Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu protokol, moleküler motorlar ve pasif çapraz bağlayıcılar tarafından bağlanan bir filament ağının davranışını araştırmak için Açık Kaynak hücre iskeleti simülasyonu olan Cytosim'in nasıl kullanılacağını gösterir. Çapraz bağlayıcıların sayısını değiştirmek ve ortaya çıkan ağ sözleşmesini çizmek için adım adım talimatlar içeren genel bir iş akışı izlenir.
Birçok hücre iskeleti sistemi, kesin kantitatif modellemelerine izin verecek kadar iyi bilinmektedir. Mikrotübül ve aktin filamentleri iyi karakterize edilmiştir ve ilişkili proteinlerin yanı sıra bollukları ve bu elementler arasındaki etkileşimler de sıklıkla bilinir. Bu nedenle, bilgisayar simülasyonları, sistemin kolektif davranışını, deneylere tamamlayıcı bir şekilde hassas bir şekilde araştırmak için kullanılabilir. Cytosim, moleküler motorlar gibi ilişkili proteinlerle birlikte büyük esnek filament sistemlerini işlemek için tasarlanmış bir Açık Kaynak hücre iskeleti simülasyon paketidir. Ayrıca pasif çapraz bağlayıcıları, yayılabilir çapraz bağlayıcıları, nükleatörleri, kesicileri ve yalnızca bir filament üzerindeki boş kafes bölgelerine basan motorların ayrı versiyonlarını simüle etme imkanı sunar. Diğer nesneler, hücredeki kromozomları, çekirdeği veya vezikülleri temsil etmek için kullanılabilecek küresel veya daha karmaşık geometri sunarak filamentleri tamamlar.
Cytosim, bir simülasyonu çalıştırmak ve sonuçlarını görüntülemek için çok yönlü ve programlama becerisi gerektirmeyen basit komut satırı araçları sunar. Bu iş akışında, i) gerekli ortamı yeni bir bilgisayara kurmak, ii) Cytosim'i bir 2D aktomiyosin ağının kasılmasını simüle edecek şekilde yapılandırmak ve iii) sistemin görsel bir temsilini oluşturmak için adım adım talimatlar verilir. Daha sonra, sistem sistematik olarak bir anahtar parametre değiştirilerek incelenir: çapraz bağlayıcıların sayısı. Son olarak, sistemin görsel temsili, bir grafikte kasılmanın sistemin bileşimine nasıl bağlı olduğunu görmek için kasılmanın sayısal olarak ölçülmesiyle tamamlanır. Genel olarak, bu farklı adımlar, hücre iskeleti alanındaki diğer birçok sorunun üstesinden gelmek için birkaç değişiklikle uygulanabilen tipik bir iş akışı oluşturur.
Hücre iskeleti, hücre içindeki filamentlerden ve genellikle dikkate değer mekanik özelliklere sahip dinamik bir ağ oluşturan moleküler motorlar gibi ilişkili moleküllerden oluşur. Hücre iskeleti, hemen hemen tüm yaşam formlarında farklı hücre tiplerinde çeşitli konfigürasyonlarda bulunur. Doğru çalışması, bölünme, hareketlilik ve polarizasyon gibi temel hücresel süreçler için gereklidir. Aynı zamanda hücreden hücreye mekanik etkileşimleri yönetir, böylece dokuların ve organizmaların morfogenezini etkiler. Hücre iskeleti çeşitli işlevlerin temelini oluşturur ve birçok biyolojik süreçte kendini gösterir. Örneğin, kasların kasılması, miyozin moleküler motorlarının aktin filamentleri üzerindeki güç vuruşu ile bağlantılıdır. Başka bir örnek, kinesin motorlarının bu nöronların aksonlarının içinde bulunan mikrotübüller boyunca hareketlerine dayanan nöronların bakımıdır. Aktin ve mikrotübüller, iki önde gelen hücre iskeleti filamenti türüdür ve onlarsız, bildiğimiz şekliyle yaşam imkansız olurdu.
Hücre iskeleti esasen sadece kimyasına indirgenemeyen biyomekanik bir sistemdir. Mikrotübüller veya aktin filamentleri binlerce monomerden yapılır ve birkaç mikrometreden fazla uzanır. Bu filamentlerin uzaydaki konformasyonları ve plazma zarına, çekirdeğe veya diğer organellere iletebilecekleri kuvvetler, hücredeki rollerinin kilit yönleridir. Örneğin, aktomiyosin korteks1 olarak adlandırılan bir aktin filamentleri ve miyozin motorları ağı, hayvan hücrelerinde hücre hareketliliğini ve morfolojik değişiklikleri sürdürmek için kuvvetler üretir. Kortikal mikrotübüllerin selüloz fibrillerinin birikimini yönlendirdiği ve böylece hücre duvarı mimarisini kontrol ettiği ve sonuçta bu hücrelerin gelecekte nasıl büyüyeceğini belirleyen bitki hücrelerinde çok farklı bir düzenleme görülür2.
Mekanik, hücre iskeleti operasyonlarında açıkça önemli bir rol oynarken, kimya da aynı derecede önemlidir. Filamentler, monomerlerin sitoplazma3 boyunca yayıldıktan sonra filamentin ucunda kenetlenme yerlerini buldukları kendi kendine birleşme işlemiyle büyür. Moleküler ölçekte, filamentlerin ucundaki montaj ve sökme, bu nedenle, moleküler yakınlıklar4 ile belirlenir. Benzer şekilde, hücre iskeletinin proteinleri yayılır ve bağlanma ve bağlanmama oranları, karşılaştıkları filamentlere olan afinitelerini belirler. Moleküler motorlar söz konusu olduğunda, ATP hidrolizini içeren kimyasal reaksiyon döngüleri, filamentler boyunca hareketlere ve muhtemelen onlara eşlik eden kuvvetlere bağlıdır5. Dikkat çekici bir şekilde, hücre iskeleti birçok olağandışı zorluk ve benzer bileşenleri içeren çok çeşitli süreçler sunar. Biyoloji, kimya ve fizik arasındaki arayüzde zengin bir oyun alanıdır.
Hücre iskeleti sistemleri matematiksel modellemeye uygundur. Aslında, son yıllarda yapılan mükemmel araştırmalar sayesinde, endositoz6 ile gösterildiği gibi, ana moleküler bileşenler büyük olasılıkla zaten tanımlanmıştır. Maya gibi model organizmalarda, bu elementlerin özellikleri ve bazı süreçleri için sistem bileşimi bilinmektedir. Örneğin, mikrotübüllerin7 yapısı ve malzeme özelliklerinin yanı sıra mitotik iğin çeşitli aşamalarındaki sayıları ve ortalama uzunlukları açıklanmıştır8. Mikrotübülleri tutarlı bir mekanik yapıya bağlayan kinesinlerin sayısı genellikle bilinmektedir9. Birçok motorun hızları in vitro10 olarak ölçülmüştür. Ek olarak, deneyciler bu sistemleri vahşi tip veya mutasyona uğramış koşullar altında in vivo olarak gözlemleyebilir ve ölçebilirler. Teoriyi in vivo ve in vitro deneylerle birleştirmek, araştırmacıların bir hücre iskeleti sistemi hakkındaki mevcut bilginin gözlemlenen davranışını açıklamak için yeterli olup olmadığını test etmelerini sağlar. Matematiksel ve hesaplama araçlarının kullanımı, genellikle basitleştirilmiş durumlarda (örneğin, tek moleküllü deneyler) moleküler ölçekteki gözlemlerden türetilen varsayımlar temelinde bileşenlerin toplu olarak nasıl çalıştığına dair çıkarımlar yapmamıza da olanak tanır.
Teorinin rolü pratik bir örnek kullanılarak gösterilebilir: kirpiklerin dövülmesi. Bu dayak, dynein motorlarının kirpiklerdeki mikrotübüller boyunca hareketinden kaynaklanmaktadır. Bu sistemde dynein motorunun hızını neyin belirlediği sorulabilir. Olası bir cevap, maksimum hızın belirli bir vuruş modelini sürdürme gerekliliği ile sınırlandırılmasıdır. Dayak doğal seleksiyon altında olsaydı bu anlaşılabilir olurdu. Bu durumda, motorlar daha hızlı hareket ederse, süreç istenen niteliklerini kaybeder - kirpikler o kadar verimli bir şekilde atmaz ve hatta tamamen başarısız olur. Bu mümkün olsa da, ikinci bir alternatif, bazı içsel faktörlerin dynein'in hızını sınırlayabilmesidir.
Örneğin, hücre, dynein'i daha hızlı hale getirmek için yeterli ATP'ye sahip olmayabilir veya dynein'in aktivitesi için gerekli protein hareketleri hızlandırılamayabilir. Bu durumda, fiziksel sınırlara rağmen motorlar daha hızlı yapılabilseydi, vuruş iyileştirilirdi. Üçüncü bir olasılık, elbette, hızı değiştirmenin süreci önemli ölçüde etkilememesidir, bu da kontrol edilemeyen faktörlere karşı bir miktar "sağlamlık" sağlayarak organizma için avantajlı olabilir. Bu üç olasılık arasında, dynein'in özelliklerinden vuruş modeli hesaplanarak doğru olanı belirlenebilir. Gerçekten de, uygun bir matematiksel model, vuruş modelinin değişen dynein hızından nasıl etkilendiğini ve fiziksel dünyada var olan sınırlara tabi olmadığını tahmin etmelidir. Doğal olarak, modelin geçerliliği doğrulanmalıdır, ancak "yanlış" modeller bile ilginç fikirler üretebilir.
Model, analitik bir çerçeve şeklini alabilir veya sistemin sayısal bir simülasyonu olabilir. Her iki durumda da, moleküler ölçek ile fonksiyonel ölçek arasındaki boşluk bir engel olmaya devam etmektedir ve bu modelleri geliştirmek basit bir iş değildir, çünkü biyolojik sistemi tanımlayan denklemlere birkaç mekanik ve kimyasal işlemin entegre edilmesi gerekir. Teori, basitlik ve gerçekçilik arasında farklı ödünleşimler sunan çeşitli biçimlerde gelir. Bir modeldeki detayların derecesini artırmak, denklemleri çözme veya başka bir deyişle teorinin tahminlerini türetme yeteneğimizi sınırlayabileceğinden her zaman avantajlı değildir. Aynı değiş tokuş simülasyonlar için de geçerlidir. Modelleyiciler, belirli yönleri göz ardı ederken dikkate alınacak sistemin bileşenlerini seçmek zorunda kalacaklar. Bu önemli kararlar, çalışmanın amacına büyük ölçüde bağlı olacaktır. Günümüzde, bilgisayar donanımındaki olağanüstü gelişmeler, birçok hücre iskeleti sistemini, bağlantılarını analiz etmek için yeterli bir süre boyunca yeterli ayrıntıyla simüle etmeyi mümkün kılmaktadır. Bu genellikle araştırmada beklenmedik fikirler ve yeni yönler üretecektir. Örneğin, bu protokolde kullanılacak olanlara benzer simülasyonlar, bir ağın11 bileşimine dayalı olarak kasılmalarını tahmin edebilen bir zarf arkası hesaplamasına yol açtı.
Sayısal yöntemler mühendislik ve fizik bilimlerinde her yerde bulunur ve biyolojide kullanımları artmaktadır. Bugün, neredeyse tüm teknolojik whatchamacallit'lerimiz (saatler, telefonlar, arabalar ve bilgisayarlar) ilk olarak bir bilgisayarda tasarlandı ve bunu yapmak için güçlü yazılımlar var. İyi karakterize edilmiş bir hücre iskeleti sistemi göz önüne alındığında ve uygun bir tanımlama seviyesinin belirlendiği varsayılarak, simüle edilmeden önce birkaç sorunun çözülmesi gerekir. En basit problemler için en uygun hareket yolu, "sıfırdan kodlayarak" bir simülasyon yazmak, başka bir deyişle jenerik bir programlama dili veya MATLAB gibi matematiksel bir platformdan başlamak olabilir. Bu, kodun yazarının neyin uygulandığına dair ayrıntılı bir bilgiye sahip olması ve yazılımın tam olarak nasıl çalıştığını bilmesi avantajına sahiptir. Bununla birlikte, bu rota risksiz değildir ve doktora öğrencilerinin çalışma zamanlarının çoğunu bilimsel soruları ele almak yerine kod yazarak geçirdiklerine tanık olmak nadir değildir.
Alternatif, başkaları tarafından tasarlanan yazılımı kullanmaktır, ancak bu da risksiz değildir; Herhangi bir büyük kaynak kodu, yazarlarının bunu önlemek için en takdire şayan çabalarına rağmen, aşılmaz bir kara kutunun özelliklerini kendiliğinden edinme eğilimindedir. Kara kutuları kullanmak kesinlikle bir bilim insanının hayali değildir. Büyük bir kaynak kodu da bir yükümlülük haline gelebilir ve sıfırdan başlamak, mevcut bir kod tabanını farklı bir şey yapmak için değiştirmekten daha hızlı olabilir. Bu sorunu hafifletmek için, yazılımın yazarlarını her zaman yardıma davet edebilirsiniz, ancak bu yeterli olmayabilir. Sıklıkla, yazılımın yazarları ile onu kullanmak isteyen kişiler arasında bir bilimsel kültür farkı vardır, bu da birçok örtük varsayımın açıklığa kavuşturulması gerektiği anlamına gelir. Kodu Açık Kaynak haline getirerek, yazılımın geliştirilmesine daha fazla kişinin dahil olması ve belgelerini sürdürmesi, böylece kalitesinin artması beklenmektedir. Tüm bunlar, herhangi bir yatırım yapılmadan önce uygun şekilde değerlendirilmesi gereken önemli konulardır. Bununla birlikte, uzun vadede ilerlemenin tek yolu, ortak bilimsel çıkarlara sahip geniş bir topluluk tarafından kullanılan ve sürdürülen sağlam yazılım çözümlerini teşvik etmektir.
Bu protokol Cytosim kullansa da, aynı sistemi simüle edebilecek başka Açık Kaynak araçları da vardır, örneğin, AFINES12, MEDYAN13, CyLaKS14, aLENS15 ve AKYT16 bunlardan birkaçıdır. Ne yazık ki, bu projeleri karşılaştırmak makalenin kapsamı dışındadır. Burada, kasılmalı bir 2D aktomiyosin ağını simüle etmek için adım adım talimatlar verilmiştir. Bu sistem basittir ve Cytosim'in daha iyi kurulmuş kapasitelerinden yararlanır. Cytosim, simülasyonları 2D veya 3D olarak çalıştırabilen platformlar arası bir çekirdek motor etrafında inşa edilmiştir. Modüler bir kod tabanına sahiptir, bu da belirli görevleri gerçekleştirmeyi kolayca özelleştirilebilir hale getirir. Sitozim, 3D'de eşit derecede kararlı ve verimlidir ve geçmişte mikrotübülleri ve aktin filamentlerini içeren çeşitli sorunları araştırmak için başarıyla kullanılmıştır: iki mikrotübül asterinin17 birleşmesi, hücrelerdeki çekirdeklerin hareketi18,19, endositoz6, sitokinez20, mitotik iğinoluşumu 21, mitotik iğinhareketleri 22, Kromozomların23 yakalanması, aktomiyosin ağlarının11,24 kasılması ve kan trombositlerindeki25 mikrotübül halkasının mekaniği ve bu projeler için geliştirilen kapasiteler kodda korunmuştur. Burada açıklanan iş akışı diğer birçok soruna uyarlanabilir. Bazı okuyuculara yabancı olabilecek Unix komut satırını kullanır. Bununla birlikte, komut satırını kullanmak, simülasyonları çalıştırma sürecini otomatikleştirmenin en taşınabilir ve kullanışlı yoludur. Entegre grafik kullanıcı arayüzleri, bir yazılıma kolay ve sezgisel erişim sağlamayı amaçlar, ancak bu genellikle genellik pahasına gelir. Bu makalenin amacı, kolayca değiştirilebilecek veya diğer sorunlara uyarlanabilecek bir yaklaşımı göstermektir. Komutların anlamını açıklamak için notlar verilmiştir.
Bir aktomiyosin ağını simüle etmek için, filamentler yönlendirilmiş çizgiler olarak modellenir ve uzunlukları boyunca dağılmış köşelerle temsil edilir (Şekil 1). Bu, polimer fiziğinde yaygın olan, filamentlerin gerçek 3D doğasını göz ardı eden ancak bükülmenin hesaplanmasına izin veren bir ara açıklama seviyesidir. Filamentler, hem aktin hem de mikrotübül fenomenolojisini kapsayan farklı modelleri izleyerek uçlarında büyüyebilir ve küçülebilir. Hücrelerde, filamentler öncelikle hareketlerini kısıtlayan etkileşimler yoluyla düzenlenir, örneğin, diğer filamentlere bağlanma veya basitçe hücre içinde hapsedilme. Cytosim'de, tüm bu etkileşimler doğrusallaştırılır ve büyük bir matristebirleştirilir 26. Tüm filament köşelerinin hareketini tanımlayan denklemler, viskoz bir ortam ve Brown hareketini temsil eden rastgele dalgalanan terimler varsayılarak bu matristen türetilir. Bu denklemler, filamentlerin hareketini, üzerlerine etki eden tüm kuvvetlerle birlikte kendi kendine tutarlı ve verimli bir şekilde elde etmek için sayısal olarak çözülür26. Bu mekanik motorun üzerine bindirilmiş, moleküler motorların takılması ve ayrılması veya filamentlerin montaj dinamikleri gibi ayrı olayları simüle eden stokastik bir motor vardır. Özetle, Cytosim ilk olarak herhangi bir keyfi şekilde bağlanan bir filament ağının mekaniğini hesaplamak için simüle edilmiş dinamikleri kullanır ve ikinci olarak, filamentleri birbirine bağlayan veya etkileyen proteinlerin bağlanmasını, çözülmesini ve difüzyonunu simüle etmek için stokastik yöntemler kullanır.
Burada gösterilen iş akışı, başlangıçta Cytosim kullanan bir sistemi keşfetmek için sıklıkla takip edildi. Birçok potansiyel kullanıcı için kritik adım, muhtemelen yazılım bileşenlerinin yüklenmesi olacaktır. Yazılımın bir kaynak kodu olarak dağıtılması, Açık Bilim'in zorunluluklarını yerine getirir, ancak yazılımın geliştiricilerinin programı test etmek için yalnızca sınırlı bir mimari havuzuna erişimi olduğundan hatalara eğilimlidir. İşletim sistemleri farklı olduğu için derleme başarısız olabilir. Burada verilen talimatların, bilgisayar sistemleri ve kaynak kodları geliştikçe eski hale gelmesi muhtemeldir. Bu nedenle, en son talimatları çevrimiçi olarak periyodik olarak kontrol etmek çok önemlidir. Sorun olması durumunda, kullanıcıların sorunu çözmeye yardımcı olmak için ilgili geri bildirim kanalında (şu anda Cytosim'in Gitlab'daki ana sayfası) gönderi paylaşarak geri bildirimde bulunmaları şiddetle tavsiye edilir.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
NOT: Protokol şu adımlardan oluşur: Windows 10, MacOS ve Linux için platform hazırlığı; Cytosim'in kurulumu; simülasyon ve test çalışmasının ve grafik gösterimin konfigürasyonu; bir parametreyi değiştiren çoklu çalıştırmalar: ağdaki çapraz bağlayıcıların sayısı; kasılmanın çapraz bağlayıcı sayısından nasıl etkilendiğini görmek için bir grafik oluşturmak; paralel çalışmalar; ve rastgele örnekleme. ">" dan sonraki tüm metinler, terminal penceresine kelimesi kelimesine girilmesi gereken komutlardır. ">" terminal istemini temsil eder ve dahil edilmemelidir, ancak diğer tüm karakterler önemlidir.
1. Platform hazırlığı
NOT: İşletim sistemine (MacOS, Windows 10 veya Linux) bağlı olarak adım 1.1, adım 1.2 veya adım 1.3'ü izleyin.
2. Cytosim'in Kurulumu
NOT: Bu adımlar herhangi bir işletim sistemi için benzerdir: MacOS, WSL ve Linux. Aşağıdaki bölümde, terminalde komutlar verilecek ve "mevcut çalışma dizini" simülasyonun derlendiği dizine ayarlanmalıdır. Bu dizin, temel dizin olarak anılacaktır. Alternatif olarak, dosyalar gerektiği gibi kopyalanırsa her şey ayrı bir dizinde yapılabilir. Komut satırına aşina değilseniz, örneğin https://www.learnenough.com/command-line-tutorial veya https://learnpythonthehardway.org/book/appendixa.html gibi bir öğreticiyi takip etmeyi düşünün.
3. Simülasyonun yapılandırılması
4. Parametre taraması
NOT: Bu bölümde, ağdaki çapraz bağlayıcıların sayısı sistematik olarak değiştirilmiştir.
5. Bir grafik yapmak
NOT: Bu bölümde, parametre taramasının sonuçlarından bir çizim yapılır.
6. Bir grafik yapmak için alternatif yöntem
7. Rastgele örnekleme kullanılarak geliştirilmiş çizim
NOT: Burada bir değişken, Python'un "rastgele" modülünden bir jeneratör işlevi kullanılarak örneklenmiştir.
8. Tam otomatik boru hattı
NOT: Bu kısımda manuel müdahale gerektiren tüm işlemler yerini komutlar almıştır. Bu yapıldığında, tüm adımları otomatik olarak gerçekleştiren tek bir komut dosyası yazmak mümkün olacaktır. Bu betik, işlem grubu gibi uzak bir bilgisayarda çalıştırılabilir.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
2. bölümde, Cytosim'in "make" kullanılarak başarılı bir şekilde derlenmesi, "bin" alt dizininde sim, play ve report üretmelidir. Adım 2.3'ün çıktısı ("sim bilgisi"), diğer şeylerin yanı sıra "Boyut: 2"yi göstermelidir. 3. bölümde, yapılandırma dosyası Ek Dosya 1 olarak sağlanan jove.cym'e benzer olmalıdır. Bölüm 4'te, simülasyonlardanadım 4.8'de elde edilen büyücüler, Şekil 2'de
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Bu makalede özetlenen yöntem, açıklanan protokol boyunca çeşitli şekillerde kullanılan üç küçük ve bağımsız Python programına dayanır. İlk komut dosyası ön yapılandırması , özel Python komut dosyaları yazma ihtiyacının yerini alabilecek çok yönlü bir araçtır27. Tek bir şablon dosyasından birden çok yapılandırma dosyası oluşturmak için kullanılır, hangi parametrenin değiştirilmesi gerektiğini ve nasıl değişt...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
SLCU modelleme kulübü üyelerine, özellikle Tamsin Spelman, Renske Vroomans, Cameron Gibson, Genevieve Hines ve Euan Smithers'a ve protokolün diğer beta test kullanıcıları Wei Xiang Chew, Daniel Cortes, Ronen Zaidel-Bar, Aman Soni, Chaitanya Athale, Kim Bellingham-Johnstun, Serge Dmitrieff, Gaëlle Letort ve Ghislain de Labbey'e teşekkür ederiz. Gatsby Charitable Foundation (Grant PTAG-024) ve Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC Synergy Grant, proje 951430) destek alıyoruz.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
A personal computer | MacOS, Windows 10 or Linux | ||
config.cym.tpl | template configuration file; https://gitlab.com/f-nedelec/cytosim.git | ||
jove.cym | Cytosim configuration file | ||
make_page.py | Python script; https://github.com/nedelec/make_page.py | ||
preconfig | Python script; https://github.com/nedelec/preconfig | ||
scan.py | Python script; https://github.com/nedelec/scan.py |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır