Культивирование и генетическое манипулирование энтомопатогенными нематодами

Резюме

Энтомопатогенные нематоды живут в симбиозе с бактериями и вместе они успешно заражают насекомых, подрывая их врожденную иммунную систему. Для содействия исследованиям генетической основы нематодной инфекции описаны методы поддержания и генетического манипулирования энтомопатогенными нематодами.

Аннотация

Энтомопатогенные нематоды в родах Heterorhabditis и Steinernema являются облигатными паразитами насекомых, обитающих в почве. Основной характеристикой их жизненного цикла является мутуалистическая ассоциация с бактериями Photorhabdus и Xenorhabdus соответственно. Паразиты-нематоды способны находить и проникать в подходящих насекомых-хозяев, подрывать иммунный ответ насекомых и эффективно размножаться, чтобы произвести следующее поколение, которое будет активно охотиться на новую добычу насекомых для заражения. Благодаря свойствам своего жизненного цикла, энтомопатогенные нематоды являются популярными средствами биологического контроля, которые используются в сочетании с инсектицидами для борьбы с разрушительными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями. Одновременно эти паразитические нематоды представляют собой исследовательский инструмент для анализа патогенности нематод и реакций хозяина против нематод. Этому исследованию способствует недавняя разработка генетических методов и транскриптомных подходов для понимания роли молекул, секретируемых нематодами, во время инфекции. Здесь приведен подробный протокол по поддержанию энтомопатогенных нематод и использованию процедуры нокдауна генов. Эти методологии дополнительно способствуют функциональной характеристике энтомопатогенных факторов инфекции нематод.

Введение

Исследования энтомопатогенных нематод (EPN) активизировались за последние несколько лет в первую очередь из-за полезности этих паразитов в комплексных стратегиях борьбы с вредителями и их участия в фундаментальных биомедицинских исследованиях ^1,2. Недавние исследования установили EPN в качестве модельных организмов, в которых можно исследовать генетические компоненты нематод, которые активируются на разных стадиях инфекционного процесса. Эта информация дает критические подсказки о природе и количестве молекул, секретируемых паразитами, чтобы изменить физиологию хозяина и дестабилизировать врожденный иммунный ответ насекомых ^3,4. В то же время эти знания обычно дополняются новыми подробностями о типе иммунных сигнальных путей насекомого-хозяина и функциях, которые они регулируют, чтобы ограничить проникновение и распространение патогенов ^5,6. Понимание этих процессов имеет решающее значение для представления обеих сторон динамического взаимодействия между EPN и их насекомыми-хозяевами. Лучшая оценка отношений между EPN и насекомым-хозяином, несомненно, облегчит аналогичные исследования с паразитическими нематодами млекопитающих, что может привести к выявлению и характеристике инфекционных факторов, которые мешают иммунной системе человека.

Нематоды EPN Heterorhabditis sp. и Steinernema sp. могут заражать широкий спектр насекомых, и их биология была интенсивно изучена ранее. Два паразита-нематоды различаются по способу размножения: гетерорхабдит самооплодотворяется, а Steinernema подвергается амфимическому размножению, хотя недавно было показано, что S. hermaphroditum размножается путем самооплодотворения гермафродитов или партеногенеза ^7,8,9. Другим отличием нематод Heterorhabditis и Steinernema является их симбиотический мутуализм с двумя различными родами грамотрицательных бактерий, Photorhabdus и Xenorhabdus, соответственно, которые являются мощными патогенами насекомых. Эти бактерии обнаруживаются на стадии свободноживущей и непитающейся инфекционной ювенильной (IJ) EPN, которая обнаруживает восприимчивых хозяев, получает доступ к гемокоэлю насекомых, где они высвобождают свои ассоциированные бактерии, которые быстро реплицируются, и колонизируют ткани насекомых. Как EPN, так и их бактерии производят факторы вирулентности, которые обезоруживают защиту насекомых и ухудшают гомеостаз. После смерти насекомых НЕМАТОДы развиваются, чтобы стать взрослыми EPN и завершить свой жизненный цикл. Новая когорта ИД, сформированная в ответ на лишение пищи и перенаселенность в трупе насекомых, наконец, появляется в почве, чтобы охотиться на подходящих хозяев 9,10,11,12.

Здесь описан эффективный протокол для поддержания, усиления и генетического манипулирования нематодами EPN. В частности, протокол описывает репликацию симбиотических H. bacteriophora и S. carpocapsae IJs, генерацию аксеновых нематод IJ, производство H. bacteriophora hermaphrodites для микроинъекции, получение дцРНК и технику микроинъекции. Эти методы необходимы для понимания молекулярной основы патогенности нематод и иммунитета хозяина против нематод.

протокол

1. Производство симбиотических нематод инфекционных молодей

1. Накройте чашку Петри (10 см) листом фильтровальной бумаги и добавьте примерно 10-15 личинок Galleria mellonella (рисунок 1A).
2. Используя пипетку, дозируйте 2 мл воды, содержащей около 25-50 IJ на 10 мкл суспензии, на восковых червей. Храните чашку Петри в шкафу при комнатной температуре.
3. В зависимости от влажности фильтровальной бумаги добавляйте 1-2 мл воды каждые 2 дня. Восковые черви, инфицированные II, обычно умирают в течение 48 часов.
4. Подготовьте водяные ловушки Уайта примерно через 10 дней после заражения восковых червей IJs⁸ (рисунок 1B, C). Аккуратно перенесите мертвых насекомых на непромокшую часть фильтровальной бумаги. Используйте водопроводную воду для заполнения нижней чашки Петри и поместите крышку трубки объемом 15 мл в качестве распорки для вентиляции.
5. Осторожно перенесите мягких и хрупких восковых червей, медленно поднимая их из фильтровальной бумаги с помощью пары пластиковых щипцов. Используйте водопроводную воду вместо деминерализованной или деионизированной воды. Последние вызывают агрегацию нематод.
   1. Убедитесь, что уровень воды в ловушке для воды достигает примерно половины высоты чашки Петри. Ожидайте, что уровень воды будет меняться со временем в зависимости от температурных и влажностных условий в помещении.
6. Когда вода в маленькой чашке Петри становится мутной из-за присутствия нематод, используйте пипетку, чтобы переместить новое поколение IJ в колбу для культуры клеток T25 или T75.
7. Добавляйте водопроводную воду примерно до 40% объема до тех пор, пока не будет достигнута соответствующая плотность (рисунок 1C). Избегайте застойных явлений нематод и храните колбы культуры клеток горизонтально.
8. Добавьте больше воды на дно чашки Петри и повторяйте шаги 1,6 и 1,7, пока ИД не перестанут выходить из туш насекомых примерно через 3-5 дней.

2. Производство аксенической нематоды, заразной молоди

ПРИМЕЧАНИЕ: Аксеновые нематоды используются, потому что после того, как комплекс нематода-бактерия диссоциирует внутри насекомого, каждый взаимный партнер вызывает отчетливый иммунный ответ хозяина⁵. Мутантный штамм Ret16 Photorhabdus temperata используется, потому что эти бактерии поддерживают рост H. bacteriophora, но не могут колонизировать кишечник нематоды^13,14.

1. Heterorhabditis bacteriophora инфекционные молодые особи
   1. Используя стерильный наконечник пипетки или шпатель, соскоблите несколько хлопьев замороженной культуры P. temperata Ret16 на пластину MacConkey и полосу для отдельных колоний. Инкубировать пластину в течение 2-3 дней при 28 °C.
   2. Привить 10 мл бульона LB колонией в пробирке объемом 50 мл и инкубировать культуру в течение ночи при 28 °C в встряхивающем инкубаторе. Используйте только колонии первичной фазы, которые красные на агаре MacConkey. Колонии вторичной фазы будут белыми на агаре MacConkey.
   3. Промыть 100 мкл ночной культуры 900 мкл 1x PBS центрифугированием в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл при 17 900 х г. Декант супернатанта. Разбавить культуру в 10 раз в 1x PBS. Оставьте трубку на льду.
   4. Погрузите восковых червей в 70% раствор этанола, высушите насекомых бумажным полотенцем и поместите их в трубку объемом 50 мл.
   5. Поместите трубку на лед на 20 минут, чтобы обездвижить восковых червей.
   6. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы покрыть верхнюю и нижнюю половины чашки Петри (10 см). Используйте крышку чашки Петри, покрытую фильтровальной бумагой, в качестве базовой опоры для инъекций. Смочите фильтровальную бумагу нижней чашки Петри и переложите на лед, чтобы помочь введенным восковым червям восстановиться.
   7. Пипетка 50 мкл ледяных бактерий на куске парапленки и приготовьте шприц 22 г. Осторожно надавите на плунжер, чтобы удалить воздух на кончике иглы.
   8. Держите воскового червя близко к заднему концу под стереоскопом (рисунок 2).
   9. Вводят 50 мкл бактериальной культуры в дорсальную сторону грудной клетки, предпочтительно на стыке между двумя сегментами. Чтобы свести к минимуму внутренние повреждения, вводите прямо под кутикулу, как можно параллельнее восковому червю. Естественно, что капля гемолимфы кровоточит при прокалывании воскового червя.
   10. Переведите введенных насекомых на восстановительную чашку Петри.
   11. Повторяйте шаги 2.1.7-2.1.9 до тех пор, пока всем насекомым не будут введены бактерии. Чтобы обезболить насекомых, поместите их на лед на 5 мин.
   12. Поместите чашку Петри в темноту (например, ящик или шкаф) и добавьте водопроводную воду в фильтровальную бумагу, если она окажется сухой. Восковые черви погибают через 2 дня после инъекции и кажутся кирпично-красными примерно через 3-4 дня. Если насекомые кажутся коричневыми, бактериальная инфекция не увенчалась успехом.
   13. Через 7 дней после заражения перенесите насекомых с характерным кирпично-красным цветом на свежую чашку Петри с фильтрованной бумагой и продолжайте с «Производство симбиотических нематод инфекционных молодых особей» с шага 1. При использовании симбиотических нематод повторите процедуру из шага 2.1. с использованием вновь произведенных IJ из первого раунда.
   14. Поверхностно-стерилизующий H. bacteriophora IJs
       1. Соберите достаточное количество симбиотических H. bacteriophora и потенциальных аксеновых II путем центрифугирования, чтобы сделать гранулу 100 мкл в центрифужной трубке объемом 1,5 мл.
       2. Добавьте 500 мкл 5% отбеливателя к грануле в каждой микроцентрифужной трубке и инвертируйте. Инкубировать в течение 10 мин. Центрифуга при 17 900 х г в течение 1 мин. Удалите супернатант.
       3. Промыть гранулу 1 мл стерильной воды и повторить центрифугирование. Удалите супернатант. Повторите этот шаг еще четыре раза.
   15. Проверка аксеничности
       1. Пипетка 400 мкл стерильной воды к промытым симбиотическим и кандидато-аксеновым H. bacteriophora nematodes.
       2. Поместите нематод поверх насекомых в чашку Петри и нанесите соответствующую маркировку на обработку.
       3. Поместите чашку Петри с зараженными насекомыми в темноту и периодически проверяйте, не покраснеют ли восковые черви.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Восковые черви, инфицированные H. bacteriophora симбиотическими нематодами, станут красными в течение 2 дней после заражения. Обесцвечивание воскового червя происходит из-за секреции различных соединений, вырабатываемых мутуалистическими бактериями Photorhabdus во время процесса заражения. Отсутствие красного цвета у инфицированных восковых червей через 4 дня после заражения подтверждает, что H. bacteriophora являются аксеновыми. Это связано с тем, что бактерии P. temperata Ret16 не присутствуют в кишечнике нематоды.
   16. Альтернативный метод проверки аксиничности
       1. Поверхностно-стерилизующий симбиотик H. bacteriophora IJs и кандидат-аксенирный H. bacteriophora IJs, как описано на этапе 2.1.14.
       2. Гомогенизируйте приблизительно 500 II в 500 мкл стерильного 1x PBS в микрофьюжных пробирках с использованием стерильных пестиков. Раскрутите гомогенат, декантируйте супернатант и нанесите его на агар LB. Инкубировать пластины при 28 °C в течение 24 ч.
       3. Подсчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ) для каждой пластины. Образцы из axenic H. bacteriophora не образуют никаких колоний симбиотических бактерий P. luminescens .
2. Steinernema carpocapsae Инфекционные молодые особи
   1. Приготовление пластин липидного агара (раствор 300 мл составляет около 20 расщепленных пластин)
      1. Взвесьте 2,4 г питательного бульона, 4,5 г дрожжевого экстракта и 1,5 г агара и добавьте их в 267 мл деионизированной воды. Автоклав решения.
      2. Добавьте 3 мл 1 M MgCl₂, 1,2 мл кукурузного масла и 28,8 мл 7% кукурузного сиропа.
      3. Готовят и добавляют в раствор 300 мкл 30 мг/мл канамицина и 300 мкл 50 мг/мл ампициллина (стерилизуют фильтром 0,2 мкм).
      4. Нанесите смесь на одну половину разделенной чашки Петри / разделенной тарелки.
   2. Препарат X. nematophila (штамм ΔrpoS) бактериального газона
      1. Культивируйте X. nematophila (Xn) ΔrpoS непосредственно из замороженного бактериального чулка в 2 мл раствора LB/кан/амп на шейкер при 30 °C в течение ночи.
      2. Инокулируют 5 мл LB-среды, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл ампициллина, 250 мкл ночной культуры и выращивают бактерии в течение ночи на шейкере.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Бактерии Xn плохо растут при нанесении непосредственно на селекционную липидную агаровую среду из замороженного бульона. При необходимости первичная и вторичная фазы Xn могут быть сначала подтверждены на средах NBTA (питательный агар, дополненный 25 мг бромтимолового синего l⁻¹ и 40 мг трифенилтетразолия хлорида l⁻¹) перед началом свежей жидкой культуры.
      3. Пипетку 100 мкл культуры наносят на пластины липидного агара и распределяют по всей пластине стерильной инокуляционной петлей. Инкубировать пластины в течение 24 ч при 30 °C.
   3. Поверхностно-стерилизующий S. carpocapsae IJs
      1. Оставьте колбу, содержащую IJ, под таким углом, чтобы II опустились в угол колбы. Аспират 1 мл осевших ИД в микроцентрифужную трубку. Центрифуга при 17 900 х г в течение 10 с. Удалите супернатант.
      2. Добавить 1 мл 1% свежеприготовленного отбеливающего раствора. Инвертируйте трубки, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать в течение 1 мин (длительная инкубация отбеливателя приведет к гибели IJ). Вращайте снова в течение 10 с. Удалите супернатант.
      3. Чтобы удалить остатки отбеливателя, промыть нематод 1 мл стерильной дистиллированной воды и центрифугой в течение 10 с. Удалить супернатант. Повторите стирку еще четыре раза.
      4. Оцените количествоIJ на мл, подсчитав 10-20 мкл промытых IJ под стереоскопом и соответствующим образом отрегулируйте концентрацию II.
   4. Выращивание S. carpocapsae IJs
      1. Переложите пипеткой около 1000 IJ на пластины расщепления липидного агара (рисунок 3, левое изображение). Поместите тарелки в увлажненный шкаф или ящик. Используйте влажные бумажные полотенца для увеличения влажности. Выдерживайте плиты при комнатной температуре (22-25 °C).
      2. Проверяйте бумажные полотенца через день, чтобы убедиться, что они остаются влажными. При необходимости добавляйте воду через день в бумажные полотенца для поддержания влажности в шкафу или ящике. Кроме того, поместите водяную баню на дно шкафа, чтобы повысить влажность.
      3. Когда только появятся IJ, добавьте воду на другую сторону пластины и поместите слой фильтровальной бумаги через середину пластины (ловушка для воды, рисунок 3, правый рисунок). Соберите эту воду, содержащую первые круглые IJ, в колбу для культивирования клеток T75. Это круглые I S. carpocapsae нематоды.
      4. Снова стерилизуют поверхность отбеливателем (этап 2.2.3) и повторяют процесс с этапа 2.2 с использованием нематод Round 1 S. carpocapsae . Результатом станет раунд 2 S. carpocapsae nematodes.
      5. Проверяйте под стереоскопом каждые несколько дней, чтобы отслеживать развитие нематод.
   5. Проверка аксенического состояния S. carpocapsae II
      1. Поверхностно-стерилизуйте раунд 1, раунд 2 и симбиотические S. carpocapsae IJ с помощью отбеливателя, как описано в шаге 2.2.3.
      2. Гомогенизируйте приблизительно 400-700 II в микрофьюж-трубках с использованием стерильных пластиковых пестиков. Центрифугируйте гомогенат, декантируйте супернатант и наносите раствор на пластины агара LB. Храните агаровые пластины в инкубаторе при температуре 28 °C в течение 24 ч.
      3. Подсчитайте образование КОЕ для каждой пластины. Образцы аксеновых нематод не будут производить никакого бактериального роста.
   6. Проверка аксенического состояния S. carpocapsae II с помощью ПЦР
      1. Поверхностно-стерилизуйте раунд 1, раунд 2 и симбиотические S. carpocapsae IJ с помощью отбеливателя, как описано в шаге 2.2.3.
      2. Извлеките ДНК из гомогената. Подробная процедура извлечения описана в разделе 4.1.2 ниже.
      3. Проведите ПЦР с помощью праймеров XptA2 с температурой отжига 61 °C:
         XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
         XptA Р: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эти праймеры усиливают инсектицидный ген XptA2 X. nematophila, производя ампликон размером 231 bp. Велосипедная программа была следующей: 95 °C в течение 2 мин, 34 цикла 95 °C в течение 30 с, температура отжига 61 °C в течение 1 мин и 73 °C в течение 1 мин с последующим 72 °C в течение 10 мин.
      4. Визуализируйте усиленные фрагменты путем разделения в 1,5% агарозном геле. Аксеничные поверхностно-стерилизованные образцы не образуют никаких полос.

3. Выращивание H. bacteriophora гермафродитов для микроинъекции

1. Приготовьте тарелки Петри размером 6 см с NA+chol (1,5x питательный бульон, 1,5% агара и 10 мкг/мл холестерина).
2. Готовят 3 мл раствора PP3 (2% протеазы Peptone #3, PP3) в культуральной пробирке объемом 10 мл.
3. Используйте стерильный наконечник 20 мкл, чтобы соскоблить верхнюю часть глицеринового бульона P. luminescens (25% об/об стерильного глицерина), поддерживаемого при -80 °C, и опустить его в культуральную трубку.
4. Инкубируйте трубку в течение ночи в шейкере с контролируемой температурой, установленном при 28 °C, 200 об/мин.
5. На следующий день культура будет светло-красного цвета. Нанесите 50 мкл культуры на чашку Петри размером 6 см NA+chol и распределите ее с помощью бактериального разбрасывателя циркулярным способом.
6. Поместите пластины в инкубатор при температуре 28 °C. Газон P. luminescens будет готов через 24-36 ч и появится светло-красного цвета.
7. Инокулируйте пластину 50-100 поверхностно стерилизованными IJ и поддерживайте пластину при 28 °C.
8. Здоровый гермафродит L4 начнет появляться примерно через 48-54 ч после прививки. Для инъекций требуются здоровые, не голодающие поздние L4 H. bacteriophora hermaphrodites.

4. Получение дцРНК

1. Конструкция грунтовки
   1. Разработка праймеров для дцРНК для нацеливания на ~ 500 экзонных областей пары оснований ДНК H. bacteriophora .
      1. Праймеры для интересующих областей можно определить с помощью Primer3 (https://primer3.ut.ee) или аналогичной программы, выбрав для оптимального произведения длину 500 пар оснований, Tm 60 °C и длину праймера 22 нуклеотида.
      2. Добавьте сайт T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) к 5-дюймовым концам каждого прямого букваря, чтобы обеспечить транскрипцию in vitro.
2. Выделение геномной ДНК
   1. Используйте геномную ДНК, выделенную из замороженных гранул ~ 50 000 H. bacteriophora IJs для синтеза дцРНК.
   2. Используйте гранулу IJ, ресуспендированную в 50 мкл лизисного буфера (50 мМ KCl, 0,05% (мас./об.) желатина, 10 мМ Tris-HCl pH 8,2, 0,45% Tween 20, 60 мкг/мл протеиназы K, 2,5 мМ MgCl₂), помещенную при −80 °C в течение не менее 30 мин.
   3. Гомогенизируйте гранулу небольшим трубчатым пестиком.
   4. Разогреть раствор до комнатной температуры и инкубировать при 60 °С в течение 2 ч, вихря каждые 15 мин.
   5. Денатурировать протеиназу К путем инкубации гомогенизированной ткани в течение 15 мин при 95 °C.
   6. Охладите образец до 4 °C и центрифугу при 3 400 х г в течение 1 мин.
   7. Используйте полученный супернатант в качестве шаблона для последующей ПЦР.
   8. Настройте ПЦР-реакцию 50 мкл с использованием коммерческого мастермикса с 200 нг шаблонной ДНК, 0,2 мкМ прямого и обратного праймера и предложенными производителем условиями циклирования.
   9. Проанализировать реакцию ПЦР на 1,2% агарозном геле, чтобы убедиться, что реакции произвели отдельные полосы прогнозируемого размера.
3. синтез дцРНК
   1. Используйте коммерческий комплект транскрипции.
   2. Используйте ПЦР-реакцию 5 мкл для транскрипции in vitro. Следуйте инструкциям производителя.
   3. Инкубируют реакцию в течение 16 ч при 37 °C.
   4. Очистите реакции транскрипции in vitro коммерческим набором, используя осаждение ацетата аммония / этанола для концентрации дцРНК.
   5. Суспендировать гранулированную дцРНК в 10 мкл воды, не содержащей РНКазы.
   6. Количественно оцените РНК с помощью спектрофотометра.
   7. Оценка качества путем разделения дцРНК на 1,2% агарозном геле

5. Микроинъекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекционная прокладка представляет собой стеклянную крышку со слоем 2% (мас./об.) агарозы по центру. Когда черви, которые будут введены, переносятся в эти прокладки, слой агарозы обездвижит их для процедуры. Как правило, дополнительные прокладки хранятся рядом с микроскопом для общего использования.

1. Подготовка инъекционной прокладки
   1. Вскипятить 2% агарозы в воде, добавив 0,2 г агарозы в 10 мл воды.
   2. Поместите 1-4 капли (~50 мкл) в центр стеклянной крышки толщиной 50 мм x 70 мм.
   3. Используйте еще один обшивку, чтобы сгладить каплю.
   4. Дайте крышке высохнуть в течение 2-3 минут, прежде чем сдвинуть крышку в сторону.
   5. Отметьте буквой «R» правую сторону обращенной вверх крышки.
   6. Дайте горкам высохнуть при комнатной температуре в течение 1 дня перед их использованием.
2. Подготовка инъекционных игл
   1. Используйте стеклянные капилляры толщиной 1,0 мм, содержащие внутреннюю мелкую нить. Это позволяет эффективно заполнять иглу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любой коммерческий съемник игл (например, Narishige PB-7).
   2. Включите съемник иглы.
   3. Убедитесь, что нагреватель установлен на максимум, а соленоид установлен на 8,40, чтобы обеспечить необходимую остроту иглы и правильную длину.
   4. Вставьте капиллярную трубку в верхний гребень ручки через нить и затяните верхнюю ручку. Верхняя часть капиллярной трубки будет равна верхней части съемника иглы, а нагревательная нить будет находиться в середине капилляра.
   5. Переместите нижний блок в верхнюю часть, а затем затяните нижнюю ручку. Убедитесь, что капилляр надежно размещен.
   6. Закройте крышку съемника иглы и нажмите кнопку пуска. Загорится зеленый свет. Через несколько минут капилляр будет нагрет и раздвинут, чтобы разделиться на две половины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две разделенные иглы не имеют одинаковой длины, но их можно использовать для инъекций. Предпочтение отдается более длинным точкам иглы.
   7. Расположите иглы в вертикальном положении их точками вниз с помощью куска лепной глины. Кроме того, храните иглы в чашке Петри, удерживаемой на месте двумя полосками лепной глины.
3. Загрузка иглы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор нуклеиновой кислоты должен быть центрифугирован в течение не менее 10 мин при 20,784 х г гранулированных примесей, которые могут присутствовать в суспензии. Центрифугирование примесей удерживает их от блокирования потока инъекционной иглы.
   1. Используйте любой из двух методов для загрузки нуклеиновых кислот в иглы.
   2. Способ 1
      1. Используйте пипетку для переноса примерно 0,5 мкл центрифугированного образца ДНК на нетянутый конец инъекционной иглы. Это будет выглядеть как крошечная капля жидкости, сидящая поверх капиллярной трубки.
      2. Подождите от 5 до 7 минут, чтобы жидкий образец занял конец иглы. Конечным продуктом будет заполненная игла без пузырьков воздуха.
      3. Используйте рассеченный микроскоп для подтверждения наличия раствора в кончике иглы перед инъекцией.
   3. Способ 2
      1. Используйте загрузочные наконечники для микроинжектора.
      2. Используя этот загрузочный наконечник, пипетку 5 мкл раствора нуклеиновой кислоты.
      3. Пока вытянутая игла находится на съемнике иглы, ослабьте верхнюю ручку, переместите верхнюю вытянутую иглу немного вверх и снова затяните ручку.
      4. Осторожно вставьте наконечник погрузчика в капиллярную трубку и протяните его на дно инъекционной иглы.
      5. Пипетка раствором нуклеиновой кислоты в инъекционную иглу.
      6. Извлеките погрузчик из вытянутой иглы и держите его отдельно для дальнейшей загрузки, если это необходимо. Обязательно переключайте погрузчики при загрузке другой смеси нуклеиновых кислот.
4. Подготовка инъекционного микроскопа
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки червей, микроинъекции и восстановления используется инвертированный микроскоп с рассеянным освещением от основания микроскопа. Описано использование инвертированного микроскопа высокого разрешения с 10x и 40x объективами. Микроскоп оснащен игольчатым манипулятором, который удерживает иглу и приводит ее в положение для инъекции. Микроинъекционное масло используется для предотвращения быстрого обезвоживания червя, находясь на агарозном слое инъекционной прокладки. Предлагаемое масло для использования - Halocarbon Oil 700.
   1. Включите лампу и откалибруйте яркость с помощью панели управления.
   2. Проверьте номер на конденсаторе Wollaston prism; он будет соответствовать используемой цели (40x).
   3. Подтвердите, что башня DIC, обозначенная «DIC», находится в правильном положении.
   4. Убедитесь, что ручка на объективе установлена на ноль (0).
   5. Поверните Ph-кольцо вправо до конца.
   6. Отрегулируйте поляризатор таким образом, чтобы стрелка находилась в горизонтальном положении.
   7. Положите лист бумаги на сцену, чтобы понаблюдать за фокусной точкой (светом).
   8. Закройте полевую диафрагму до такой степени, что на бумаге останется пятно.
   9. Используйте циферблат слева, чтобы переместить конденсатор вверх и вниз до такой степени, что на листе бумаги видно очень острое светлое пятно.
   10. Медленно откройте полевую диафрагму до такой степени, что будет виден небольшой круг света.
   11. Уберите лист бумаги.
   12. Убедитесь, что световое пятно находится в центре цели. В противном случае выровняйте световое пятно с центром объектива, отрегулировав серебряные винты в верхней части конденсатора.
   13. Полностью откройте поле диафрагмы.
   14. Убедитесь, что анализатор ICT/P нажат.
5. Установка инъекционной иглы на микроскоп
   1. Включите поток газообразного азота к микроинъекционной игле. Давление газа к игле будет примерно 20 фунтов на квадратный дюйм.
   2. Проверьте, что ручки микроманипулятора (часть микроскопа, которая перемещает иглу) расположены к центру, что обеспечивает самый широкий диапазон движения при установке иглы.
   3. Открутите узел, который удерживает металлический стержень, чтобы извлечь его из держателя иглы.
   4. Вставьте новую иглу в верхнюю часть микроскопа; затем установите резиновую прокладку, чтобы держать иглу в нужном положении.
   5. Закрепите нижнюю часть игольчатого держателя, прикрепив его к сборке.
   6. Поместите иглу в канавку на микроманипуляторе и прикрутите ее должным образом, чтобы она оставалась устойчивой. Убедитесь, что винт находится примерно в 1 дюйме от конца микроманипулятора.
   7. Поместите кончик иглы в середину поля зрения под углом около 45° по отношению к сценической пластине, используя ручки и грубые элементы управления от микроманипулятора. Очень важно оставить кончик иглы достаточно высоким, чтобы он случайно не сломался.
6. Разрыв игл
   1. Поместите иглу в микроманипулятор, где кончик иглы обычно ломается, чтобы раствор нуклеиновой кислоты протекал через нее.
   2. Разбейте капилляр и положите его поверх стеклянной горки, несущей каплю микроинъекционного масла.
   3. Поместите слайд на микроскоп и сфокусируйтесь.
   4. Доведите кончик иглы до того же уровня, что и сторона капилляра, используя тонкие элементы управления микроскопа (рисунок 4).
   5. Включите поток азота ненадолго, используя ножной привод, чтобы убедиться, что кончик иглы не сломан. Достаточно быстрого включения-выключения.
   6. Осторожно переместите иглу так, чтобы она едва касалась стороны капилляра.
   7. Слегка постучите по боковой части микроскопа, чтобы сломать кончик иглы.
   8. Извлеките иглу из капилляра и включите поток азота, чтобы проверить, что игла сломана должным образом.
   9. Игла создаст небольшую инъекционную каплю примерно в пять раз большую, чем кончик иглы (рисунок 4). Если капля для инъекции меньшего размера, разбейте наконечник дальше. Если инъекционная капля имеет больший размер, попробуйте использовать свежую иглу.

6. Микроинъекция

1. Пипетка каплей микроинъекционного масла на инжекторную прокладку.
2. Окуните пламенно-стерилизованный кирку в каплю масла микроинъекции и соберите молодой H. бактериофора взрослой нематоды из пластинки.
3. Соберите нематод из частей пластины, которые не находятся близко к бактериальному газону, чтобы предотвратить перенос большого количества бактериальных клеток на инъекционную прокладку. Также собирают нематоду с хорошо сформированными гонадами.
4. Переместите нематод на инъекционную площадку и расположите их вертикально так, чтобы гонады были обращены к игле. Убедитесь, что вульва указывает в том же направлении, что и инъекционная игла, а две дистальные руки гонады находятся в противоположном направлении и прижаты к стенке тела нематоды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как и Pristionchus pacificus, гонада H. bacteriophora мигрирует дорсально из положения вентральной вульвы, а затем мигрирует обратно в вентральное положение.
5. Убедитесь, что количество масла достаточно, чтобы предотвратить высыхание нематоды, не позволяя нематоде бродить вокруг.
6. Поместите нематоду в фокус с помощью 10-кратного объектива, удерживая иглу значительно выше слайда. В масле гонады нематод рассматриваются как две четкие области, близкие к передней и задней части червя. Убедитесь, что гонады находятся в фокусе, а не другие части червя.
7. Расположите нематоду под углом от 15° до 45° в сторону инъекционной иглы, что даст больше пространства игле внутри гонады. Кроме того, такой подход предотвращает прохождение иглы через все тело нематоды, когда игла вводится внутрь гонады.
8. Расположите инъекционную иглу и нематоду на одном уровне, постепенно опуская иглу до тех пор, пока она не будет доведена до фокуса (рисунок 5). Убедитесь, что по мере опускания иглы она остается рядом с нематодой, а не над червем.
9. Используйте объектив 40x, чтобы сосредоточиться на синцитиальном гонадном плече нематоды.
10. Перемещайте иглу вверх и вниз с помощью тонкого регулятора, пока наконечник не окажется в фокусе вместе с синцитиальной рукой нематоды.
11. Медленно перемещайте нематоду к игле, используя скользящую ступень. Затем осторожно прижмите гонаду в положение иглой к стенке тела нематоды, что приведет к эффективному проникновению иглы внутрь тела нематоды.
12. Кратко наступайте на ножной привод, чтобы запустить поток раствора нуклеиновой кислоты. Достаточно быстрого включения-выключения. Если игла находится внутри гонады, гонад наполнится раствором и набухнет.
13. Как только игла будет обеспечена в правильном положении, заполните гонаду раствором нуклеиновой кислоты до тех пор, пока руки гонады не будут заполнены. Важно избегать изгнания жидкости из червя через отверстие, где игла проколола его.
14. Используя скользящую ступень, осторожно отодвиньте червя подальше от иглы.
15. Поднимите иглу и поверните ее против часовой стрелки.
16. Поместите каплю 1x буфера PBS поверх червя, чтобы он плавал.
17. Используйте пламенно-стерилизованную кирку, чтобы поднять червя и поместить его в другую каплю M9 на свежей семенной пластине P. luminescens , чтобы избавить червя от избытка масла.
18. Удалите нематоду из M9 и поместите ее на дальнюю сторону бактериального газона.
19. Используйте одну и ту же пластину для переноса нескольких введенных нематод.
20. Через 2-3 дня оценивают первое поколение (F1) нематод для трансгенного фенотипа. Разделите трансгенные нематоды F1 на отдельные пластины, чтобы определить, какие черви будут генерировать стабильные трансгенные линии.

Результаты

Для оценки состояния нематод H. bacteriophora , прошедших аксенизацию, было определено наличие или отсутствие бактериальных колоний P. luminescens в II. Для этого была собрана гранула из примерно 500 IJ, которые ранее были стерилизованы и гомогенизированы в PBS. Положительное контрольное лечени...

Обсуждение

Понимание молекулярной основы энтомопатогенной нематодной инфекции и иммунитета насекомых против нематод требует отделения паразитов от мутуалистически связанных бактерий 13,15,16. Энтомопатогенные нематоды H. bacteriophora и S. carpocapsae<...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicillin	Fisher Scientific	611770250
Cell culture flask T25	Fisher Scientific	156367
Cell culture flask T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Corn oil	VWR	470200-112
Corn syrup	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Culture tube 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Falcon tube 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet Microinjector	Eppendorf	5252000021
Filter paper	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco	-
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700	Sigma	H8898
Inoculating loop	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope	Microscope Central	-
MacConkey medium	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Microcentrifuge tube	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Needle syringe	VWR	BD305155	22G
Nutrient broth	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm	VWR	52858-076
Partitioned Petri dish	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers	Azenta	-
Pestle	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Petri dish 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
Proteose Peptone #3	Thermo Fisher Scientific	211693
Yeast extract	Millipore-Sigma	Y1625