Mikroakışkan Teknoloji ile Yüksek Açık Gözenekli Mikrosferlerin ( HOPM'ler ) Üretilmesi

Özet

Bu protokol, tek emülsiyon formülasyonuna dayalı kolay mikroakışkan teknolojisi ile poli(laktik-ko-glikolik asit) bazlı yüksek açık gözenekli mikrosferlerin (HOPM'ler) üretimini açıklamaktadır. Bu mikrosferlerin doku mühendisliği ve ilaç taramasında potansiyel uygulamaları vardır.

Özet

Toplu iskeleler ve tek başına hücrelerin doğrudan enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, enjekte edilebilir modüler üniteler, hücrelerin paketlenmesindeki kolaylık, gelişmiş hücre tutma ve minimum invazivlik nedeniyle arızalı dokuların onarımında büyük ilgi görmüştür. Dahası, bu mikro ölçekli taşıyıcıların gözenekli konformasyonu, orta değişimi artırabilir ve besin ve oksijen kaynaklarının seviyesini artırabilir. Bu çalışma, hücre dağıtım uygulamaları için kolay mikroakışkan teknolojisi ile poli(laktik-ko-glikolik asit) bazlı yüksek açık gözenekli mikrosferlerin (PLGA-HOPM'ler) uygun şekilde üretilmesini göstermektedir. Ortaya çıkan monodispers PLGA-HOPM'lar, ~400 μm'lik parçacık boyutlarına ve birbirine bağlı pencerelerle ~50 μm'lik açık gözeneklere sahipti. Kısaca,% 7.5 (w / v) jelatin sulu faz ile sarılmış emülsifiye yağ damlacıkları (diklorometan, DCM'deki PLGA çözeltisi), özelleştirilmiş mikroakışkan kurulumdaki koaksiyel nozul aracılığıyla% 1 (w / v) sürekli akan poli (vinil alkol) (PVA) sulu çözeltiye sokulmuştur. Daha sonra, mikrosferler çözücü ekstraksiyonu ve liyofilizasyon prosedürlerine tabi tutuldu ve bu da HOPM'lerin üretilmesiyle sonuçlandı. Özellikle, çeşitli formülasyonlar (PLGA ve porojen konsantrasyonları) ve işleme parametreleri (emülsifiye edici güç, iğne göstergesi ve dağınık fazın akış hızı), ortaya çıkan PLGA HOPM'ların niteliklerinde ve özelliklerinde çok önemli roller oynamaktadır. Dahası, bu mimariler, genişletilmiş ilaç keşfi ve doku rejenerasyonu uygulamaları için büyüme faktörleri gibi çeşitli diğer biyokimyasal ipuçlarını potansiyel olarak kapsülleyebilir.

Giriş

Hücre yüklü mikrosferler, in situ hücre tutma kapasitesinin artması, hücrelerin verimli bir şekilde verilmesi ve ardından in vivo¹ hücre çoğalmasının kabiliyeti gibi olumlu avantajlar sunar. Bugüne kadar, doku rejenerasyonu veya ilaç tarama uygulamaları için hücreler için elverişli bir ortamı desteklemek üzere başarılı bir iskele yapısı geliştirmek için çok sayıda araştırma yapılmıştır². Bununla birlikte, hipoksi ortamı, yetersiz besin / oksijen kaynağı ve metabolik atık birikimi nedeniyle iç mekanlarda çoğu zaman kaçınılmazdır³. Bu sorunların üstesinden gelmek için, çeşitli biyomalzemeler kullanılarak yüksek gözenekli mikrosferler (PM'ler) geliştirilmiştir ^4,5,6. Ek olarak, dinamik kültürde, iskeleler aşırı kesme gerilmesi^7'den muzdariptir ve kültür ortamının dengesiz durumu PM'lerin doğruluğunu bozabilir. Alternatif olarak, dinamik kültür¹ için iyi mekanik mukavemete sahip PM'leri işlemek için poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) kullanılabilir. Örneğin, hacimsel kas kaybını iyileştirmek için fare miyoblastı (C2C12) yüklü PLGA yüksek derecede açık PM'ler (HOPM'ler) ve insan göbek damarı endotel hücresi (HUVEC) yüklü poli (etilen glikol) içi boş mikroçubukların birlikte enjeksiyonunu gösterdik ve in situ iskelet kası rejenerasyonunda kayda değer bir iyileşme sağladık⁸.

Özellikle, PM'ler geniş yüzey alanları ve yüksek gözeneklilikler ile karakterizedir, bu da minimal invaziv hücre dağıtımına yönelik hücre yapışması ve büyümesi için özel bir ilgi alanıdır⁹. Bu hususlar ışığında, PMs^10,11'in imalatında çeşitli biyouyumlu malzemeler kullanılmıştır. Hücrelerle birlikte kültürlenmiş bu tasarlanabilir PM'ler, hasarlı dokuların onarımı için hücre proliferasyonunu artırabilecek mükemmel yapışma, önemli mekanik mukavemet ve yüksek oranda birbirine bağlı pencereler sunar¹². Bu bağlamda, gözenekli küreleri imal etmek için çeşitli teknolojiler de geliştirilmiştir^13,14. Bir yandan, PM'ler, yetersiz ara bağlantı^15,16,17 nedeniyle kısıtlanan NH₄HCO₃ gibi gaz oluşturucu ajanlar kullanılarak üretildi. Öte yandan, PM'ler emülsifikasyondan sonra doğrudan kesildi ve bu da PM'lerin^18'ini polidisperse etmesine yol açtı. Sonunda, emülsiyon-şablonlama yaklaşımına dayanan damlacık mikroakışkan teknolojisi, PM'leri oluşturmak için belki de etkili bir yöntemdir, çünkü genellikle tek tip boyutlu parçacıklar¹⁹ ile sonuçlanır. Özellikle, mikrosferlerin morfolojik özellikleri genellikle üretilen emülsiyon damlacıklarının kalitesine bağlıdır (yani, yağda su, W / O veya su içinde yağ, O / W), bu da biyomalzemelerin özelliklerini önemli ölçüde etkileyebilir²⁰. Önceden tasarlanmış mikroakışkan platformun mikrofiberleri veya mikrosferleri üretmek için uygulanabileceğini belirtmek gerekir. Bir örnekte, Yu ve ark., doğal dokuları taklit etmek için hücresel ağları bir araya getirmek için kullanılabilecek kılcal bazlı mikroakışkan platformlara dayanan hücre yüklü mikrofibröz yapıların üretimini göstermiştir²¹. Başka bir örnekte, Ye ve ark. silika kolloidal kristal boncukların mikroakışkan teknolojiler aracılığıyla şablon replikasyonu ile fotonik kristal mikrokapsüller ürettiler, bu da karmaşık etiketleme ve spesifik aparat gerektiren mevcut tekniklerin birçok sınırlamasının üstesinden gelebilir²².

Gerçekten de, bu tekniğin kullanılmasının ardındaki mantık, doğada kolay olması, sofistike ekipman gerektirmemesi ve hücre dağıtımı ve rejeneratif tıp uygulamaları için tek tip boyutlu PM'lerin sentezlenmesindeki kolaylık gibi çeşitli avantajlardan kaynaklanmaktadır. Bu bağlamda, emülsiyon-şablonlamanın önceden tasarlanmış bileşenleri ile, yüksek gözenekliliğe ve birbirine bağlanabilirliğe sahip PM'ler, poli(vinil klorür) (PVC) borudan, bir cam kılcal damardan ve bir iğneden monte edilmiş mikroakışkan bir cihazdan kolayca elde edilebilir. Bir W/O emülsiyon öncüsü, sulu bir jelatin çözeltisi ve organik bir PLGA çözeltisi homojenize edilerek hazırlanır. Emülsiyonun uygulanabilir kısmını seçici olarak mikroakışkan platforma enjekte ederek, homojen partikül boyutlarına ve yüzey boyunca iç mekana birbirine bağlı gözeneklere sahip PM'ler üretilir. Mevcut protokol, PLGA-HOPM'ları mikroakışkan platformda emülsiyon-şablonlama ile üretmeyi amaçlamaktadır. Bu protokolün PLGA-HOPM'ların tekrarlanabilir üretimine izin verdiğine ve potansiyel olarak ilgili doku mühendisliği ve ilaç tarama alanlarında uygulanabilir olacağına inanılmaktadır.

Protokol

1. Çözeltilerin hazırlanması

1. PVA stok çözeltisini, PVA çözeltisini 80 °C'lik bir su banyosunda ısıtarak ve daha sonra 4 °C'de buzdolabına yerleştirerek önceden hazırlayın. Deneysel kullanım için oda sıcaklığına (RT) soğutun.
2. Sulu jelatin çözeltisini (1 mL,% 7.5, w / v) PLGA'nın organik fazına (2 mL,% 2, diklorometan, DCM'de w / v) ekleyerek emülsiyon öncüsünü hazırlayın (bkz.
   NOT: Genel olarak, mikroakışkan teknolojisi, mikrosferleri oluşturmak için farklı aşamalar içerir. Sürekli veya toplama fazı sulu bir poli (vinil alkol) içerir (PVA, 600 mL,% 1, w / v).

2. Damlacık mikroakışkan cihaz montajı ve PLGA-HOPM'ların imalatı

NOT: Bu montaj için gerekli sarf malzemeleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Damlacık jeneratörü tertibatını özelleştirin.
   1. Bir cam kılcal damar (OD, 1 mm), PVC tüpler (ID, 1 mm) ve 26 G dağıtım iğnesi kullanarak bir ko-akışlı mikroakışkan jeneratör oluşturun.
   2. Cam kılcal damarı PVC borunun ucuna bağlayın ve ardından yukarıdaki yapının bağlantısında bir iğne ile delin.
   3. PVC borunun diğer ucunu damlacık üretimi sırasında sürekli faza yerleştirin. UV yapıştırıcı kullanarak, kürlemeden sonra eklemdeki boşlukları kapatın.
      NOT: PVC boruda uygun delme için iğnenin yaklaşık 45 ° kavisli bükülmesi ve iğne noktasının koaksiyel yapıyı oluşturmak için kılcal boruya gerilmesi gerekir.
2. Damlacık mikroakışkan platformunu hazırlayın.
   1. Şekil 1'de gösterildiği gibi iki şırınga pompası kullanın. Sürekli fazı yüklemek için 50 mL'lik bir şırınga ve emülsiyon oluşumu için 5 mL'lik bir şırınga kullanın.
   2. Sürekli ve dağılım fazlarının akış hızlarını sırasıyla 2 mL / dak ve 0.08 mL / dak olarak ayarlayın.
   3. Bir buz banyosuna 500 mL'lik bir beher yerleştirin ve önceden soğutulmuş bir PVA sulu çözelti ile doldurun (adım 1.1).
      NOT: Cam kılcal damarın ucu toplama aşamasına daldırılmalıdır. Platformda emülsiyon-damlacık oluşumundan sonra toplama fazının süpernatanının cam çubukla karıştırılması (1 saat, 60 rpm) önerilir. Emülsiyon damlacıkları iğne ucunda üretilir. Genel olarak, iğnenin göstergesi, daha küçük göstergenin PM'lerin daha küçük boyutuna karşılık geldiği PM'lerin boyutunu etkiler. Ayrıca, gözenek çapı esas olarak porojen konsantrasyonu ile ilişkilidir ve uygun jelatin konsantrasyonu¹ ile artabilir.
3. Emülsifikasyon ve damlacık oluşumunu gerçekleştirin.
   1. Aşağıdaki adımları izleyerek emülsiyonu hazırlayın.
      1. Sulu jelatin çözeltisini PLGA'nın DCM çözeltisine (adım 1.2) derhal boşaltarak ve ultrasonik cihazı kullanarak emülsifiye ederek emülsiyonu hazırlayın (bkz.
      2. Ultrasonik gücü 400 W'a ayarlayın ve probun konumunu manuel olarak sürekli değiştirmenin eşlik ettiği toplam işlem süresini 90 s (aralık 2 s, ultrasonik tedavi 1 s) olarak ayarlayın.
      3. Şırınga emme ve damlacık üretimi için elde edilen emülsiyonu yaklaşık 20 dakika içinde stabilize edin.
         NOT: Ultrasonik hücre kırıcının probunu yağ-su arayüzüne yerleştirin. Ultrasonik probun konteynere temas etmesine izin verilmemesi önerilir.
   2. Damlacık oluşumunu gerçekleştirin.
      1. Ultrasonik tedaviden sonra mikroakışkan platformun 5 mL şırıngasında hazırlanan emülsiyonu (adım 2.3.1) hızla yükleyin.
      2. Kararsız W/O emülsiyonunu (faz ayırma sırasında) süreksiz faz olarak mikroakışkan cihaza sokun. Aynı zamanda, PVA'nın sulu çözeltisini sürekli faz olarak kullanın.
      3. Emülsiyonun uygun kısımlarını mikroakışkan cihaza enjekte ettikten sonra toplama kabının altındaki emülsiyonu içeren mikrosferleri (PVA,% 1, w / v) toplayın.
      4. Daha fazla stabilizasyon için numuneyi gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin.
   3. Aşağıdaki adımları izleyerek hazırlanan mikrosferleri (PLGA-HOPM'ler) durulayın ve liyofilize edin.
      NOT: Üretilen PLGA-HOPM'lar iç ve yüzeyde keyfi gözenekler içerir.
      1. RT'ye normalleştirmeden önce mikrosferleri 4 ° C'de saklayın ve artık DCM'yi ortadan kaldırmak için bir cam çubukla (1 saat, 60 rpm) karıştırın.
      2. 500 mL beherdeki toplama fazını dikkatlice filtreleyin ve PM'lerin yüzeyindeki artık PVA'yı yıkamak için toplanan mikrosferleri üç kez deiyonize suyla yıkayın.
      3. PLGA omurgasına sarılmış jelatini eritmek için PLGA mikrosferlerini 37 °C su banyosuna 30 dakika boyunca yerleştirin.
      4. Elde edilen PLGA-HOPM'ları, artık jelatini çıkarmak için deiyonize su ile iki kez durulayın ve 24 saat boyunca -80 ° C'de liyofilizasyon için ön soğutun.
      5. Daha fazla deney için kuru PLGA-HOPM'leri -20 °C'de saklayın.

3. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleme

1. PLGA-HOPM'ları RT'de SEM'in numune aşamasına yatırın (bkz. Malzeme Tablosu) ve numune aşamasını magnetron püskürtücünün püskürtme hücresine koyun. Transformatörü ve magnetronu tek tek açın. Numuneyi 1 dakika boyunca altınla püskürtüldükten sonra SEM'e verin.
2. Hızlanma voltajını 5 kV'a ayarlayarak SEM görüntülerini elde edin.
3. Ek olarak, PLGA-HOPM'ların partikül boyutunu, SEM görüntülemenin değişken alanında 100 PM kullanarak ölçün. Gözenek boyutu dağılımını ölçmek için temsili sonucu ölçün.
   1. Grafikleri Resim J ile açın ve SEM görüntüsünün ölçek çubuğunu eşleştirmek için "düz çizgiyi" kullanın, bu da yazılımın pikseli uzunluğa kadar tanımlamasını sağlar.
   2. Analiz et > ölçek ayarla'ya tıklayın, SEM görüntüsünün ölçek çubuğuna "bilinen mesafeyi" ayarlayın ve genel > Tamam'a tıklayın.
   3. PLGA PM'lerin gözenek veya partikül boyutunu ölçmek için analiz > Araçları > YG yöneticisi... üzerine tıklayın ve ekle'ye tıklayın. Gereksinime göre numune sayısını ölçün.
   4. Daha fazla hesaplama için grafiklerin nicel verilerini elde etmek için Ölçü'ye tıklayın.

4. Hücre kültürü ve floresan görüntüleme

NOT: Bu çalışmada sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC) kullanılmıştır. Hücreler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamındaki hücreleri L-glutamin (DMEM / F-12),% 10 (v / v) fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye etti. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_{2'de inkübe edin}.
2. Sıçan BMSC'lerini, birleşmenin% 90'ına ulaştıktan sonra 1: 2 oranında geçirin.
3. Aşağıdaki adımları izleyerek hücre yapışması gerçekleştirin.
   1. PLGA-HOPM'ları etil alkol (5 mL, %70, v/v) ile inkübe edin ve sterilize etmek için RT'de 10 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın.
   2. Sterilize edilmiş PLGA-HOPM'ları fosfat tampon çözeltisi ile iki kez yıkayın.
   3. PLGA-HOPM'lara BMSC'lerin yapışması için dinamik kültür altında steril bir santrifüj tüpünde (⁵⁰ mL) hücre süspansiyonu (5 mL, 1 x 10 5 hücre/mL) ile HOPM'ları (beş sayıda) inkübe edin.
   4. Dinamik kültürü, çalkalayıcıya kapalı bir 50 mL santrifüj tüpü yerleştirerek termostatik bir aseptik çalkalayıcıda (37 °C, 90 rpm) gerçekleştirin (bkz.
      NOT: Dinamik kültür, PM'leri ve hücreleri doğrudan plastik plaka üzerine inkübe etmek yerine, BMSC'lerin iskelelerdeki yapışma oranını arttırmayı amaçlamaktadır. Hücreler ve PLGA PM'ler 50 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne eklenir, tüpü termostatik bir aseptik çalkalayıcıda (37 ° C, 90 rpm) inkübe eder ve ortamı her 2 günde bir değiştirir.
4. Canlı ve ölü çift leke testini gerçekleştirin.
   1. PLGA-HOPM'lara bağlanmadan BMSC'leri salınım yapmak için hücre yüklü PM'leri üç kez durulayın.
   2. Hücre yüklü PM'leri 35 mm'lik cam alt plakaya yerleştirin. PBS tarafından önceden yıkanmış numuneye sırasıyla 1 μL kalsein-ve propidiyum iyodür (PI) dahil olmak üzere 1 mL boyama tamponu ekleyin (bkz.
   3. Örnekleri konfokal lazer tarama mikroskobu ile değerlendirin (bkz. İlgili dedektörde 488 nm ve 552 nm uyarma ışığını açın. Z-bindirme analizi için, mikroskopun z ekseni hareketi ile numunenin farklı katmanlarını yakalamak için z-genişliğini ayarlayın.
      NOT: Diğer lekelerin analiz için uygun şekilde kullanılabileceğini belirtmek gerekir.

Sonuçlar

Ana parametreler^1'i optimize eden önceki çalışmalara dayanarak, PLGA buharlaştırılabilir DCM çözücü içinde çözüldü. Birincil W / O emülsiyonu, ultrasonik prob tedavisi altında jelatin ile homojenize edilerek hazırlanmıştır. Özelleştirilmiş ko-akışlı akışkan yapı, akışları sürekli olarak tanıtmak için bir şırınganın kullanıldığı basit bir şekilde monte edildi. Ayrıca, PLGA mikrosferlerinin PVA ve jelatinini ortadan kaldırmak için yeterli durulama pro...

Tartışmalar

Bu makalede, PLGA-HOPM'ler gibi PLGA tabanlı mimariler üretmek için etkili bir strateji açıklanmaktadır. PLGA'nın çözücü uçuculuğundan kaçınmak ve emülsiyonun hazırlanması sırasında ultrasonik gücün hedef konuma nazikçe ayarlanması da dahil olmak üzere birkaç kritik adımın dikkatlice atılması gerektiğine dikkat edilmelidir. Ek olarak, 20 mL şırınganın sıvı çıkışı, emülsifiye öncüllerin faz ayrımını çözmek için belirli bir dereceye kadar ayarlanabilir. Bununla birlikte, b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100