通过微流控技术 制造 高度开放的多孔微球（HOPM）

摘要

本协议描述了通过基于单乳液配方的简单微流体技术制造基于聚（乳酸-共乙醇酸）的高度开放多孔微球（HOPMs）。这些微球在组织工程和药物筛选中具有潜在的应用。

摘要

与单独的散装支架和直接注射细胞相比，可注射的模块化单元由于细胞包装的便利性、改善的细胞保留和最小的侵入性，在修复故障组织方面引起了极大的兴趣。此外，这些微尺度载体的多孔构象可以增强培养基交换，提高营养和氧气供应水平。本研究说明了通过简单的微流控技术方便地制造聚（乳酸-乙醇酸）基高开孔微球（PLGA-HOPMs）用于细胞递送应用。所得的单分散PLGA-HOPMs具有~400 μm的粒径和~50 μm的开孔，具有相互连接的窗口。简而言之，用7.5%（w / v）明胶水相包裹的乳化油滴（二氯甲烷中的PLGA溶液，DCM）通过定制的微流体装置中的同轴喷嘴引入1%（w / v）连续流动的聚乙烯醇（PVA）水溶液中。随后，对微球进行溶剂萃取和冻干程序，从而产生HOPM。值得注意的是，各种配方（PLGA和致孔剂的浓度）和加工参数（乳化能力、针规和分散相流速）对所得PLGA HOPM的质量和特性起着至关重要的作用。此外，这些架构可能潜在地封装各种其他生化线索，如生长因子，用于扩展药物发现和组织再生应用。

引言

载细胞微球具有有利的优势，例如增强细胞原位保留能力、细胞高效递送以及随后的体内细胞增殖能力 ¹.迄今为止，已经提出了许多研究，以开发成功的支架结构，以支持细胞的有利环境，用于组织再生或药物筛选应用²。然而，由于营养/氧气供应不足和代谢废物积累，室内的缺氧环境往往是^{不可避免的3。}为了克服这些问题，已经使用各种生物材料^开发了高孔微球（PM）4，^5，6。此外，在动态培养中，支架承受过多的^{剪切应力7}，培养基的不稳定状态可能会破坏PM的保真度。 或者，聚乳酸-乙醇酸（PLGA）可用于处理具有良好机械强度的PMs，用于动态培养¹。例如，我们展示了小鼠肌母细胞（C2C12）载重PLGA高度开放PMs（HOPMs）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）负载聚乙二醇空心微棒的共同注射，以治愈体积肌肉损失，实现了原位骨骼^肌再生的显着改善8。

值得注意的是，PM具有大表面积和高孔隙率的特点，这对于细胞粘附和微创^{细胞递送的}生长特别感兴趣9。鉴于这些方面，已经采用了各种生物相容性材料来制造PM^10，11。这些与细胞共培养的可设计PM具有出色的粘附力，可观的机械强度和高度互连的窗口，可以改善细胞增殖以修复受损组织¹²。在这方面，还开发了各种技术来制造多孔球^体13，14。一方面，PM是使用气体形成剂生产的，例如NH₄HCO₃，由于互连性不足而受到限制¹⁵，^16，17。另一方面，PM在乳化后直接剪切，导致多分散^PMs18。最后，基于乳液模板方法的液滴微流控技术可能是构建PM的有效方法，因为它通常会产生均匀大小的颗粒¹⁹。值得注意的是，微球的形态属性通常取决于生成的乳液液滴的质量（即油包水，W/O或水包油，O/W），这可能显著影响生物材料的属性²⁰。值得注意的是，预先设计的微流控平台可用于产生微纤维或微球。在一个实例中，Yu等人展示了基于毛细管的微流体平台的细胞负载微纤维结构的产生，可用于组装细胞网络以模拟天然组织²¹。在另一实例中，Ye等人通过微流控技术通过二氧化硅胶体晶体珠的模板复制来制备光子晶体微胶囊，这可以克服当前技术的许多限制，这些技术需要复杂的标记和特定的设备²²。

事实上，使用这种技术背后的理由是由于各种优点，例如本质上是简单的，不需要复杂的设备，以及它在合成用于细胞递送和再生医学应用的统一尺寸的PM方面的便利性。在这种情况下，使用预先设计的乳液模板组件，可以从由聚氯乙烯（PVC）管，玻璃毛细管和针组装的微流体装置中方便地获得具有高孔隙率和互连性的PM。W/O乳液前驱体是通过均质化明胶水溶液和PLGA有机溶液制备的。通过将乳液的适用部分选择性地注入微流体平台，可以制造出具有均匀粒径和整个表面到内部相互连接的孔隙的PM。本协议旨在通过在微流体平台中乳液模板来制造PLGA-HOPM。据信，该协议允许PLGA-HOPM的可重复生产，并且可能适用于其组织工程和药物筛选的相关领域。

研究方案

1. 溶液的制备

1. 通过在80°C水浴中加热PVA溶液，然后将其放入4°C的冰箱中，提前制备PVA储备溶液。 冷却至室温 （RT） 以供实验使用。
2. 通过将明胶水溶液（1mL，7.5%，w / v）添加到PLGA的有机相（2mL，2%，w/v二氯甲烷，DCM）中来制备乳液 - 前体（参见 材料表）。
   注意:通常，微流体技术涉及形成微球的不同相。连续相或收集相包括水性聚乙烯醇（PVA，600mL，1%，w/v）。

2. 液滴微流控器件组装与PLGA-HOPM的制备

注: 此组件所需的消耗品列在 材料表中。

1. 自定义液滴发生器组件。
   1. 使用玻璃毛细管（外径，1 毫米）、PVC 管（内径，1 毫米）和 26胶针构建一个同流微流体发生器。
   2. 将玻璃毛细管连接到PVC管的末端，然后在上述结构的连接处用针刺穿。
   3. 在液滴产生过程中，将PVC管的另一端置于连续相中。使用UV胶，固化后密封接头处的间隙。
      注意:针头需要弯曲约45°，以方便在PVC管处穿孔，并将针尖拉伸到毛细管中以形成同轴结构。
2. 准备液滴微流体平台。
   1. 使用两个注射泵，如图 1所示。使用 50 mL 注射器加载连续相，使用 5 mL 注射器形成乳液。
   2. 将连续相和分散相的流速分别设置为 2 mL/min 和 0.08 mL/min。
   3. 将500 mL烧杯放入冰浴中，并用预冷的PVA水溶液填充（步骤1.1）。
      注意:玻璃毛细管的末端必须浸入收集阶段。建议在平台中形成乳液液滴后，用玻璃棒搅拌（1小时，60rpm）收集相的上清液。乳液液滴在针尖尖端产生。通常，针的规格会影响PM的大小，其中较小的规格对应于较小的PM尺寸。此外，孔径主要与致孔剂浓度相关，能够随着明胶浓度^的适当增加1而增加。
3. 进行乳化和液滴生成。
   1. 按照以下步骤制备乳液。
      1. 通过立即将明胶水溶液倒入PLGA的DCM溶液（步骤1.2）并使用超声装置乳化来制备乳液（参见 材料表）。
      2. 将超声波功率调整为400 W，并将总处理时间设置为90 s（间隔2 s，超声波处理1 s），同时不断手动更改探头的位置。
      3. 在大约20分钟内稳定所得乳液以进行注射器抽吸和液滴生成。
         注意: 将超声波电池断路器的探头放在油水界面中。建议不要让超声波探头接触容器。
   2. 执行液滴生成。
      1. 超声处理后，将制备的乳液（步骤2.3.1）快速装入微流体平台的5mL注射器中。
      2. 将不稳定的W / O乳液（在相分离过程中）作为不连续相引入微流体装置中。同时，使用PVA的水溶液作为连续相。
      3. 将适当部分的乳液注入微流体装置后，将含有乳液的微球收集在收集烧杯底部（PVA，1%，w / v）。
      4. 将样品置于4°C过夜以进一步稳定。
   3. 按照以下步骤冲洗并冻干制备的微球（PLGA-HOPMs）。
      注意: 生成的 PLGA-HOPM 在内部和表面上包含任意孔隙。
      1. 在归一化为室温之前将微球储存在4°C，并通过玻璃棒（1小时，60rpm）搅拌以消除残留的DCM。
      2. 小心过滤500 mL烧杯中的收集相，并用去离子水洗涤收集的微球三次，以洗去PM表面残留的PVA。
      3. 将PLGA微球置于37°C水浴中30分钟，以溶解包裹在PLGA骨架中的明胶。
      4. 用去离子水冲洗所得的PLGA-HOPM两次以除去残留的明胶，并在-80°C下预冷冻干24小时。
      5. 将干燥的PLGA-HOPM储存在-20°C以进行进一步实验。

3. 扫描电子显微镜（SEM）成像

1. 在室温下将PLGA-HOPM沉积在SEM的样品台上（参见 材料表），并将样品台放入磁控溅射的溅射池中。逐个打开变压器和磁控管。在溅射镀金1分钟后将样品引入SEM。
2. 通过将加速电压设置为 5 kV 来获取 SEM 图像。
3. 此外，在SEM成像的可变场中使用100 PM量化PLGA-HOPM的粒径。测量代表性结果以量化孔径分布。
   1. 用图像J打开图形，使用"直线"匹配SEM图像的比例尺，使软件识别像素到长度。
   2. 单击 分析>设置比例，将"已知距离"设置为SEM图像的比例尺，然后单击 全局>确定。
   3. 单击" 分析>工具">ROI管理器... 以测量PLGA PM的孔隙或粒径，然后单击 添加它。根据要求测量样品数量。
   4. 单击 测量 以获取图形的定量数据以进行进一步计算。

4. 细胞培养和荧光成像

注:大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）用于本工作。这些细胞是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 在补充有L-谷氨酰胺（DMEM/F-12）、10%（v/v）胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养细胞。将细胞在37°C和5%CO₂下孵育。
2. 达到汇合的90%后，以1:2的比例传代大鼠BMSC。
3. 按照以下步骤进行细胞粘附。
   1. 将PLGA-HOPM与乙醇（5mL，70%，v / v）孵育，并在室温下以500× g 离心10分钟以灭菌。
   2. 用磷酸盐缓冲溶液洗涤灭菌的PLGA-HOPM两次。
   3. 在动态培养下，将 HOPM（数量为 5 个）与细胞悬液（5 mL，1 x 10⁵ 个细胞/mL）一起在无菌离心管 （50 mL） 中孵育，以确保 BMSC 对 PLGA-HOPM 的粘附。
   4. 通过在摇床中放置密封的50mL离心管，在恒温无菌摇床（37°C，90rpm）中进行动态培养（参见 材料表）。
      注意:动态培养旨在提高BMSC在支架上的粘附率，而不是直接将PM和细胞孵育到塑料板上。将细胞和PLGA PM加入50mL无菌离心管中，在恒温无菌摇床（37°C，90rpm）下孵育管，每2天更换一次培养基。
4. 进行活体和死体双染色测定。
   1. 冲洗装有细胞的 PM 三次，以洗脱 BMSC，而不会附着在 PLGA-HOPM 上。
   2. 将装有细胞的PM放在35毫米玻璃底板上。向PBS预洗样品中加入1 mL染色缓冲液（参见 材料表），包括1 μL钙黄绿素-AM和碘化丙啶（PI）。
   3. 通过共聚焦激光扫描显微镜评估样品（见 材料表）。在相应的检测器上打开 488 nm 和 552 nm 的激发光。对于z覆盖分析，设置z宽度以通过显微镜的z轴移动捕获样品的不同层。
      注意:值得注意的是，其他污渍可以适当地用于分析。

结果

基于先前优化主要参数¹的工作，将PLGA溶解在可蒸发的DCM溶剂中。用明胶在超声探针处理下均质制备初级W/O乳液。定制的共流流体结构被简单组装，其中使用注射器不断引入流动。此外，进行了充分的冲洗程序以消除PLGA微球的PVA和明胶（图1A，补充图1A，B）。随后，通过SEM成像观察了PLGA-HOPM的形态属性。结果表明，PLGA-HOPMs具有大尺寸（350-500 μm...

讨论

本文介绍了一种制造基于 PLGA 的架构（即 PLGA-HOPM）的有效策略。需要注意的是，必须谨慎采取几个关键步骤，包括避免PLGA的溶剂挥发以及在乳液制备过程中将超声功率温和调整到目标位置。此外，20 mL注射器的液体出口可以在一定程度上调节，以解决乳化前体的相分离。然而，一个限制是，由于致孔剂的状态受环境温度的影响，乳液的稳定性可能是不希望的。总之，液滴微流控平台的便捷组装可...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100