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Neste Artigo

  • Resumo
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  • Protocolo
  • Resultados
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  • Agradecimentos
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  • Referências
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Resumo

Os nematoides entomopatômicos vivem em simbiose com bactérias e, juntos, infectam com sucesso insetos, minando seu sistema imunológico inato. Para promover pesquisas com base genética na infecção por nematoides, são descritos métodos de manutenção e manipulação genética de nematoides entomopatômicos.

Resumo

Nematoides entomopatômicos nos gêneros Heterorhabditis e Steinernema são parasitas obrigatórios de insetos que vivem no solo. A principal característica de seu ciclo de vida é a associação mutualista com as bactérias Photorhabdus e Xenorhabdus, respectivamente. Os parasitas nematoides são capazes de localizar e entrar em hospedeiros de insetos adequados, subverter a resposta imune do inseto e multiplicar-se eficientemente para produzir a próxima geração que irá ativamente caçar novas presas de insetos para infectar. Devido às propriedades de seu ciclo de vida, nematoides entomopatômicos são agentes de controle biológico popular, que são usados em combinação com inseticidas para controlar pragas destrutivas de insetos agrícolas. Simultaneamente, esses nematoides parasitas representam uma ferramenta de pesquisa para analisar a patogenicidade nematoide e hospedar respostas anti-nematóides. Esta pesquisa é auxiliada pelo desenvolvimento recente de técnicas genéticas e abordagens transcriômicas para entender o papel de moléculas secretas de nematoide durante a infecção. Aqui, um protocolo detalhado sobre a manutenção de nematoides entomopatômicos e o uso de um procedimento de knockdown genético é fornecido. Essas metodologias promovem ainda mais a caracterização funcional dos fatores de infecção por nematoides entomopatômicos.

Introdução

As pesquisas sobre nematoides entomopatômicos (EPN) têm se intensificado nos últimos anos devido principalmente à utilidade desses parasitas em estratégias integradas de manejo de pragas e seu envolvimento em pesquisas biomédicas básicas 1,2. Estudos recentes estabeleceram a EPN como organismos modelo para examinar os componentes genéticos do nematoide que são ativados durante os diferentes estágios do processo de infecção. Essas informações fornecem pistas críticas sobre a natureza e o número de moléculas secretadas pelos parasitas para alterar a fisiologia hospedeira e desestabilizar a resposta imune inata d....

Protocolo

1. Produção de infanto-juvenis simbióticos

  1. Cubra uma placa de Petri (10 cm) com um pedaço de papel filtro e adicione aproximadamente 10-15 larvas de Galleria mellonella (Figura 1A).
  2. Usando uma pipeta, dispense 2 mL de água contendo cerca de 25-50 IJs por suspensão de 10 μL nos vermes de cera. Guarde a placa de Petri em um armário em temperatura ambiente.
  3. Dependendo da umidade do papel filtro, adicione 1-2 mL de água a cada 2 dias. Vermes de cera infectados com IJs normalmente morrerão dentro de 48 h.
  4. Prepare as armadilhas de água de White aproximadamente 10 dias após os ver....

Resultados

Para avaliar o estado dos nematoides de H. bacteriophora que passaram pela axenização, foi determinada a presença ou ausência de colônias bacterianas de P. luminescens em IJs. Para isso, foi coletada uma pelota de aproximadamente 500 IJs que haviam sido esterilizados e homogeneizados anteriormente na PBS. O tratamento de controle positivo consistia em uma pelota de aproximadamente 500 IJs da cultura nematoide contendo bactérias simbióticas P. luminescens . As pelotas de nematoides de con.......

Discussão

Compreender a base molecular da infecção entomopatômica e imunidade anti-nematode de insetos requer a separação dos parasitas das bactérias mutuamente associadas 13,15,16. Os nematoides entomopatômicos H. bacteriophora e S. carpocapsae vivem junto com as bactérias Gram-negativas P. luminescens e X. nematophila, respectivamente17. Ambas as espécies bacterianas t.......

Divulgações

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington pela leitura crítica do manuscrito. Todas as figuras gráficas foram feitas usando BioRender. Pesquisa no I.E., J.H., e D. O'H. laboratórios têm sido apoiados pela Universidade George Washington e pela Columbian College of Arts and Sciences facilitando fundos e Fundos de Pesquisa Interdisciplinar.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseVWR97062-244
Ambion Megascript T7 KitThermo Fisher ScientificAM1333
AmpicillinFisher Scientific611770250
Cell culture flask T25Fisher Scientific156367
Cell culture flask T75Fisher Scientific156499
ChoiceTaq MastermixDenville ScientificC775Y42
Corn oilVWR470200-112
Corn syrupMP Biomedicals/VWRIC10141301
Culture tube 10 mLFisher Scientific14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader TipsEppendorfE5242956003
EthanolMillipore-SigmaE7023
Falcon tube 50 mLFisher Scientific14-432-22
Femtojet MicroinjectorEppendorf5252000021
Filter paperVWR28320-100
Galleria mellonella waxormsPetco-
Glass coverslipFisher Scientific12-553-46450 x 24 mm
Halocarbon Oil 700SigmaH8898
Inoculating loopVWR12000-806
KanamycinVWR97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-31.0 mm
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB agar miller powder 500 g
LB BrothFisher ScientificBP1426-500LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research MicroscopeMicroscope Central-
MacConkey mediumMillipore-SigmaM7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up KitThermo Fisher ScientificAM1908
Microcentrifuge tubeVWR76332-0641.5 ml
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-2000
Needle syringeVWRBD30515522G
Nutrient brothMillipore-Sigma70122-100G
ParafilmVWR52858-076
Partitioned Petri dishVWR490005-212
PBSVWR97062-732Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primersAzenta-
PestleMillipore-SigmaBAF199230001Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cmVWR25384-09260 x 15 mm
Petri dish 10 mmVWR10799-19235 x 10 mm
Proteose Peptone #3Thermo Fisher Scientific211693
Yeast extractMillipore-SigmaY1625

Referências

  1. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  2. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophi....

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Imunologia e Infec oProblema 181nematoides entomopat micosHeterorhabditisSteinernemaparasitismointera es hospedeira parasita

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