı fizyolojisini değiştirmek ve böceğin doğuştan gelen bağışıklık tepkisini istikrarsızlaştırmak için parazitler tarafından salgılanan moleküllerin doğası ve sayısı hakkında kritik ipuçları sağlar ^3,4. Aynı zamanda, bu bilgi yaygın olarak böcek konakçısı immün sinyal yollarının tipi ve patojenlerin girişini ve yayılmasını kısıtlamak için düzenledikleri işlevler hakkında yeni detaylarla desteklenmektedir ^5,6. Bu süreçleri anlamak, EPN ve böcek konakçıları arasındaki dinamik etkileşimin her iki tarafını da öngörmek için çok önemlidir. EPN-böcek konakçı ilişkisinin daha iyi değerlendirilmesi, kuşkusuz, insan bağışıklık sistemine müdahale eden enfeksiyon faktörlerinin tanımlanmasına ve karakterize edilmesine yol açabilecek memeli parazitik nematodlarla benzer çalışmaları kolaylaştıracaktır.

EPN nematodları Heterorhabditis sp. ve Steinernema sp. çok çeşitli böcekleri enfekte edebilir ve biyolojileri daha önce yoğun bir şekilde incelenmiştir. İki nematod paraziti, Heterorhabditis kendi kendine döllenirken ve Steinernema'nın amfimiktik üreme geçiren üreme biçimlerinde farklılık gösterir, ancak son zamanlarda S. hermaphroditum'un hermafroditlerin kendi kendine döllenmesi veya partenogenez ^7,8,9 yoluyla çoğaldığı gösterilmiştir. Heterorhabditis ve Steinernema nematodları arasındaki bir diğer fark, her ikisi de böceklerin güçlü patojenleri olan sırasıyla iki farklı Gram-negatif bakteri cinsi, Photorhabdus ve Xenorhabdus ile simbiyotik karşılıklılıklarıdır. Bu bakteriler, EPN'nin serbest yaşayan ve beslenmeyen enfektif juvenil (IJ) aşamasında, duyarlı konakçıları tespit eden, hızla çoğalan ilişkili bakterilerini serbest bıraktıkları böcek hemokoluna erişen ve böcek dokularını kolonize eden bulunur. Hem EPN hem de bakterileri, böcek savunmasını silahsızlandıran ve homeostazı bozan virülans faktörleri üretir. Böcek ölümünü takiben, nematod IJ'ler yetişkin EPN olmak ve yaşam döngülerini tamamlamak için gelişir. Yiyecek yoksunluğuna ve böcek kadavrasındaki aşırı kalabalığa yanıt olarak oluşan yeni bir IJ kohortu, uygun konakçıları avlamak için toprakta nihayet ortaya çıkar 9,10,11,12.

Burada, EPN nematodlarının bakımı, çoğaltılması ve genetik olarak manipüle edilmesi için etkili bir protokol açıklanmaktadır. Protokol özellikle, simbiyotik H. bakteriyophora ve S. carpocapsae IJ'lerin replikasyonunu, aksenik nematod IJ'lerin oluşumunu, mikroenjeksiyon için H. bacteriophora hermafroditlerinin üretimini, dsRNA'nın hazırlanmasını ve mikroenjeksiyon tekniğini özetlemektedir. Bu yöntemler, nematod patojenitesinin moleküler temelini ve konakçı anti-nematod bağışıklığını anlamak için gereklidir.

Protokol

1. Simbiyotik nematod enfektif gençlerin üretimi

1. Bir Petri kabını (10 cm) bir parça filtre kağıdı ile örtün ve yaklaşık 10-15 Galleria mellonella larvası ekleyin (Şekil 1A).
2. Bir pipet kullanarak, balmumu solucanlarına 10 μL süspansiyon başına yaklaşık 25-50 IJ içeren 2 mL su dağıtın. Petri kabını oda sıcaklığında bir dolapta saklayın.
3. Filtre kağıdının nemine bağlı olarak, her 2 günde bir 1-2 mL su ekleyin. IJ'lerle enfekte olmuş balmumu kurtları normalde 48 saat içinde ölecektir.
4. White'ın su tuzaklarını, balmumu kurtları IJs⁸ ile enfekte olduktan yaklaşık 10 gün sonra hazırlayın (Şekil 1B, C). Ölü böcekleri filtre kağıdının ıslatılmamış kısmına dikkatlice aktarın. Alt Petri kabını doldurmak için musluk suyu kullanın ve havalandırma için bir ara parça olarak 15 mL'lik bir tüp kapağı yerleştirin.
5. Yumuşak ve kırılgan balmumu kurtlarını, bir çift plastik forseps kullanarak filtre kağıdından yavaşça kaldırarak dikkatlice aktarın. Demineralize veya deiyonize su yerine musluk suyu kullanın. İkincisi nematod agregasyonuna neden olur.
   1. Su tutucudaki su seviyesinin Petri kabının yüksekliğinin yaklaşık yarısına ulaştığından emin olun. Su seviyesinin, odadaki sıcaklık ve nem koşullarına bağlı olarak zamanla değişeceğini bekleyin.
6. Küçük Petri kabındaki su, nematodların varlığı nedeniyle bulanıklaştığında, yeni nesil IJ'leri bir T25 veya T75 hücre kültürü şişesine taşımak için bir pipet kullanın.
7. Uygun yoğunluğa ulaşılana kadar hacmin yaklaşık% 40'ına kadar musluk suyu ekleyin (Şekil 1C). Nematod tıkanıklığından kaçının ve hücre kültürü şişelerini yatay olarak saklayın.
8. Alt Petri kabına daha fazla su ekleyin ve IJ'ler yaklaşık 3-5 gün içinde böcek karkaslarından çıkmayı bırakana kadar 1.6 ve 1.7 adımlarını tekrarlayın.

2. Aksenik nematod enfektif yavruların üretimi

NOT: Aksenik nematodlar kullanılır, çünkü nematod-bakteri kompleksi böcek içinde ayrıştıktan sonra, her karşılıklı ortak ayrı bir konakçı bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır⁵. Photorhabdus temperata'nın mutant suşu Ret16 kullanılır, çünkü bu bakteriler H. bacteriophora'nın büyümesini destekler, ancak nematod bağırsağını kolonize edemez^13,14.

1. Heterorhabditis bacteriophora enfektif gençler
   1. Steril bir pipet ucu veya spatula kullanarak, donmuş bir P. temperata Ret16 kültürünün birkaç pulunu bir MacConkey plakasına kazıyın ve tek koloniler için çizgi çizin. Plakayı 28 ° C'de 2-3 gün boyunca inkübe edin.
   2. 10 mL'lik LB suyunu 50 mL'lik bir tüpte bir koloni ile aşılayın ve kültürü sallayan bir inkübatörde gece boyunca 28 ° C'de inkübe edin. Yalnızca MacConkey agar'da kırmızı olan birincil faz kolonilerini kullanın. İkincil faz kolonileri MacConkey agar'da kirli beyaz olacaktır.
   3. 100 μL gece kültürünü, 17.900 x g'da 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüj yaparak 900 μL 1x PBS ile yıkayın. Süper natantı dekant. Kültürü 1x PBS'de 10x seyreltin. Tüpü buz üzerinde bırakın.
   4. Balmumu kurtlarını% 70'lik bir etanol çözeltisine batırın, böcekleri bir kağıt havluyla kurutun ve 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
   5. Balmumu kurtlarını hareketsiz hale getirmek için tüpü 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
   6. Petri kabının üst ve alt yarısını (10 cm) örtmek için bir filtre kağıdı kullanın. Filtre kağıdı ile kaplı Petri kabı kapağını enjeksiyon için temel destek olarak kullanın. Alt Petri kabının filtre kağıdını nemlendirin ve enjekte edilen balmumu kurtlarının iyileşmesine yardımcı olmak için buz üzerine aktarın.
   7. Bir parça parafilm üzerine 50 μL buz gibi soğuk bakteri pipeti koyun ve 22 G iğne şırıngasını hazırlayın. İğnenin ucundaki havayı çıkarmak için pistona hafifçe bastırın.
   8. Bir balmumu solucanını stereoskop altında arka uca yakın tutun (Şekil 2).
   9. Bakteri kültürünün 50 μL'sini toraksın dorsal tarafına, tercihen iki segment arasındaki kavşakta enjekte edin. İç hasarı en aza indirmek için, balmumu kurduna mümkün olduğunca paralel olarak kütikülün hemen altına enjekte edin. Balmumu kurdu delindiğinde bir damla hemolenf damlacığının kanaması doğaldır.
   10. Enjekte edilen böcekleri iyileşme Petri kabına aktarın.
   11. Tüm böceklere bakteri enjekte edilene kadar 2.1.7-2.1.9 adımlarını tekrarlayın. Böcekleri anestezik etmek için, onları 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
   12. Petri kabını karanlıkta (örneğin, çekmece veya dolap) yerleştirin ve kuru görünüyorsa filtre kağıdına musluk suyu ekleyin. Balmumu kurtları enjeksiyondan 2 gün sonra yenik düşer ve yaklaşık 3-4 gün sonra tuğla kırmızısı görünür. Böcekler kahverengi görünüyorsa, bakteriyel enfeksiyon başarısız olmuştur.
   13. Enfeksiyondan sonraki 7 günde, karakteristik tuğla kırmızısı rengindeki böcekleri taze bir filtre kağıdı kaplı Petri kabına aktarın ve 1. adımdan itibaren "Simbiyotik nematod enfektif yavruların üretimi" ile devam edin. Simbiyotik nematodlar kullanıyorsanız, prosedürü adım 2.1'den tekrarlayın. ilk turdan itibaren yeni üretilen IJ'leri kullanarak.
   14. Yüzey sterilize edici H. bacteriophora IJ'ler
       1. 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde 100 μL'lik bir pelet yapmak için santrifüjleme yoluyla yeterli simbiyotik H. bakteriyoforu ve aday aksenik IJ'leri toplayın.
       2. Her mikrosantrifüj tüpündeki pelete 500 μL% 5 ağartıcı ekleyin ve ters çevirin. 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. 1 dakika boyunca 17.900 x g'de santrifüj. Süper natantı çıkarın.
       3. Peleti 1 mL steril suyla yıkayın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süper natantı çıkarın. Bu adımı dört kez daha tekrarlayın.
   15. Aksenisiteyi doğrulama
       1. Pipet, yıkanmış simbiyotik ve aday aksenik H. bakteriyoforasına 400 μL steril su verir.
       2. Nematodları Petri kabındaki böceklerin üzerine yerleştirin ve tedavileri buna göre etiketleyin.
       3. Petri bulaşıklarını enfekte olmuş böceklerle karanlıkta yerleştirin ve balmumu kurtlarının kırmızıya dönüp dönmediğini periyodik olarak kontrol edin.
          NOT: H. bacteriophora simbiyotik nematodlarla enfekte olmuş balmumu kurtları, enfeksiyondan sonraki 2 gün içinde kırmızı hale gelecektir. Balmumu kurdu renk değişikliği, enfeksiyon işlemi sırasında karşılıklı Photorhabdus bakterileri tarafından üretilen çeşitli bileşiklerin salgılanmasından kaynaklanmaktadır. Enfeksiyondan 4 gün sonra enfekte balmumu kurtlarında kırmızı renk eksikliği, H. bakteriyoforasının aksenik olduğunu doğrulamaktadır. Bunun nedeni, P. temperata Ret16 bakterilerinin nematod bağırsağında bulunmamasıdır.
   16. Aksenisiteyi doğrulamak için alternatif yöntem
       1. Adım 2.1.14'te açıklandığı gibi simbiyotik H. bakteriyophora IJ'leri ve aday aksenik H. bakteriyophora IJ'leri yüzey sterilize edin.
       2. Steril havaneler kullanarak mikrofüj tüplerinde 500 μL steril 1x PBS'de yaklaşık 500 IJ'yi homojenize edin. Homojenatı döndürün, süpernatanı boşaltın ve LB agar'a yayın. Plakaları 24 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
       3. Her plaka için koloni oluşturan birimleri (CFU) sayın. Aksenik H. bakteriyoforasından alınan örnekler, simbiyotik P. luminescens bakterilerinin herhangi bir kolonisini oluşturmaz.
2. Steinernema carpocapsae Enfektif Gençler
   1. Lipid agar plakalarının hazırlanması (300 mL çözelti yaklaşık 20 bölünmüş plaka yapar)
      1. 2.4 g Besin Suyu, 4.5 g maya özü ve 1.5 g agar tartın ve bunları 267 mL deiyonize suya ekleyin. Çözümü otoklav edin.
      2. 3 mL 1 M MgCl 2,_1.2 mL mısır yağı ve 28.8 mL% 7 mL mısır şurubu ekleyin.
      3. 300 μL 30 mg / mL kanamisin ve 300 μL 50 mg / mL ampisilin (0.2 μm filtre ile sterilize edilmiş) hazırlayın ve çözeltiye ekleyin.
      4. Karışımı bölünmüş bir Petri kabının / bölünmüş tabağın yarısına boşaltın.
   2. X. nematophila (suş ΔrpoS) bakteriyel çiminin hazırlanması
      1. Kültür X. nematophila (Xn) ΔrpoS doğrudan dondurulmuş bir bakteri stokundan, gece boyunca 30 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde 2 mL LB / kan / amp çözeltisi.
      2. 30 μg / mL kanamisin ve 50 μg / mL ampisilin içeren 5 mL LB ortamını, gece kültürünün 250 μL'si ile aşılayın ve bakterileri bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca büyütün.
         NOT: Xn bakterileri, dondurulmuş bir stoktan doğrudan seleksiyon lipit agar ortamına çizildiğinde iyi büyümez. Gerekirse, taze bir sıvı kültüre başlamadan önce birincil ve ikincil faz Xn, NBTA ortamında (25 mg bromothimol mavi l-1 ve 40 mg tripheniltetrazolium klorür ^l-1 ile desteklenmiş besin agar) doğrulanabilir.
      3. Pipet, lipit agar plakaları üzerindeki kültürün 100 μL'sini oluşturur ve steril bir aşılama halkası ile tüm plakaya yayılır. Plakaları 30 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.
   3. Yüzey sterilize edici S. carpocapsae IJ'ler
      1. IJ'ler içeren bir şişeyi, IJ'lerin şişenin bir köşesine batacağı bir açıyla bırakın. Yerleşmiş IJ'lerin 1 mL'sini bir mikrosantrifüj tüpüne aspire edin. 10 s için 17.900 x g'de santrifüj. Süper natantı çıkarın.
      2. 1 mL% 1 taze hazırlanmış ağartıcı çözeltisi ekleyin. İyice karıştırmak için tüpleri ters çevirin. 1 dakika boyunca inkübe edin (uzun süreli ağartıcı inkübasyonu IJ ölümüne yol açacaktır). 10 saniye boyunca tekrar döndürün.
      3. Ağartıcı kalıntılarını gidermek için, nematodları 1 mL steril damıtılmış su ile yıkayın ve 10 sn boyunca santrifüj yapın. Yıkamayı dört kez daha tekrarlayın.
      4. Stereoskop altında yıkanan IJ'lerin 10-20 μL'sini sayarak mL başına IJ sayısını tahmin edin ve IJ'lerin konsantrasyonunu buna göre ayarlayın.
   4. Yetiştirme S. carpocapsae IJs
      1. Pipetle yaklaşık 1000 IJ ile lipit agar bölünmüş plakalarına aktarın (Şekil 3, soldaki resim). Plakaları nemlendirilmiş bir kabine veya çekmeceye yerleştirin. Nemi artırmak için nemli kağıt havlular kullanın. Plakaları oda sıcaklığında (22-25 °C) tutun.
      2. Kağıt havluları nemli kaldıklarından emin olmak için her gün kontrol edin. Gerekirse, kabin veya çekmecedeki nemi korumak için kağıt havlulara her gün su ekleyin. Alternatif olarak, nemi artırmak için kabinin altına bir su banyosu yerleştirin.
      3. IJ'ler yalnızca göründüğünde, plakanın diğer tarafına su ekleyin ve plakanın ortasına bir filtre kağıdı tabakası yerleştirin (su tutucu, Şekil 3, sağ resim). İlk tur IJ'leri içeren bu suyu bir T75 hücre kültürü şişesinde toplayın. Bunlar Round I S. carpocapsae nematodlarıdır.
      4. Çamaşır suyu ile yüzey sterilizasyonu yapın (adım 2.2.3) ve Round 1 S. carpocapsae nematodlarını kullanarak adım 2.2'den itibaren işlemi tekrarlayın. Sonuç Round 2 S. carpocapsae nematodları olacaktır.
      5. Nematodların gelişimini izlemek için birkaç günde bir stereoskop altında kontrol edin.
   5. S. carpocapsae IJ'lerin aksenik durumunu doğrulama
      1. Round 1, Round 2 ve symbiotic S. carpocapsae IJ'leri adım 2.2.3'te açıklandığı gibi ağartıcı ile yüzey sterilize edin.
      2. Steril plastik havaneler kullanarak mikrofüj tüplerinde yaklaşık 400-700 IJ'yi homojenize edin. Homojenatı santrifüj edin, süpernatanı boşaltın ve çözeltiyi LB agar plakalarına yayın. Agar plakalarını 24 saat boyunca 28 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
      3. Her plaka için CFU oluşumunu sayın. Aksenik nematodlardan alınan örnekler herhangi bir bakteri büyümesi üretmez.
   6. S. carpocapsae IJ'lerin aksenik durumunun PCR ile doğrulanması
      1. Round 1, Round 2 ve symbiotic S. carpocapsae IJ'leri adım 2.2.3'te açıklandığı gibi ağartıcı ile yüzey sterilize edin.
      2. Homojenattan DNA ayıklayın. Ayrıntılı bir ekstraksiyon prosedürü aşağıdaki Bölüm 4.1.2'de açıklanmıştır.
      3. Tavlama sıcaklığı 61 °C olan XptA2 primerlerini kullanarak PCR uygulayın:
         XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
         XptA R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
         NOT: Bu primerler, X. nematophila'nın böcek öldürücü geni XptA2'yi yükselterek 231 bp boyutunda bir amplikon üretir. Bisiklet programı şu şekildeydi: 2 dakika için 95 ° C, 30 s için 95 ° C'lik 34 döngü, 1 dakika için 61 ° C ve 1 dakika için 73 ° C tavlama sıcaklığı ve ardından 10 dakika için 72 ° C.
      4. Güçlendirilmiş parçaları% 1.5'lik bir agaroz jeli içinde ayırarak görselleştirin. Aksenik yüzey sterilize edilmiş numuneler herhangi bir bant oluşturmaz.

3. Mikroenjeksiyon için H. bacteriophora hermafroditlerinin yetiştirilmesi

1. NA+chol (1.5x Besin Suyu,% 1.5 agar ve 10 μg / mL kolesterol) ile 6 cm Petri kabı tabakları hazırlayın.
2. 10 mL'lik bir kültür tüpünde 3 mL PP3 çözeltisi (% 2 Protease Peptone #3, PP3) hazırlayın.
3. -80 ° C'de tutulan P. luminescens gliserol stoğunun (% 25 hacim / hacim steril gliserol) üstünü kazımak ve kültür tüpüne bırakmak için steril bir 20 μL uç kullanın.
4. Tüpü gece boyunca 28 ° C, 200 rpm'ye ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir çalkalayıcıda inkübe edin.
5. Ertesi gün, kültür açık kırmızı renkte olacaktır. 6 cm'lik NA+chol Petri kabı üzerine 50 μL kültür plakası koyun ve dairesel bir şekilde bir bakteri yayıcı kullanarak yayın.
6. Plakaları 28 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. P. luminescens çimleri 24-36 saat içinde hazır olacak ve açık kırmızı renkte görünecektir.
7. Plakayı 50-100 yüzey sterilize edilmiş IJ ile aşılayın ve plakayı 28 ° C'de tutun.
8. Sağlıklı L4 hermafroditi aşılamadan yaklaşık 48-54 saat sonra ortaya çıkmaya başlayacaktır. Enjeksiyon için sağlıklı, aç kalmamış geç L4 H. bacteriophora hermafroditleri gereklidir.

4. dsRNA'nın hazırlanması

1. Astar tasarımı
   1. H. bacteriophora DNA'sının ~ 500 baz çifti ekzon bölgesini hedeflemek için dsRNA için primerler tasarlayın.
      1. İlgilenilen bölgeler için astarlar, Primer3 (https://primer3.ut.ee) veya benzer bir program kullanılarak, 500 baz çifti optimum ürün uzunluğu, 60 ° C'lik Tm ve 22 nükleotidin astar uzunluğu seçilerek belirlenebilir.
      2. İn vitro transkripsiyona izin vermek için her ileri astarın 5′ ucuna bir T7 bölgesi (TAATACGACTCACTATAGGG) ekleyin.
2. Genomik DNA İzolasyonu
   1. dsRNA sentezi için ~ 50.000 H. bakteriyoforası IJ'nin dondurulmuş peletlerinden izole edilmiş genomik DNA kullanın.
   2. En az 30 dakika boyunca -80 °C'de yerleştirilmiş 50 μL lizis tamponunda (50 mM KCl, %0,05 (w/v) jelatin, 10 mM Tris-HCl pH 8.2, %0.45 Ara 20, 60 μg/mL Proteinaz K,_2.5 mM MgCl 2) içinde yeniden askıya alınmış bir IJ pelet kullanın.
   3. Peleti küçük bir tüp havaneli ile homojenize edin.
   4. Çözeltiyi oda sıcaklığına ısıtın ve her 15 dakikada bir girdap yaparak 2 saat boyunca 60 ° C'de inkübe edin.
   5. Homojenize edilmiş dokuyu 95 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe ederek Proteinaz K'yı denatüre edin.
   6. Numuneyi 4 °C'ye soğutun ve 1 dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj yapın.
   7. Elde edilen süpernatantı sonraki PCR için şablon olarak kullanın.
   8. 200 ng şablon DNA, 0,2 μM ileri ve geri astar ve üreticinin önerdiği döngü koşullarına sahip ticari bir mastermix kullanarak 50 μL PCR reaksiyonu ayarlayın.
   9. Reaksiyonların tahmin edilen boyutta tek bantlar ürettiğini doğrulamak için% 1.2'lik bir agaroz jeli üzerindeki PCR reaksiyonunu analiz edin.
3. dsRNA sentezi
   1. Ticari bir transkripsiyon kiti kullanın.
   2. İn vitro transkripsiyon için 5 μL PCR reaksiyonu kullanın. Üreticinin talimatlarını izleyin.
   3. Reaksiyonu 37 ° C'de 16 saat boyunca inkübe edin.
   4. İn vitro transkripsiyon reaksiyonlarını, dsRNA'yı konsantre etmek için amonyum asetat / etanol çökeltmesi kullanarak ticari bir kit ile temizleyin.
   5. Peletlenmiş dsRNA'yı 10 μL RNaz içermeyen suda askıya alın.
   6. RNA'yı bir spektrofotometre kullanarak sayısallaştırın.
   7. DsRNA'yı% 1.2'lik bir agaroz jeli üzerinde ayırarak kaliteyi değerlendirin

5. Mikroenjeksiyon

NOT: Bir enjeksiyon pedi, ortasında% 2 (w / v) agaroz tabakası bulunan bir cam kapak kaymasıdır. Enjekte edilecek solucanlar bu pedlere aktarıldığında, agaroz tabakası onları prosedür için hareketsiz hale getirecektir. Normalde, ekstra pedler genel kullanım için mikroskopun yakınında tutulur.

1. Enjeksiyon pedinin hazırlanması
   1. 10 mL suya 0.2 g agaroz ekleyerek suda% 2 agaroz kaynatın.
   2. 50 mm x 70 mm inceliğinde bir cam kapak kapağının ortasına 1-4 damla (~ 50 μL) yerleştirin.
   3. Damlayı düzleştirmek için başka bir kapak kayması kullanın.
   4. Kapak kaymasını yana doğru kaydırmadan önce kapak kaymasını 2-3 dakika kurumaya bırakın.
   5. Yukarı bakan kapak kapağının sağ tarafını bir 'R' ile işaretleyin.
   6. Slaytları kullanmadan önce 1 gün oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
2. Enjeksiyon iğnelerinin hazırlanması
   1. İç ince filament içeren 1,0 mm cam kılcal damarlar kullanın. Bu, iğnenin verimli bir şekilde doldurulmasını sağlar.
      NOT: Herhangi bir ticari iğne çektirici (örneğin, Narishige PB-7) kullanılabilir.
   2. İğne çektirme makinesini açın.
   3. Gerekli iğne keskinliğini ve uygun uzunluğu sağlamak için ısıtıcının maksimuma ve solenoidin 8,40'a ayarlandığından emin olun.
   4. Kılcal boruyu filamentten üst düğme sırtına yerleştirin ve üst düğmeyi sıkın. Kılcal borunun üst kısmı, iğne çektirmenin üst kısmı ile aynı seviyede olacak ve ısıtma filamenti kılcal damarın ortasında olacaktır.
   5. Alt üniteyi üste doğru hareket ettirin ve ardından alt düğmeyi sıkın. Kılcal damarın güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
   6. İğne çektiricisinin kapağını kapatın ve başlat düğmesine basın. Yeşil ışık yanar. Birkaç dakika sonra kılcal damar ısıtılacak ve iki yarıya ayrılmak üzere ayrılacaktır.
      NOT: İki ayrı iğne aynı uzunlukta değildir, ancak her ikisi de enjeksiyonlar için kullanılabilir. Daha uzun iğne noktaları tercih edilir.
   7. İğneleri, bir parça modelleme kili kullanarak noktaları aşağı doğru olacak şekilde dikey konumda düzenleyin. Alternatif olarak, iğneleri iki şerit modelleme kili tarafından yerinde tutulan bir Petri kabında saklayın.
3. İğnenin yüklenmesi
   NOT: Nükleik asit çözeltisi, süspansiyonda bulunabilecek pelet safsızlıklarına karşı 20.784 x g'de en az 10 dakika boyunca santrifüj edilmelidir. Kirliliklerin santrifüjlenmesi, enjeksiyon iğnesinin akışını engellemelerini önler.
   1. İğnelere nükleik asitleri yüklemek için iki yöntemden birini kullanın.
   2. Yöntem 1
      1. Santrifüj DNA örneğinin yaklaşık 0,5 μL'sini enjeksiyon iğnesinin çekilmemiş ucuna aktarmak için bir pipet kullanın. Bu, kılcal tüpün üstünde oturan küçük bir sıvı damlası olarak görünecektir.
      2. Sıvı numunenin iğnenin ucunu işgal etmesine izin vermek için 5 ila 7 dakika bekleyin. Nihai ürün, hava kabarcıkları bulunmayan dolu bir iğne olacaktır.
      3. Enjeksiyondan önce iğne ucunda çözeltinin varlığını doğrulamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
   3. Yöntem 2
      1. Mikroenjektör için yükleme uçlarını kullanın.
      2. Bu yükleme ucunu kullanarak, nükleik asit çözeltisinin 5 μL'sini pipetleyin.
      3. Çekilen iğne iğne çektirme makinesinin üzerindeyken, üst düğmeyi gevşetin, üst çekilen iğneyi hafifçe yukarı doğru hareket ettirin ve düğmeyi yeniden sıkın.
      4. Yükleyicinin ucunu dikkatlice kılcal boruya yerleştirin ve enjeksiyon iğnesinin dibine kadar uzatın.
      5. Nükleik asit çözeltisini enjeksiyon iğnesine pipetleyin.
      6. Yükleyiciyi çekilen iğneden çıkarın ve gerekirse daha fazla yükleme için ayrı tutun. Farklı bir nükleik asit karışımı yüklerken yükleyicileri kapattığınızdan emin olun.
4. Enjeksiyon mikroskobunun hazırlanması
   NOT: Mikroskop tabanından dağınık aydınlatmaya sahip ters çevrilmiş bir mikroskop, solucan hazırlama, mikroenjeksiyon ve kurtarma için kullanılır. 10x ve 40x hedefleri olan yüksek çözünürlüklü ters çevrilmiş bir mikroskop kullanımı açıklanmaktadır. Mikroskop, iğneyi tutan ve enjeksiyon için yerine getiren bir iğne manipülatörü ile donatılmıştır. Mikroenjeksiyon yağı, solucanın enjeksiyon pedinin agaroz tabakası üzerindeyken hızlı dehidrasyonunu önlemek için kullanılır. Kullanılması önerilen yağ Halokarbon Yağı 700'dür.
   1. Lambayı açın ve kontrol paneliyle parlaklığı kalibre edin.
   2. Kondenser Wollaston prizması üzerindeki sayıyı kontrol edin; kullanılan hedefe (40x) karşılık gelecektir.
   3. "DIC" ile işaretlenmiş DIC taretinin doğru konumda olduğunu onaylayın.
   4. Hedefteki düğmenin sıfır (0) olarak ayarlandığından emin olun.
   5. Ph halkasını sonuna kadar sağa çevirin.
   6. Polarizörü, ok yatay konumda olacak şekilde ayarlayın.
   7. Odak noktasını (ışığı) gözlemlemek için sahneye bir parça kağıt koyun.
   8. Alan diyaframını, kağıt üzerinde bir nokta olacak şekilde kapatın.
   9. Kondenseri parça kağıdı üzerinde çok keskin bir ışık noktasının görüldüğü noktaya kadar yukarı ve aşağı hareket ettirmek için soldaki kadranı kullanın.
   10. Alan diyaframını, küçük bir ışık çemberinin görülebildiği noktaya kadar yavaşça açın.
   11. Kağıt parçasını alın.
   12. Işık noktasının hedefin merkezinde olduğundan emin olun. Aksi takdirde, kondenserin üstündeki gümüş vidaları ayarlayarak ışık noktasını hedefin merkezi ile hizalayın.
   13. Alan diyaframını tamamen açın.
   14. Analizör ICT/P'ye basılıp basılmadığını kontrol edin.
5. Enjeksiyon iğnesinin mikroskop üzerine monte edilmesi
   1. Mikroenjeksiyon iğnesine azot gazı akışını açın. İğneye gaz basıncı yaklaşık 20 psi olacaktır.
   2. Mikromanipülatör düğmelerinin (mikroskopun iğneyi hareket ettiren kısmı) merkeze yerleştirildiğini kontrol edin, bu da iğne monte edildiğinde en geniş hareket aralığına izin verir.
   3. İğne tutucusundan çıkarmak için metal çubuğu tutan tertibatı sökün.
   4. Yeni iğneyi mikroskobun üst kısmına yerleştirin; ardından iğneyi yerinde tutmak için lastik contayı takın.
   5. İğne tutucunun alt kısmını montaja takarak sabitleyin.
   6. İğneyi mikromanipülatördeki oluğa yerleştirin ve sabit tutmak için düzgün bir şekilde vidalayın. Vidanın mikromanipülatörün ucundan yaklaşık 1 inç olduğundan emin olun.
   7. İğnenin ucunu, mikromanipülatörün düğmelerini ve kaba kontrollerini kullanarak, sahne plakasına göre yaklaşık 45° 'lik bir açıyla görme alanının ortasına yerleştirin. İğne ucunu kazara kırılmaması için yeterince yüksek bırakmak çok önemlidir.
6. İğnelerin kırılması
   1. İğneyi, nükleik asit çözeltisinin içinden akmasına izin vermek için iğnenin ucunun normalde kırılacağı mikromanipülatöre yerleştirin.
   2. Bir kılcal damarı kırın ve bir damla mikroenjeksiyon yağı taşıyan bir cam slaytın üzerine yerleştirin.
   3. Slaytı mikroskopa yerleştirin ve odaklanın.
   4. Mikroskopun ince kontrollerini kullanarak iğnenin ucunu kılcal damar tarafıyla aynı seviyeye getirin (Şekil 4).
   5. İğnenin ucunun kırılmadığını doğrulamak için ayak aktüatörünü kullanarak azot akışını kısaca açın. Hızlı bir açma-kapama yeterli olacaktır.
   6. İğneyi hafifçe hareket ettirin, böylece kılcal damarın yanına zar zor dokunur.
   7. İğne ucunu kırmak için mikroskopun yan tarafına hafifçe dokunun.
   8. İğneyi kılcal damardan çıkarın ve iğnenin düzgün kırılıp kırılmadığını kontrol etmek için azot akışını açın.
   9. İğne, iğnenin ucundan yaklaşık beş kat daha büyük küçük bir enjeksiyon damlası oluşturacaktır (Şekil 4). Enjeksiyon damlası daha küçük boyuttaysa, ucu daha da kırın. Enjeksiyon damlacığı daha büyük boyuttaysa, taze bir iğne kullanmaya çalışın.

6. Mikroenjeksiyon

1. Bir enjeksiyon pedi üzerine bir damla mikroenjeksiyon yağı pipetin.
2. Alevle sterilize edilmiş bir kepçeyi mikroenjeksiyon yağ damlasına batırın ve genç bir H toplayın. bakteriyophora yetişkin nematodu plakadan.
3. Çok sayıda bakteri hücresinin enjeksiyon pedine aktarılmasını önlemek için plakanın bakteriyel çimlere yakın olmayan kısımlarından nematodları seçin. Ayrıca, iyi biçimlendirilmiş gonadlarla bir nematod hasat edin.
4. Nematodları enjeksiyon pedine taşıyın ve gonadlar iğneye bakacak şekilde dikey olarak konumlandırın. Vulvanın enjeksiyon iğnesiyle aynı yöne işaret ettiğinden ve iki distal gonad kolunun ters yönde ve nematod vücut duvarına karşı olduğundan emin olun.
   NOT: Pristionchus pacificus gibi, H. bacteriophora'nın gonadı da ventral vulval pozisyondan dorsal olarak göç eder ve daha sonra ventral pozisyona geri göç eder.
5. Nematodun etrafta dolaşmasına izin vermeden nematod kurumasını önlemek için yağ miktarının yeterli olup olmadığını kontrol edin.
6. İğneyi slaytın çok üzerinde tutarak 10x hedefiyle nematodu odaklayın. Yağda, nematod gonadlar solucanın ön ve arka tarafına yakın iki net bölge olarak görülür. Gonadların odaklandığından ve solucanın diğer kısımlarının olmadığından emin olun.
7. Nematodu enjeksiyon iğnesine doğru 15 ° ila 45 ° 'lik bir açıyla düzenleyin, bu da gonadın içindeki iğneye daha fazla yer açacaktır. Ayrıca, bu yaklaşım, iğne gonadın içine sokulduğunda iğnenin tüm nematod gövdesinden geçmesini önler.
8. Enjeksiyon iğnesini ve nematod, odaklanana kadar iğneyi kademeli olarak indirerek aynı seviyeye getirin (Şekil 5). İğne indirilirken, solucanın üstünde değil, nematodun yanında kaldığından emin olun.
9. Nematodun sinsityal gonad koluna odaklanmak için 40x hedefini kullanın.
10. İnce ayarlayıcıyı kullanarak iğneyi, uç nematod sinsityal gonad kolu ile birlikte odaklanana kadar yukarı ve aşağı hareket ettirin.
11. Kayma aşamasını kullanarak nematodu yavaşça iğneye doğru hareket ettirin. Daha sonra gonadı iğneyle nematod gövdesi duvarına doğru hafifçe itin, bu da nematod gövdesinin içine etkili iğne penetrasyonuna neden olur.
12. Nükleik asit çözeltisinin akışını başlatmak için ayak aktüatörüne kısaca basın. Hızlı bir açma-kapama yeterlidir. İğne gonadın içindeyse, gonad çözelti ile dolacak ve şişecektir.
13. İğne doğru pozisyonda sağlandıktan sonra, gonadın kolları dolana kadar gonadı nükleik asit çözeltisi ile doldurun. İğnenin deldiği delikten sıvının solucandan atılmasını önlemek önemlidir.
14. Kaydırma aşamasını kullanarak, solucanı dikkatlice iğneden uzaklaştırın.
15. İğneyi kaldırın ve saat yönünün tersine çevirin.
16. Solucanın üzerine bir damla 1x PBS arabelleği koyarak solucanın üzerine yerleştirin.
17. Solucanı kaldırmak için alevle sterilize edilmiş kepçeyi kullanın ve solucanı fazla yağdan arındırmak için taze bir P. luminescens tohumlu plaka üzerinde başka bir M9 damlasına yerleştirin.
18. Nematodu M9'dan çıkarın ve bakteri çimlerinin uzak tarafına yerleştirin.
19. Birkaç enjekte edilen nematodları aktarmak için aynı plakayı kullanın.
20. 2-3 gün içinde, transgenik fenotip için birinci nesil (F1) nematodları değerlendirin. Hangi solucanların kararlı transgenik çizgiler üreteceğini belirlemek için transgenik F1 nematodlarını ayrı ayrı plakalara ayırın.

Sonuçlar

Aksenizasyondan geçen H. bacteriophora nematodlarının durumunu değerlendirmek için, IJ'lerde P. luminescens bakteri kolonilerinin varlığı veya yokluğu belirlenmiştir. Bunu yapmak için, daha önce yüzey sterilize edilmiş ve PBS'de homojenize edilmiş yaklaşık 500 IJ'lik bir pelet toplandı. Pozitif kontrol tedavisi, simbiyotik P. luminescens bakterileri içeren nematod kültüründen yaklaşık 500 IJ'lik bir peletten oluşuyordu. Baltanize ve pozitif kontrol nematodlarının pele...

Tartışmalar

Entomopatojenik nematod enfeksiyonunun ve böcek anti-nematod bağışıklığının moleküler temelini anlamak, parazitlerin karşılıklı olarak ilişkili bakterilerden ayrılmasını gerektirir^13,15,16. Entomopatojenik nematodlar H. bacteriophora ve S. carpocapsae sırasıyla Gram-negatif bakteriler P. luminescens ve X. nematophila ile birlikte yaşar¹⁷. Her iki ba...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicillin	Fisher Scientific	611770250
Cell culture flask T25	Fisher Scientific	156367
Cell culture flask T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Corn oil	VWR	470200-112
Corn syrup	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Culture tube 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Falcon tube 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet Microinjector	Eppendorf	5252000021
Filter paper	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco	-
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700	Sigma	H8898
Inoculating loop	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope	Microscope Central	-
MacConkey medium	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Microcentrifuge tube	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Needle syringe	VWR	BD305155	22G
Nutrient broth	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm	VWR	52858-076
Partitioned Petri dish	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers	Azenta	-
Pestle	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Petri dish 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
Proteose Peptone #3	Thermo Fisher Scientific	211693
Yeast extract	Millipore-Sigma	Y1625