Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Resumo

Os nematoides entomopatômicos vivem em simbiose com bactérias e, juntos, infectam com sucesso insetos, minando seu sistema imunológico inato. Para promover pesquisas com base genética na infecção por nematoides, são descritos métodos de manutenção e manipulação genética de nematoides entomopatômicos.

Resumo

Nematoides entomopatômicos nos gêneros Heterorhabditis e Steinernema são parasitas obrigatórios de insetos que vivem no solo. A principal característica de seu ciclo de vida é a associação mutualista com as bactérias Photorhabdus e Xenorhabdus, respectivamente. Os parasitas nematoides são capazes de localizar e entrar em hospedeiros de insetos adequados, subverter a resposta imune do inseto e multiplicar-se eficientemente para produzir a próxima geração que irá ativamente caçar novas presas de insetos para infectar. Devido às propriedades de seu ciclo de vida, nematoides entomopatômicos são agentes de controle biológico popular, que são usados em combinação com inseticidas para controlar pragas destrutivas de insetos agrícolas. Simultaneamente, esses nematoides parasitas representam uma ferramenta de pesquisa para analisar a patogenicidade nematoide e hospedar respostas anti-nematóides. Esta pesquisa é auxiliada pelo desenvolvimento recente de técnicas genéticas e abordagens transcriômicas para entender o papel de moléculas secretas de nematoide durante a infecção. Aqui, um protocolo detalhado sobre a manutenção de nematoides entomopatômicos e o uso de um procedimento de knockdown genético é fornecido. Essas metodologias promovem ainda mais a caracterização funcional dos fatores de infecção por nematoides entomopatômicos.

Introdução

As pesquisas sobre nematoides entomopatômicos (EPN) têm se intensificado nos últimos anos devido principalmente à utilidade desses parasitas em estratégias integradas de manejo de pragas e seu envolvimento em pesquisas biomédicas básicas ^1,2. Estudos recentes estabeleceram a EPN como organismos modelo para examinar os componentes genéticos do nematoide que são ativados durante os diferentes estágios do processo de infecção. Essas informações fornecem pistas críticas sobre a natureza e o número de moléculas secretadas pelos parasitas para alterar a fisiologia hospedeira e desestabilizar a resposta imune inata d

Protocolo

1. Produção de infanto-juvenis simbióticos

1. Cubra uma placa de Petri (10 cm) com um pedaço de papel filtro e adicione aproximadamente 10-15 larvas de Galleria mellonella (Figura 1A).
2. Usando uma pipeta, dispense 2 mL de água contendo cerca de 25-50 IJs por suspensão de 10 μL nos vermes de cera. Guarde a placa de Petri em um armário em temperatura ambiente.
3. Dependendo da umidade do papel filtro, adicione 1-2 mL de água a cada 2 dias. Vermes de cera infectados com IJs normalmente morrerão dentro de 48 h.
4. Prepare as armadilhas de água de White aproximadamente 10 dias após os ver

Resultados

Para avaliar o estado dos nematoides de H. bacteriophora que passaram pela axenização, foi determinada a presença ou ausência de colônias bacterianas de P. luminescens em IJs. Para isso, foi coletada uma pelota de aproximadamente 500 IJs que haviam sido esterilizados e homogeneizados anteriormente na PBS. O tratamento de controle positivo consistia em uma pelota de aproximadamente 500 IJs da cultura nematoide contendo bactérias simbióticas P. luminescens . As pelotas de nematoides de con...

Discussão

Compreender a base molecular da infecção entomopatômica e imunidade anti-nematode de insetos requer a separação dos parasitas das bactérias mutuamente associadas 13,15,16. Os nematoides entomopatômicos H. bacteriophora e S. carpocapsae vivem junto com as bactérias Gram-negativas P. luminescens e X. nematophila, respectivamente¹⁷. Ambas as espécies bacterianas t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicillin	Fisher Scientific	611770250
Cell culture flask T25	Fisher Scientific	156367
Cell culture flask T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Corn oil	VWR	470200-112
Corn syrup	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Culture tube 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Falcon tube 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet Microinjector	Eppendorf	5252000021
Filter paper	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco	-
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700	Sigma	H8898
Inoculating loop	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope	Microscope Central	-
MacConkey medium	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Microcentrifuge tube	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Needle syringe	VWR	BD305155	22G
Nutrient broth	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm	VWR	52858-076
Partitioned Petri dish	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers	Azenta	-
Pestle	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Petri dish 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
Proteose Peptone #3	Thermo Fisher Scientific	211693
Yeast extract	Millipore-Sigma	Y1625