Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

요약

Entomopathogenic 선충류는 박테리아와 공생하며 함께 선천적 인 면역 체계를 손상시켜 곤충을 성공적으로 감염시킵니다. 선충류 감염의 유전 적 기초에 대한 연구를 촉진하기 위해 엔토모 병원성 선충류를 유지하고 유 전적으로 조작하는 방법이 설명됩니다.

초록

Heterorhabditis 및 Steinernema 속의 Entomopathogenic 선충류는 토양에 사는 곤충의 의무적 인 기생충입니다. 그들의 수명주기의 주요 특징은 박테리아 Photorhabdus 및 Xenorhabdus와의 상호 연관성입니다. 선충류 기생충은 적절한 곤충 숙주를 찾아 진입하고, 곤충 면역 반응을 전복시키고, 효율적으로 번식하여 새로운 곤충 먹이를 적극적으로 사냥하여 감염시킬 다음 세대를 생산할 수 있습니다. 수명주기의 특성으로 인해 엔토모 병원성 선충류는 파괴적인 농업 곤충 해충을 방제하기 위해 살충제와 함께 사용되는 인기있는 생물학적 방제제입니다. 동시에,이 기생 선충류는 선충류 병원성을 분석하고 항 선충류 반응을 숙주로하는 연구 도구를 나타냅니다. 이 연구는 감염 동안 선충류 분비 분자의 역할을 이해하기위한 유전 기술 및 전사 학적 접근법의 최근 개발에 의해 도움을받습니다. 여기에서, 엔토모병원성 선충류를 유지하고 유전자 녹다운 절차를 사용하는 것에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이러한 방법론은 엔토모병원성 선충류 감염 인자의 기능적 특성화를 더욱 촉진한다.

서문

entomopathogenic nematodes (EPN)에 대한 연구는 통합 해충 관리 전략에서 이러한 기생충의 유용성과 기본 생물 의학 연구 ^1,2에 대한 참여로 인해 지난 몇 년 동안 강화되었습니다. 최근 연구들은 EPN을 감염 과정의 여러 단계에서 활성화되는 선충류 유전 성분을 검사하는 모델 유기체로 확립했다. 이 정보는 숙주 생리학을 변화시키고 곤충 선천적 면역 반응을 불안정하게 하기 위해 기생충에 의해 분비되는 분자의 성질 및 수에 대한 중요한 단서^{를 제공한다(3,4}). 동시에,이 지식은 일반적으로 곤충 숙주 면역 신호 전달 경로의 유형과 병원균 ^5,6의 진입 및 확산을 제한하기 위해 규제하는 기능에 대한 새로운 세부 사항에 의해 보완됩니다. 이러한 과정을 이해하는 것은 EPN과 곤충 숙주 간의 역동적 인 상호 작용의 양면을 구상하는 데 중요합니다. EPN-곤충 숙주 관계에 대한 더 나은 인식은 의심 할 여지없이 포유류 기생 선충류와의 유사한 연구를 촉진 할 것이며, 이는 인간 면역 체계를 방해하는 감염 인자의 확인 및 특성화로 이어질 수 있습니다.

EPN 선충류 Heterorhabditis sp. 및 Steinernema sp.는 광범위한 곤충을 감염시킬 수 있으며 생물학은 이전에 집중적으로 연구되었습니다. 두 선충류 기생충은 이종 횡문염이 스스로 수정되고 Steinernema가 양서류 번식을 겪고있는 번식 방식이 다르지만 최근에는 S. hermaphroditum이 헤르마프로디테스의 자체 수정 또는 분파^{생성 7,8,9}을 통해 번식하는 것으로 나타났습니다. Heterorhabditis와 Steinernema 선충류의 또 다른 차이점은 곤충의 강력한 병원균 인 그람 음성 박테리아 인 Photorhabdus와 Xenorhabdus의 두 가지 별개의 속을 가진 공생 적 상호 작용입니다. 이 박테리아는 EPN의 자유 생활 및 비 먹이 감염성 청소년 (IJ) 단계에서 발견되며, 민감한 숙주를 탐지하고 곤충 헤모코엘에 접근하여 빠르게 복제되는 관련 박테리아를 방출하고 곤충 조직을 식민지화합니다. EPN과 박테리아 모두 곤충 방어를 해제하고 항상성을 손상시키는 독성 요인을 생성합니다. 곤충 사망 후, 선충류 IJ는 성인 EPN이되어 수명주기를 완료하기 위해 발전합니다. 곤충 사체 내에서 식량 부족과 과밀에 대응하여 형성된 새로운 IJ의 코호트가 마침내 토양에서 나타나 적절한 숙주 9,10,11,12를 사냥합니다.

여기에서, EPN 선충류를 유지, 증폭 및 유전적으로 조작하기 위한 효율적인 프로토콜이 기재되어 있다. 특히, 프로토콜은 공생 H. 박테리오포라 및 S. carpocapsae IJs의 복제, 축삭 선충류 IJs의 생성, 미세주사를 위한 H. 박테리오포라 헤르마프로디테스의 생산, dsRNA의 제조, 및 미세주사 기술을 개략적으로 기술한다. 이러한 방법은 선충류 병원성 및 숙주 항선충류 면역의 분자 기초를 이해하는 데 필수적입니다.

프로토콜

1. 공생선충류 감염성 청소년의 생산

1. 페트리 접시 (10cm)를 여과지로 덮고 약 10-15 마리의 갤러리아 멜로 넬라 유충을 첨가하십시오 (그림 1A).
2. 피펫을 사용하여 현탁액 10 μL 당 약 25-50 IJ를 함유하는 물 2 mL를 왁스 웜 상에 분주한다. 페트리 접시를 실온에서 캐비닛에 보관하십시오.
3. 여과지의 습기에 따라 2 일마다 1-2 mL의 물을 첨가하십시오. IJ에 감염된 왁스 웜은 일반적으로 48 시간 이내에 사망합니다.
4. 왁스웜이^{IJs 8}에 감염된 후 약 10일 후에 White의 물 트랩을 준비합니다(그림 1B,C). 죽은 곤충을 여과지의 흠뻑 젖지 않은 부분으로 조심스럽게 옮기십시오. 수돗물을 사용하여 바닥 페트리 접시를 채우고 환기를위한 스페이서로 15 mL 튜브의 캡을 놓습니다.
5. 부드럽고 깨지기 쉬운 왁스 웜을 한 쌍의 플라스틱 포셉을 사용하여 여과지에서 천천히 들어 올려 조심스럽게 옮깁니다. 탈염수 또는 탈이온수 대신 수돗물을 사용하십시오. 후자는 선충류 응집을 일으킨다.
   1. 물 트랩의 수위가 페트리 접시 높이의 약 절반에 도달하는지 확인하십시오. 수위는 실내의 온도 및 습도 조건에 따라 시간이 지남에 따라 변할 것으로 예상하십시오.
6. 선충류의 존재로 인해 작은 페트리 접시의 물이 흐려지면 피펫을 사용하여 차세대 IJ를 T25 또는 T75 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.
7. 적절한 밀도에 도달할 때까지 부피의 약 40%까지 수돗물을 첨가하십시오(그림 1C). 선충류 혼잡을 피하고 세포 배양 플라스크를 수평으로 보관하십시오.
8. 바닥 페트리 접시에 더 많은 물을 넣고 약 3-5 일 안에 IJ가 곤충 사체에서 나오는 것을 멈출 때까지 1.6 단계와 1.7 단계를 반복하십시오.

2. 도끼 선충류 감염성 청소년의 생산

참고 : Axenic 선충류는 선충류 박테리아 복합체가 곤충 내부에서 해리 된 후 각 상호 작용 파트너가 뚜렷한 숙주 면역 반응을 유도하기 때문에 사용됩니다⁵. Photorhabdus temperata의 돌연변이 균주 Ret16은 이들 박테리아가 H. bacteriophora의 성장을 지원하지만 선충류 장^13,14를 식민지화하지 못하기 때문에 사용됩니다.

1. Heterorhabditis bacteriophora 감염성 청소년
   1. 멸균 피펫 팁 또는 주걱을 사용하여 P. temperata Ret16의 냉동 배양물의 여러 조각을 MacConkey 플레이트에 긁어 내고 단일 콜로니에 대한 줄무늬를 긁어냅니다. 플레이트를 28°C에서 2-3일 동안 인큐베이션한다.
   2. 콜로니와 함께 LB 배양액 10 mL를 50 mL 튜브에 접종하고, 진탕 배양기에서 28°C에서 밤새 배양물을 배양하였다. MacConkey 한천에서 빨간색인 기본 단계 콜로니만 사용하십시오. 이차적 인 단계 식민지는 MacConkey 한천에서 흰색이 될 것입니다.
   3. 밤새 배양된 100 μL를 17,900 x g의 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서 원심분리하여 900 μL의 1x PBS로 세척한다. 상층액을 데칸트하십시오. 배양물을 1x PBS에 10x로 희석한다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
   4. 왁스 웜을 70 % 에탄올 용액에 담그고 곤충을 종이 타월로 말린 다음 50 mL 튜브에 넣으십시오.
   5. 튜브를 얼음 위에 20 분 동안 올려 놓고 왁스 웜을 고정시킵니다.
   6. 여과지를 사용하여 페트리 접시 (10cm)의 상단과 하단 절반을 덮으십시오. 여과지로 덮인 페트리 접시 뚜껑을 주사를위한 기본 지지대로 사용하십시오. 바닥 페트리 접시의 여과지를 적시고 얼음 위에 옮겨 주입 된 왁스 웜이 회복되도록 돕습니다.
   7. 파라필름 조각에 얼음처럼 차가운 박테리아 50 μL를 피펫하고 22 G 바늘 주사기를 제조하였다. 플런저를 부드럽게 눌러 바늘 끝의 공기를 제거합니다.
   8. 왁스웜을 스테레오스코프 아래 후부 끝에 가깝게 유지합니다(그림 2).
   9. 박테리아 배양물 50 μL를 흉부의 등쪽 측면, 바람직하게는 두 세그먼트 사이의 접합부에 주입하십시오. 내부 손상을 최소화하려면 가능한 한 왁스 웜과 평행하게 큐티클 바로 아래에 주사하십시오. 왁스 웜이 뚫릴 때 용혈림프 방울이 피를 흘리는 것은 자연스러운 일입니다.
   10. 주입 된 곤충을 회복 페트리 접시로 옮깁니다.
   11. 모든 곤충이 박테리아와 함께 주입 될 때까지 2.1.7-2.1.9 단계를 반복하십시오. 곤충을 마취하려면 얼음 위에 5 분 동안 두십시오.
   12. 페트리 접시를 어둠 (예 : 서랍 또는 캐비닛)에 놓고 건조한 것처럼 보이면 여과지에 수돗물을 넣으십시오. 왁스 웜은 주사 후 2 일 후에 굴복하고 약 3-4 일 후에 벽돌 빨간색으로 나타납니다. 곤충이 갈색으로 보이면 박테리아 감염이 실패한 것입니다.
   13. 감염 후 7 일 후, 특징적인 벽돌 붉은 색의 곤충을 신선한 여과지가 늘어선 페트리 접시에 옮기고 1 단계부터 "공생 선충류 감염성 청소년 생산"을 계속하십시오. 공생 선충류를 사용하는 경우 2.1 단계의 절차를 반복하십시오. 첫 번째 라운드에서 새로 생성 된 IJ를 사용합니다.
   14. 표면 살균 H. 박테리오포라 IJs
       1. 원심분리에 의해 충분한 공생 H. 박테리오포라 및 후보 축삭 IJs를 수집하여 1.5 mL 원심분리 튜브에서 100 μL 펠렛을 만든다.
       2. 5% 표백제 500 μL를 각 마이크로원심분리 튜브의 펠렛에 첨가하고 반전시킨다. 10분 동안 인큐베이션한다. 1분 동안 17,900 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 제거하십시오.
       3. 펠렛을 멸균수 1 mL로 세척하고 원심분리를 반복한다. 상층액을 제거하십시오. 이 단계를 네 번 더 반복합니다.
   15. 축도 확인
       1. 피펫 400 μL의 멸균수를 세척하여 공생 및 후보-축산 H. 박테리오포라 선충류.
       2. 페트리 접시의 곤충 위에 선충류를 놓고 그에 따라 치료법에 라벨을 붙입니다.
       3. 감염된 곤충이있는 페트리 접시를 어둠 속에 놓고 왁스 웜이 빨간색으로 변하는지 주기적으로 확인하십시오.
          참고 : H. bacteriophora 공생 선충류에 감염된 왁스 웜은 감염 후 2 일 이내에 붉어집니다. 왁스 웜 변색은 감염 과정에서 상호 작용적인 광횡문부 박테리아에 의해 생성 된 다양한 화합물의 분비로 인한 것입니다. 감염 후 4 일 후에 감염된 왁스 웜에 붉은 색이 없다는 것은 H. bacteriophora 가 축삭임을 확인합니다. 이것은 P. temperata Ret16 박테리아가 선충류 내장에 존재하지 않기 때문입니다.
   16. 축도를 검증하기 위한 대체 방법
       1. 표면-멸균 공생 H. 박테리오포라 IJs 및 후보-축산 H. 박테리오포라 IJs는 단계 2.1.14에 기재된 바와 같다.
       2. 멸균 페슬을 사용하여 마이크로퍼지 튜브에서 500 μL의 멸균 1x PBS에 약 500 IJ를 균질화한다. 균질액을 아래로 회전시키고, 상청액을 데칸트하고, LB 한천 상에 퍼뜨린다. 플레이트를 24시간 동안 28°C에서 인큐베이션한다.
       3. 각 플레이트에 대한 콜로니 형성 단위 (CFU)를 계산하십시오. axenic H. bacteriophora 로부터의 샘플은 공생 P. luminescens 박테리아의 어떤 콜로니도 형성하지 않을 것이다.
2. Steinernema carpocapsae 감염성 청소년
   1. 지질 한천 플레이트의 제조 (300 mL 용액은 약 20 개의 분할 플레이트를 만듭니다)
      1. 영양 국물 2.4g, 효모 추출물 4.5g, 한천 1.5g을 칭량하여 탈이온수 267mL에 첨가한다. 솔루션을 오토클레이브합니다.
      2. 3 mL의 1 M_MgCl2, 1.2 mL의 옥수수 기름 및 28.8 mL의 7% 옥수수 시럽을 첨가한다.
      3. 30mg/mL 카나마이신 300μL와 50mg/mL 암피실린 300μL(0.2μm 필터로 멸균)를 준비하여 용액에 첨가한다.
      4. 분할 된 페트리 접시 / 분할 접시의 절반에 믹스를 데칸트하십시오.
   2. X. nematophila (균주 ΔrpoS) 박테리아 잔디의 제조
      1. 동결된 박테리아 스타킨 2 mL의 LB/kan/amp 용액으로부터 직접 X. nematophila (Xn) ΔrpoS 를 30°C에서 하룻밤 동안 진탕기에서 배양하였다.
      2. 30 μg/mL 카나마이신과 50 μg/mL 암피실린이 들어있는 LB 배지 5 mL를 250 μL의 밤새 배양물에 접종하고 진탕기에서 밤새 박테리아를 성장시킨다.
         참고 : Xn 박테리아는 냉동 된 주식에서 선택 지질 한천 배지에 직접 줄무늬가 생기면 잘 자라지 않습니다. 필요한 경우, 1차 및 2차 상 Xn은 신선한 액체 배양을 시작하기 전에 NBTA 배지(25mg의 브로모티몰 블루 ^l-1 및 40mg 트리페닐테트라졸륨 클로라이드 ^l-1로 보충된 영양 한천)에서 먼저 확인될 수 있다.
      3. 100 μL의 피펫 배양물을 지질 한천 플레이트 상에서 멸균 접종 루프로 플레이트 전체에 퍼뜨렸다. 플레이트를 30°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
   3. 표면 살균 S. carpocapsae IJs
      1. IJ가 들어있는 플라스크를 비스듬히 두어 IJ가 플라스크의 모서리에 가라앉도록 합니다. 침전된 IJs 1 mL를 마이크로원심분리 튜브에 흡인한다. 10초 동안 17,900 x g 에서 원심분리. 상층액을 제거하십시오.
      2. 갓 준비한 표백제 1% 1mL를 첨가한다. 튜브를 반전시켜 완전히 혼합하십시오. 1 분 동안 인큐베이션하십시오 (장기간 표백제 배양은 IJ 사망으로 이어질 것입니다). 다시 10초 동안 회전합니다. 상층액을 제거합니다.
      3. 표백제 잔여물을 제거하려면 선충류를 멸균 증류수 1mL로 세척하고 10초 동안 원심분리하여 상층액을 제거하십시오. 세척을 네 번 더 반복하십시오.
      4. 스테레오스코프 하에서 세척된 IJs의 10-20 μL를 계수함으로써 mL 당 IJ 카운트를 추정하고, 그에 따라 IJs의 농도를 조정한다.
   4. S. carpocapsae IJs 양육
      1. 약 1000IJs의 피펫으로 지질 한천 분할 플레이트 상으로 옮긴다(그림 3, 왼쪽 이미지). 플레이트를 가습 캐비닛이나 서랍에 넣으십시오. 습기를 늘리기 위해 젖은 종이 타월을 사용하십시오. 플레이트를 실온 (22-25 °C)에서 유지하십시오.
      2. 종이 타월을 격일로 점검하여 촉촉하게 유지되는지 확인하십시오. 필요한 경우 캐비닛이나 서랍의 습도를 유지하기 위해 종이 타월에 격일로 물을 넣으십시오. 또는 캐비닛 바닥에 수조를 배치하여 습도를 높입니다.
      3. IJ만 나타나면 플레이트의 반대편에 물을 넣고 플레이트 중앙에 여과지 층을 놓습니다(워터 트랩, 그림 3, 오른쪽 그림). 첫 번째 둥근 IJ를 함유하는 이 물을 T75 세포 배양 플라스크에 수집한다. 이들은 Round I S. carpocapsae 선충류입니다.
      4. 표면-표백제로 다시 멸균하고(단계 2.2.3), 라운드 1 S. 카포캡사 선충류를 사용하여 단계 2.2로부터의 과정을 반복한다. 결과는 라운드 2 S. carpocapsae 선충류가 될 것입니다.
      5. 선충류의 발달을 추적하기 위해 며칠마다 스테레오스코프를 확인하십시오.
   5. S. carpocapsae IJs의 축 상태 확인
      1. 표면-단계 2.2.3에 기재된 바와 같이 표백제로 라운드 1, 라운드 2, 및 공생 S. 카르포캡사 IJs를 멸균한다.
      2. 멸균 플라스틱 유모차를 사용하여 미세 퍼지 튜브에서 약 400-700 IJ를 균질화하십시오. 균질액을 원심분리하고, 상청액을 데칸트하고, 용액을 LB 한천 플레이트 상에 퍼뜨린다. 한천 플레이트를 24시간 동안 28°C에서 설정된 인큐베이터에 보관한다.
      3. 각 플레이트에 대한 CFU의 형성을 계산하십시오. 축삭 선충류의 샘플은 박테리아 성장을 일으키지 않습니다.
   6. PCR에 의한 S. carpocapsae IJs의 축삭 상태 확인
      1. 표면-단계 2.2.3에 기재된 바와 같이 표백제로 라운드 1, 라운드 2, 및 공생 S. 카르포캡사 IJs를 멸균한다.
      2. 균질액으로부터 DNA를 추출한다. 자세한 추출 절차는 아래 섹션 4.1.2에 설명되어 있습니다.
      3. 어닐링 온도 61°C의 XptA2 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다:
         증권 시세 표시기 F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3'.
         증권 시세 표시기 R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3'.
         참고: 이들 프라이머는 X. 선충충의 살충 유전자 XptA2를 증폭시켜 231 bp 크기의 앰플리콘을 생성한다. 사이클링 프로그램은 다음과 같았다: 2분 동안 95°C, 30초 동안 95°C의 34 사이클, 1분 동안 61°C의 어닐링 온도 및 1분 동안 73°C의 어닐링 온도, 이어서 10분 동안 72°C로 이어진다.
      4. 증폭된 단편을 1.5% 아가로스 겔에서 분리하여 시각화한다. 축삭 표면 멸균 샘플은 어떤 밴드도 형성하지 않습니다.

3. 미세 주사를 위한 H. 박테리오포라 헤르마프로디테스 양육

1. NA+chol(영양국물 1.5개, 한천 1.5%, 콜레스테롤 10μg/mL)로 6cm 페트리 접시를 준비합니다.
2. 10 mL 배양 튜브에서 3 mL의 PP3 용액 (2% 프로테아제 펩톤 #3, PP3)을 준비한다.
3. 멸균 20 μL 팁을 사용하여 -80°C로 유지된 P. luminescens 글리세롤 스톡(25% vol/vol sterile glycerol)의 상부를 긁어내고 배양 튜브에 떨어뜨린다.
4. 튜브를 28°C, 200 rpm으로 설정된 온도 조절 진탕기에서 밤새 인큐베이션한다.
5. 다음 날에는 문화가 밝은 빨간색으로 변할 것입니다. 50 μL의 플레이트를 6 cm NA+콜 페트리 접시 상에서 배양하고, 이를 원형 방식으로 박테리아 스프레더를 사용하여 확산시켰다.
6. 플레이트를 28°C 인큐베이터에 놓는다. P. luminescens 잔디밭은 24-36 시간 안에 준비되며 밝은 빨간색으로 나타납니다.
7. 플레이트를 50-100 표면 멸균된 IJs로 접종하고 플레이트를 28°C에서 유지한다.
8. 건강한 L4 hermaphrodite는 접종 후 약 48-54 시간 후에 나타나기 시작합니다. 건강하고 굶주리지 않은 늦은 L4 H. 박테리오포라 헤르마프로디테스는 주사에 필요합니다.

4. dsRNA의 제조

1. 프라이머 디자인
   1. H. 박테리오포라 DNA의 ∼500 염기쌍 엑손 영역을 표적으로 하는 dsRNA에 대한 프라이머를 설계한다.
      1. 관심 영역에 대한 프라이머는 Primer3(https://primer3.ut.ee) 또는 유사한 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 최적의 생성물 길이 500개 염기쌍, 60°C의 Tm, 및 22개 뉴클레오티드의 프라이머 길이를 선택할 수 있다.
      2. T7 부위 (TAATACGACTCACTATAGGG)를 시험관내 전사를 허용하도록 각각의 정방향 프라이머의 5' 말단에 첨가한다.
2. 게놈 DNA 분리
   1. dsRNA 합성을 위해 ∼50,000 H. 박테리오포라 IJs의 동결 펠릿으로부터 분리된 게놈 DNA를 사용한다.
   2. 50 μL의 용해 완충액 (50 mM KCl, 0.05% (w/v) 젤라틴, 10 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.45% 트윈 20, 60 μg/mL 프로테이나제 K, 2.5 mM_MgCl2)에 재현탁된 IJ 펠렛을 사용하여 -80°C에서 적어도 30분 동안 두었다.
   3. 작은 튜브 유모로 펠렛을 균질화하십시오.
   4. 용액을 실온으로 가온하고, 60°C에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 15분마다 볼텍싱한다.
   5. 균질화된 조직을 95°C에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 프로테이나제 K를 변성시킨다.
   6. 샘플을 4°C로 냉각하고 1분 동안 3,400 x g 에서 원심분리한다.
   7. 생성된 상청액을 후속 PCR을 위한 주형으로 사용한다.
   8. 200 ng의 주형 DNA, 0.2 μM의 정방향 및 역방향 프라이머가 있는 상용 마스터믹스를 사용하여 50 μL PCR 반응을 설정하고, 제조자가 제안한 사이클링 조건을 설정한다.
   9. 1.2% 아가로스 겔 상에서 PCR 반응을 분석하여 반응이 예측된 크기의 단일 밴드를 생성하는지 검증한다.
3. dsRNA 합성
   1. 상업용 전사 키트를 사용하십시오.
   2. 시험관내 전사를 위해 5 μL PCR 반응을 사용한다. 제조업체의 지침을 따릅니다.
   3. 반응물을 37°C에서 16시간 동안 인큐베이션한다.
   4. 암모늄 아세테이트/에탄올 침전을 사용하여 상용 키트로 시험관내 전사 반응을 세척하여 dsRNA를 농축시킨다.
   5. 펠릿화된 dsRNA를 10 μL의 RNase-free 물에 현탁시킨다.
   6. 분광광도계를 사용하여 RNA를 정량화한다.
   7. 1.2% 아가로스 겔 상에서 dsRNA를 분리하여 품질을 평가한다.

5. 미세주입

참고: 주입 패드는 중앙에 2%(v/v) 아가로스 층이 있는 유리 커버슬립입니다. 주입 할 웜이이 패드로 옮겨지면 아가로스 층이 절차를 위해 그들을 고정시킵니다. 일반적으로 여분의 패드는 일반적인 사용을 위해 현미경 근처에 보관됩니다.

1. 주입 패드 준비
   1. 2% 아가로스 0.2 g을 물 10 mL에 첨가하여 물에 끓인다.
   2. 1-4방울(~50μL)을 50mm x 70mm 얇은 유리 커버슬립의 중앙에 놓습니다.
   3. 다른 커버 슬립을 사용하여 방울을 평평하게하십시오.
   4. 커버슬립을 옆으로 미끄러지기 전에 커버슬립을 2-3분 동안 말리십시오.
   5. 위쪽을 향한 커버슬립의 오른쪽에 'R'로 표시하십시오.
   6. 슬라이드를 사용하기 전에 실온에서 1 일 동안 말리십시오.
2. 주사 바늘의 제조
   1. 내부 미세 필라멘트가 들어있는 1.0mm 유리 모세 혈관을 사용하십시오. 이것은 바늘의 효율적인 충전을 허용합니다.
      참고: 모든 상업용 바늘 풀러(예: Narishige PB-7)를 사용할 수 있습니다.
   2. 바늘 풀러를 켭니다.
   3. 히터가 최대로 설정되어 있고 솔레노이드가 8.40으로 설정되어 있는지 확인하여 필요한 바늘 선명도와 적절한 길이를 보장하십시오.
   4. 모세관 튜브를 필라멘트를 통해 상단 노브 능선에 삽입하고 상단 손잡이를 조이십시오. 모세관 튜브의 상단은 바늘 풀러의 상단과 수평이되고 가열 필라멘트는 모세관의 중간에있을 것입니다.
   5. 아래쪽 장치를 위쪽으로 이동한 다음 아래쪽 손잡이를 조입니다. 모세관이 단단히 놓여 있는지 확인하십시오.
   6. 바늘 당김기의 덮개를 닫고 시작을 누릅니다. 녹색 표시등이 켜집니다. 몇 분 후에 모세관을 가열하고 떼어내어 두 개의 반으로 분리합니다.
      참고 : 두 개의 분리 된 바늘은 길이가 동일하지 않지만 둘 다 주사에 사용할 수 있습니다. 더 긴 바늘 점이 선호됩니다.
   7. 모델링 점토 조각을 사용하여 바늘을 아래쪽으로 향하게하는 수직 위치에 바늘을 배치하십시오. 또는 바늘을 모델링 점토의 두 스트립으로 제자리에 고정시킨 페트리 접시에 보관하십시오.
3. 바늘 적재
   참고: 핵산 용액은 현탁액에 존재할 수 있는 펠릿 불순물을 위해 20,784 x g 에서 적어도 10분 동안 원심분리되어야 한다. 불순물의 원심분리는 주사 바늘의 흐름을 막지 못하게합니다.
   1. 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 바늘에 핵산을로드하십시오.
   2. 방법 1
      1. 피펫을 사용하여 약 0.5 μL의 원심분리된 DNA 샘플을 주입 바늘의 풀링되지 않은 끝으로 옮깁니다. 이것은 모세관 튜브 위에 앉아있는 작은 액체 방울로 나타납니다.
      2. 액체 샘플이 바늘의 끝을 차지할 수 있도록 5 내지 7분 동안 대기시킨다. 최종 제품은 기포가없는 채워진 바늘이 될 것입니다.
      3. 해부 현미경을 사용하여 주사 전에 바늘 팁에 용액이 있는지 확인하십시오.
   3. 방법 2
      1. 마이크로 인젝터에 대한 로딩 팁을 사용하십시오.
      2. 이 로딩 팁을 사용하여, 핵산 용액의 5 μL를 피펫한다.
      3. 당겨진 바늘이 바늘 당김기에 있는 동안 위쪽 손잡이를 풀고 위쪽으로 당겨진 바늘을 약간 위쪽으로 이동한 다음 손잡이를 다시 조이십시오.
      4. 로더의 팁을 모세관 튜브에 조심스럽게 삽입하고 주사 바늘의 바닥까지 연장하십시오.
      5. 핵산 용액을 주사 바늘 내로 피펫한다.
      6. 당겨진 바늘에서 로더를 제거하고 필요한 경우 추가 적재를 위해 별도로 보관하십시오. 다른 핵산 믹스를 로딩 할 때 로더를 전환해야합니다.
4. 주사현미경 준비
   참고 : 현미경베이스에서 확산 된 조명이있는 반전 현미경은 웜 준비, 미세 주입 및 회복에 사용됩니다. 10x 및 40x 목표를 가진 고해상도 반전 현미경의 사용이 설명됩니다. 현미경에는 바늘을 잡고 주사를위한 위치로 가져 오는 바늘 조작기가 장착되어 있습니다. 미세 주입 오일은 주입 패드의 아가로스 층에있는 동안 웜이 빠른 탈수되는 것을 방지하는 데 사용됩니다. 사용할 권장 오일은 Halocarbon Oil 700입니다.
   1. 램프를 켜고 제어판으로 밝기를 보정하십시오.
   2. 콘덴서 Wollaston 프리즘의 번호를 확인하십시오. 그것은 사용 된 목표 (40x)에 해당합니다.
   3. "DIC"로 표시된 DIC 포탑이 올바른 위치에 있는지 확인합니다.
   4. 목표의 노브가 0으로 설정되어 있는지 확인합니다.
   5. 끝까지 Ph 링을 오른쪽으로 돌립니다.
   6. 화살표가 수평 위치에 있는 방식으로 편광자를 조정합니다.
   7. 무대에 종이 한 장을 올려 놓고 초점(빛)을 관찰한다.
   8. 필드 다이어프램을 용지에 스폿이 있을 때까지 닫으십시오.
   9. 왼쪽의 다이얼을 사용하여 콘덴서를 위아래로 움직여 조각 용지에 매우 날카로운 조명 점이 보이도록 합니다.
   10. 작은 빛의 원이 보이는 지점까지 필드 다이어프램을 천천히 엽니다.
   11. 종이 조각을 치우십시오.
   12. 조명 지점이 목표물의 중심에 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면 콘덴서 상단의 은색 나사를 조정하여 조명 지점을 목표물의 중심과 정렬하십시오.
   13. 필드 다이어프램을 완전히 엽니다.
   14. 분석기 ICT/P가 눌려져 있는지 확인합니다.
5. 현미경에 주사 바늘 장착
   1. 미세 주입 바늘에 질소 가스 흐름을 켭니다. 바늘에 대한 가스 압력은 대략 20 psi가 될 것이다.
   2. 미세 조작기 손잡이 (바늘을 움직이는 현미경의 일부)가 중앙에 위치하여 바늘이 장착 될 때 가장 넓은 범위의 움직임을 허용하는지 확인하십시오.
   3. 금속 막대를 고정하는 어셈블리의 나사를 풀어 바늘 홀더에서 제거합니다.
   4. 현미경의 상단 부분에 새 바늘을 삽입; 그런 다음 고무 개스킷을 설치하여 바늘을 제자리에 유지하십시오.
   5. 바늘 홀더의 하단 부분을 조립품에 장착하여 고정하십시오.
   6. 바늘을 미세 조작기의 홈에 넣고 제대로 조여서 안정적으로 유지하십시오. 나사가 미세 조작기의 끝에서 약 1 인치인지 확인하십시오.
   7. 바늘의 끝을 무대 플레이트와 관련하여 약 45 ° 각도로 시야의 중앙에 놓고 미세 조작기의 손잡이와 거친 컨트롤을 사용하십시오. 실수로 부러지지 않도록 바늘 끝을 충분히 높게 두는 것이 중요합니다.
6. 바늘 깨기
   1. 바늘의 끝이 정상적으로 부러져 핵산 용액이 통과 할 수 있도록 바늘을 미세 조작기에 넣으십시오.
   2. 모세관을 부수고 미세 주입 오일 한 방울을 담은 유리 슬라이드 위에 놓습니다.
   3. 슬라이드를 현미경에 놓고 초점을 맞춥니다.
   4. 현미경의 미세 제어를 사용하여 바늘 끝을 모세관의 측면과 같은 수준으로 가져옵니다(그림 4).
   5. 풋 액추에이터를 사용하여 질소 흐름을 잠깐 켜서 바늘 끝이 부러지지 않았는지 확인하십시오. 빠른 온오프로 충분합니다.
   6. 바늘이 모세관의 측면에 거의 닿지 않도록 바늘을 부드럽게 움직입니다.
   7. 현미경의 측면을 가볍게 두드려 바늘 끝을 부러 뜨립니다.
   8. 모세관에서 바늘을 제거하고 질소 흐름을 켜서 바늘이 제대로 부러졌는지 확인하십시오.
   9. 바늘은 바늘 끝보다 약 다섯 배 큰 작은 주사 방울을 만듭니다 (그림 4). 주입 방울의 크기가 작 으면 팁을 더 부러 뜨립니다. 주사 방울이 더 큰 크기이면 신선한 바늘을 사용하십시오.

6. 미세주입

1. 주입 패드에 미세 주입 오일 한 방울을 피펫하십시오.
2. 화염 살균 된 픽을 미세 주입 오일 드롭에 담그고 어린 H를 수집하십시오. 접시에서 박테리오포라 성인 선충류.
3. 박테리아 잔디밭에 가깝지 않은 플레이트의 일부에서 선충류를 선택하여 많은 수의 박테리아 세포가 주입 패드로 전달되는 것을 방지하십시오. 또한, 잘 형성된 생식선으로 선충류를 수확하십시오.
4. 선충류를 주사 패드로 옮기고 생식선이 바늘을 향하도록 수직으로 놓습니다. 외음부가 주사 바늘과 같은 방향을 가리키고 두 개의 원위 생식선 팔이 반대 방향으로, 선충류 신체 벽에 대해 위로 향하고 있는지 확인하십시오.
   참고 : Pristionchus pacificus와 마찬가지로 H. bacteriophora 의 생식선은 복부 외음부 위치에서 등쪽으로 이동 한 다음 복부 위치로 다시 이동합니다.
5. 기름의 양이 선충류가 방황하는 것을 허용하지 않고 선충류 건조를 예방하기에 충분한지 확인하십시오.
6. 바늘을 슬라이드 위에 잘 올려 놓음으로써 선충류를 10x 목표물로 초점을 맞 춥니 다. 기름에서 선충류 생식선은 웜의 전방과 후방에 가까운 두 개의 명확한 영역으로 간주됩니다. 생식선이 웜의 다른 부분이 아닌 초점에 있는지 확인하십시오.
7. 선충류를 주사 바늘쪽으로 15 ° ~ 45 ° 각도로 배열하면 생식선 내부의 바늘에 더 많은 공간을 확보 할 수 있습니다. 또한,이 접근법은 바늘이 생식선 내부에 도입 될 때 바늘이 선충류 몸 전체를 통과하는 것을 방지합니다.
8. 주사 바늘과 선충류를 동일한 수준으로 놓고 초점이 맞춰질 때까지 바늘을 서서히 낮춥니다(그림 5). 바늘이 낮아지면 선충류 옆에 남아 있고 웜 위에 남아 있지 않은지 확인하십시오.
9. 40x 목표를 사용하여 선충류의 동기화 생식선 팔에 집중하십시오.
10. 팁이 선충류 동기화 생식선 팔과 함께 초점이 맞춰질 때까지 미세 조절기를 사용하여 바늘을 위아래로 움직입니다.
11. 슬라이딩 스테이지를 사용하여 선충류를 바늘 쪽으로 천천히 움직입니다. 그런 다음 선충류 몸체 벽에 바늘로 위치하도록 생식선을 부드럽게 밀어 넣으면 선충류 몸체 내부에 바늘이 효율적으로 침투하게됩니다.
12. 풋 액추에이터를 간단히 밟아 핵산 용액의 흐름을 시작한다. 빠른 온오프로 충분합니다. 바늘이 생식선 안에 있으면 생식선이 용액으로 채워지고 부풀어 오릅니다.
13. 바늘이 올바른 위치에 보장되면 생식선의 팔이 채워질 때까지 핵산 용액으로 생식선을 채 웁니다. 바늘이 구멍을 뚫은 구멍을 통해 웜에서 액체가 배출되는 것을 피하는 것이 중요합니다.
14. 슬라이딩 스테이지를 사용하여 조심스럽게 웜을 바늘에서 멀리 옮깁니다.
15. 바늘을 들어 올려 시계 반대 방향으로 돌립니다.
16. 웜 위에 1x PBS 버퍼 한 방울을 올려 놓고 플로팅합니다.
17. 화염 살균 픽을 사용하여 웜을 들어 올리고 신선한 P. luminescens 시드 플레이트에 M9의 또 다른 방울에 넣어 과도한 오일의 웜을 제거하십시오.
18. M9에서 선충류를 제거하고 박테리아 잔디밭의 먼 쪽에 놓습니다.
19. 같은 플레이트를 사용하여 여러 개의 주입 된 선충류를 옮깁니다.
20. 2-3일 후, 형질전환 표현형에 대한 제1 세대 (F1) 선충류를 평가하였다. 트랜스제닉 F1 선충류를 개별 플레이트에 분리하여 어떤 웜이 안정적인 트랜스제닉 라인을 생성할지 결정한다.

결과

축삭화를 거친 H. 박테리오포라 선충류의 상태를 평가하기 위해, IJs에서 P. luminescens 박테리아 콜로니의 존재 또는 부재를 결정하였다. 이를 위해, PBS에서 이전에 표면 멸균 및 균질화되었던 대략 500개의 IJs의 펠릿을 수집하였다. 양성 대조군 처리는 공생 P. 발광 박테리아를 함유하는 선충류 배양물로부터의 대략 500 IJs의 펠릿으로 구성되었다. 축삭 및 양성 대조군 선충류의 펠?...

토론

엔토모병원성 선충류 감염 및 곤충 항선충류 면역의 분자 기초를 이해하려면 상호 연관된 박테리아 ^13,15,16으로부터 기생충의 분리가 필요하다. 엔토모병원성 선충류 H. bacteriophora 및 S. carpocapsae는 각각 그람 음성 박테리아 P. luminescens 및 X. nematophila와 함께 살며,¹⁷. 두 박테리아 종 모...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicillin	Fisher Scientific	611770250
Cell culture flask T25	Fisher Scientific	156367
Cell culture flask T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Corn oil	VWR	470200-112
Corn syrup	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Culture tube 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Falcon tube 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet Microinjector	Eppendorf	5252000021
Filter paper	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco	-
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700	Sigma	H8898
Inoculating loop	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope	Microscope Central	-
MacConkey medium	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Microcentrifuge tube	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Needle syringe	VWR	BD305155	22G
Nutrient broth	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm	VWR	52858-076
Partitioned Petri dish	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers	Azenta	-
Pestle	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Petri dish 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
Proteose Peptone #3	Thermo Fisher Scientific	211693
Yeast extract	Millipore-Sigma	Y1625