JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол демонстрирует, как использовать Cytosim, симуляцию цитоскелета с открытым исходным кодом, для исследования поведения сети филаментов, соединенных молекулярными моторами и пассивными сшивающими агентами. Общий рабочий процесс с пошаговыми инструкциями используется для изменения количества сшивающих агентов и построения графика результирующей сократимости сети.

Аннотация

Многие цитоскелетные системы в настоящее время достаточно хорошо известны, чтобы обеспечить их точное количественное моделирование. Микротрубочки и актиновые филаменты хорошо охарактеризованы, и часто известны связанные с ними белки, а также их распространенность и взаимодействие между этими элементами. Таким образом, компьютерное моделирование может быть использовано для точного исследования коллективного поведения системы таким образом, чтобы это дополняло эксперименты. Cytosim — это набор для моделирования цитоскелета с открытым исходным кодом, предназначенный для работы с большими системами гибких филаментов с соответствующими белками, такими как молекулярные моторы. Он также дает возможность моделировать пассивные сшивающие агенты, диффузионные сшивающие агенты, нуклеаторы, резаки и дискретные версии двигателей, которые наступают только на незанятые участки решетки на нити накала. Другие объекты дополняют филаменты, предлагая сферическую или более сложную геометрию, которая может быть использована для представления хромосом, ядра или везикул в клетке.

Cytosim предлагает простые инструменты командной строки для запуска моделирования и отображения его результатов, которые универсальны и не требуют навыков программирования. В этом рабочем процессе даются пошаговые инструкции: i) установить необходимую среду на новый компьютер, ii) настроить Cytosim для имитации сжатия 2D-сети актомиозинов и iii) создать визуальное представление системы. Затем система прощупывается путем систематического изменения ключевого параметра: количества сшивающих агентов. Наконец, визуальное представление системы дополняется численной количественной оценкой сократимости, чтобы увидеть на графике, как сократительная способность зависит от состава системы. В целом, эти различные этапы представляют собой типичный рабочий процесс, который может быть применен с небольшими изменениями для решения многих других проблем в области цитоскелета.

Введение

Цитоскелет состоит из нитей внутри клетки и связанных с ними молекул, таких как молекулярные моторы, которые часто представляют собой динамическую сеть с замечательными механическими свойствами. Цитоскелет существует в различных конфигурациях в разных типах клеток почти у всех форм жизни. Его правильное функционирование имеет важное значение для фундаментальных клеточных процессов, таких как деление, подвижность и поляризация. Он также управляет межклеточными механическими взаимодействиями, тем самым влияя на морфогенез тканей и организмов. Цитоскелет лежит в основе нескольких функций и проявляется во многих биологических процессах. Например, сокращение мышц связано с мощным ударом молекулярных моторов миозина по актиновым филаментам. Другим примером является поддержание нейронов, которое основано на движении кинезиновых моторов вдоль микротрубочек, расположенных внутри аксонов этих нейронов. Актин и микротрубочки являются двумя выдающимися типами цитоскелетных филаментов, и без них жизнь, которую мы знаем, была бы невозможна.

Цитоскелет по своей сути является биомеханической системой, которая не может быть сведена исключительно к его химии. Микротрубочки или актиновые филаменты построены из тысяч мономеров и простираются на несколько микрометров. Конформации этих филаментов в пространстве и силы, которые они могут передавать плазматической мембране, ядру или другим органеллам, являются ключевыми аспектами их роли в клетке. Например, сеть актиновых филаментов и моторов миозина, называемая корой 1 актомиозина, генерирует силы для поддержания подвижности клеток и морфологических изменений в клетках животных. Совершенно иное расположение наблюдается в растительных клетках, где корковые микротрубочки направляют отложение целлюлозных фибрилл, тем самым контролируя архитектуру клеточной стенки, что в конечном итоге определяет, как эти клетки будут расти в будущем.

В то время как механика, безусловно, играет существенную роль в работе цитоскелета, химия не менее важна. Филаменты растут в процессе самосборки, в ходе которого мономеры находят место стыковки на кончике филамента после диффундирования через цитоплазму3. Таким образом, на молекулярном уровне сборка и разборка на кончике нитей определяются молекулярным сродством4. Точно так же белки цитоскелета диффундируют, а скорости связывания и разъединения определяют их сродство к филаментам, с которыми они сталкиваются. В случае молекулярных моторов циклы химических реакций с участием гидролиза АТФ связаны с движениями вдоль нитей и, возможно, с силами, которые ихсопровождают5. Примечательно, что цитоскелет предлагает множество необычных задач и большое разнообразие процессов с участием похожих компонентов. Это богатая игровая площадка на стыке биологии, химии и физики.

Цитоскелетные системы поддаются математическому моделированию. На самом деле, благодаря превосходным исследованиям, проведенным в последние десятилетия, основные молекулярные составляющие, скорее всего, уже идентифицированы, как показано на примере эндоцитоза6. В модельных организмах, таких как дрожжи, известны свойства этих элементов, а также системный состав для некоторых их процессов. Например, описаны структура и свойства материала микротрубочек7, а также их количество и средняя длина на различных стадиях митотического веретена8. Количество кинезинов, соединяющих микротрубочки в когерентную механическую структуру, часто известно9. Скорость многих двигателей была измерена in vitro10. Кроме того, экспериментаторы могут наблюдать и количественно оценивать эти системы in vivo в условиях дикого типа или мутировавших. Сочетание теории с экспериментами in vivo и in vitro позволяет исследователям проверить, достаточно ли современных знаний о системе цитоскелета для объяснения ее наблюдаемого поведения. Использование математических и вычислительных инструментов также позволяет нам делать выводы о том, как компоненты работают вместе, на основе предположений, полученных из наблюдений на молекулярном уровне, обычно в упрощенных ситуациях (например, эксперименты с одной молекулой).

Роль теории можно проиллюстрировать на практическом примере: избиении ресничек. Такое биение происходит из-за движения моторов динеина по микротрубочкам в ресничках. Можно задаться вопросом, от чего зависит скорость мотора динеина в этой системе. Один из возможных ответов заключается в том, что максимальная скорость ограничена требованием поддерживать определенный характер биения. Это было бы понятно, если бы избиение происходило под действием естественного отбора. В этом случае, если бы двигатели двигались быстрее, то процесс потерял бы свои желаемые качества — реснички не бились бы так эффективно или даже вообще вышли бы из строя. Хотя это возможно, вторая альтернатива заключается в том, что некий внутренний фактор может ограничивать скорость динеина.

Например, в клетке может не хватать АТФ для более быстрого производства динеина, или движения белков, необходимые для активности динеина, просто не могут быть ускорены. В этом случае, если бы двигатели можно было сделать быстрее, несмотря на физические ограничения, биение было бы улучшено. Третья возможность, конечно, заключается в том, что изменение скорости не оказывает существенного влияния на процесс, что может быть полезно для организма, обеспечивая некоторую «устойчивость» к неконтролируемым факторам. Среди этих трех возможностей можно определить правильный, рассчитав рисунок биения по свойствам динеина. Действительно, подходящая математическая модель должна предсказывать, как изменение скорости динеина влияет на характер биения и не подвержено ограничениям, существующим в физическом мире. Естественно, справедливость модели должна быть проверена, но даже «неправильные» модели могут породить интересные идеи.

Модель может иметь форму аналитической основы или быть численным моделированием системы. В любом случае, разрыв между молекулярным и функциональным масштабами остается препятствием, и разработка этих моделей не является простой задачей, поскольку в уравнения, описывающие биологическую систему, необходимо интегрировать несколько механических и химических процессов. Теория проявляется в различных формах, предлагая различные компромиссы между простотой и реализмом. Увеличение степени детализации в модели не всегда выгодно, так как это может ограничить нашу способность решать уравнения или, другими словами, выводить предсказания теории. Тот же компромисс существует и для симуляций. Разработчикам моделей придется выбирать ингредиенты системы, которые будут учитываться, игнорируя при этом определенные аспекты. Эти ключевые решения будут в значительной степени зависеть от цели исследования. В настоящее время выдающиеся усовершенствования в компьютерном оборудовании позволяют моделировать многие цитоскелетные системы с достаточным количеством деталей в течение достаточного времени, чтобы проанализировать их поведение. Это часто приводит к появлению неожиданных идей и новых направлений в исследованиях. Например, симуляции, подобные тем, которые будут использоваться в этом протоколе, привели к приблизительному расчету, который может предсказать сократимость сети на основе ее состава11.

Численные методы повсеместно распространены в инженерных и физических науках, а их применение в биологии растет. Сегодня практически все наши технологические whatchamacallit (часы, телефоны, автомобили и компьютеры) были впервые задуманы на компьютере, и для этого существует мощное программное обеспечение. Учитывая хорошо охарактеризованную цитоскелетную систему и предполагая, что был определен соответствующий уровень описания, необходимо решить несколько проблем, прежде чем ее можно будет смоделировать. Для простейших задач наиболее подходящим способом действий может быть написание симуляции «путем кодирования с нуля», другими словами, начав с общего языка программирования или математической платформы, такой как MATLAB. Преимущество этого заключается в том, что автор кода будет обладать глубокими знаниями о том, что было реализовано, и точно знать, как работает программное обеспечение. Этот путь, однако, не лишен риска, и нередко можно стать свидетелями того, как докторанты тратят большую часть своего рабочего времени на написание кода, а не на решение научных вопросов.

Альтернативой является использование программного обеспечения, придуманного другими, но и это не лишено рисков; Любой большой исходный код имеет тенденцию спонтанно приобретать черты непроницаемого черного ящика, несмотря на самые замечательные усилия их авторов по предотвращению этого. Использование черных ящиков – это точно не мечта ученого. Большой исходный код также может стать обузой, и может быть быстрее начать с нуля, чем модифицировать существующую кодовую базу, чтобы заставить ее делать что-то другое. Чтобы смягчить эту проблему, всегда можно обратиться за помощью к авторам программного обеспечения, но этого может быть недостаточно. Часто существует разница в научной культуре между авторами программного обеспечения и людьми, которые хотели бы его использовать, а это означает, что многие неявные предположения нуждаются в уточнении. Ожидается, что благодаря тому, что код станет открытым, больше людей будут вовлечены в разработку программного обеспечения и поддерживать его документацию, тем самым повышая его качество. Все это важные вопросы, которые должны быть должным образом рассмотрены, прежде чем делать какие-либо инвестиции. Тем не менее, единственный путь к прогрессу в долгосрочной перспективе — это продвижение надежных программных решений, используемых и поддерживаемых широким сообществом с общими научными интересами.

Хотя этот протокол использует Cytosim, существуют и другие инструменты с открытым исходным кодом, которые могут моделировать ту же систему, например, AFINES12, MEDYAN13, CyLaKS14, aLENS15 и AKYT16, и это лишь некоторые из них. К сожалению, сравнение этих проектов выходит за рамки статьи. Здесь даны пошаговые инструкции по моделированию сократительной 2D-сети актомиозина. Эта система проста и использует более известные возможности Cytosim. Cytosim построен на кроссплатформенном движке, который может выполнять моделирование в 2D или 3D. Он имеет модульную кодовую базу, что делает его легко настраиваемым для выполнения конкретных задач. Цитозим одинаково стабилен и эффективен в 3D и успешно использовался в прошлом для исследования различных проблем, связанных с микротрубочками и актиновыми филаментами: ассоциация двух астр микротрубочек17, движение ядер в клетках18,19, эндоцитоз6, цитокинез20, образование митотического веретена21, движения митотического веретена22, В коде сохранены захват хромосом23, сокращение актомиозиновых сетей11,24, а также механика кольца микротрубочек в тромбоцитахкрови 25, а также возможности, разработанные для этих проектов. Описанный здесь рабочий процесс может быть адаптирован ко многим другим проблемам. Он использует командную строку Unix, которая может быть незнакома некоторым читателям. Использование командной строки, однако, является наиболее переносимым и удобным способом автоматизации процесса выполнения симуляций. Интегрированные графические пользовательские интерфейсы призваны обеспечить простой, интуитивно понятный доступ к программному обеспечению, но это часто происходит за счет универсальности. Цель данной статьи — проиллюстрировать подход, который можно легко модифицировать или адаптировать к другим проблемам. Примечания объясняют значение команд.

Для моделирования сети актомиозинов филаменты моделируются в виде ориентированных линий и представляются вершинами, распределенными по их длине (рис. 1). Это промежуточный уровень описания, распространенный в физике полимеров, который игнорирует подлинную трехмерную природу нитей, но позволяет рассчитать изгиб. Филаменты могут расти и сжиматься на своих концах, следуя различным моделям, которые охватывают как феноменологию актина, так и микротрубочек. В клетках филаменты организуются главным образом посредством взаимодействий, ограничивающих их движение, например, прикрепления к другим филаментам или просто удержания внутри клетки. В Cytosim все такие взаимодействия линеаризованы и объединены в большой матрице26. Уравнения, описывающие движение всех вершин филамента, выведены из этой матрицы, предполагая вязкую среду и случайные флуктуирующие члены, представляющие броуновское движение. Эти уравнения решаются численно для получения самосогласованного и эффективного движения нитей вместе со всеми силами, действующими наних. На этот механический двигатель накладывается стохастический двигатель, который имитирует дискретные события, такие как прикрепление и отсоединение молекулярных двигателей или динамика сборки нитей. Таким образом, Cytosim, во-первых, использует моделируемую динамику для расчета механики сети филаментов, соединенных любым произвольным образом, и, во-вторых, стохастические методы для моделирования связывания, разъединения и диффузии белков, которые соединяют филаменты или влияют на них.

Показанный здесь рабочий процесс часто использовался для первоначального изучения системы с использованием Cytosim. Критическим этапом для многих потенциальных пользователей, скорее всего, станет установка программных компонентов. Распространение программного обеспечения в виде исходного кода отвечает императивам открытой науки, но оно подвержено ошибкам, поскольку разработчики программного обеспечения имеют доступ только к ограниченному пулу архитектуры для тестирования программы. Компиляция может завершиться ошибкой из-за различий в операционных системах. Представленные здесь инструкции, скорее всего, устареют по мере развития компьютерных систем и исходных кодов. Таким образом, очень важно периодически проверять последние инструкции в Интернете. В случае возникновения проблем, настоятельно рекомендуется, чтобы пользователи сообщили об этом, разместив сообщение на соответствующем канале обратной связи (в настоящее время это домашняя страница Cytosim на Gitlab), чтобы помочь решить проблему.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол состоит из следующих этапов: подготовка платформы для Windows 10, MacOS и Linux; установка Cytosim; настройка симуляции и тестового прогона, а также графического отображения; многократные прогоны, варьируя параметр: количество сшивающих агентов в сети; создание графика для отображения того, как количество сшивающих агентов влияет на сократимость; параллельные прогоны; и случайная выборка. Весь текст после «>» является командами, которые должны быть введены дословно в окне терминала. Символ ">" представляет собой приглашение терминала и не должен включаться, но все остальные символы важны.

1. Подготовка платформы

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от ОС (MacOS, Windows 10 или Linux) следуйте шагу 1.1, шагу 1.2 или шагу 1.3.

  1. Подготовка (MacOS)
    1. Установите инструменты командной строки Xcode , открыв терминал (в разделе Приложения/Утилиты), и введите:
      gt; xcode-select --install
    2. Чтобы просмотреть или отредактировать код Cytosim, установите Xcode из Apple App Store (https://apps.apple.com/us/app/Xcode/id497799835?mt=12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Встроенный редактор Xcode идеально подходит. Другие редакторы, ориентированные на код, также будут работать, например, TextMate. Чтобы использовать TextMate, загрузите инструкции из https://macromates.com и следуйте им.
  2. Подготовка (Windows)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для Windows 10 и более поздних версий Cytosim может работать с использованием "Подсистемы Windows для Linux" (WSL), как описано ниже. Альтернативой для более старой версии является Cygwin, но инструкции здесь не приводятся.
    1. Обновите операционную систему компьютера, чтобы она соответствовала требованиям для WSL 2: Windows 10 версии 1903 или выше, со сборкой 18362 или выше, для систем x64 и версией 2004 или выше, со сборкой 19041 или выше, для систем ARM64. Для получения информации о последующих обновлениях версий проверьте https://docs.microsoft.com/en-us/windows/release-health/release-information.
    2. Введите «Включение и выключение функций Windows » в поле поиска на панели задач. Вручную включите (figure-protocol-2315) Virtual Machine Platform и (figure-protocol-2433) подсистему Windows для Linux. Нажмите OK и перезагрузите Windows.
    3. Перейдите в Windows Microsoft Store и найдите Ubuntu. Скачайте и установите актуальный релиз (Ubuntu 20.04 LTS по состоянию на 03.2022)
    4. Нажмите «Запустить», чтобы запустить терминал Ubuntu. Если вам будет предложено загрузить последнюю версию ядра Linux WSL2, следуйте инструкциям, которые будут предоставлены. Установите обновление и перезапустите Ubuntu.
    5. Следуйте инструкциям терминала, чтобы ввести новое имя пользователя UNIX и установить пароль. После настройки учетной записи пользователя запустите Ubuntu из поля поиска на панели задач Windows. Откройте домашний каталог (также известный как "."), из командного окна:
      > explorer.exe .
    6. Установите WSL-совместимый сервер X-Window, например Xming: https://sourceforge.net/projects/xming/
    7. Запустите сервер X-Window, Xming , дважды кликнув по иконке Xming; выберите Несколько окон. После этого откройте терминал Ubuntu и выполните шаг 1.3 (Linux).
  3. Подготовка (Linux)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти инструкции подходят для дистрибутивов Linux, использующих менеджер пакетов APT. Эти команды должны быть изменены для дистрибутивов, таких как Red Hat Linux, в которых используется другой менеджер пакетов. В этом случае следуйте инструкциям дистрибутива Linux для установки тех же пакетов.
    1. Обновите систему Linux:
      > sudo apt-get update
      > sudo apt-get upgrade
    2. Установите компилятор C++ и команду GNU make (https://www.gnu.org/software/make):
      > sudo apt-get install build-essential
    3. Установите библиотеки BLAS/LAPACK (http://www.netlib.org/lapack):
      > sudo apt-get install libblas-dev liblapack-dev
    4. Установите библиотеку разработчика OpenGL и заголовочные файлы (https://www.mesa3d.org):
      > sudo apt-get install mesa-common-dev
    5. Установите библиотеку GLEW (http://glew.sourceforge.net):
      > sudo apt-get install libglew-dev
    6. Установите библиотеку freeGLUT (http://freeglut.sourceforge.net):
      > sudo apt-get install freeglut3-dev
    7. Установите систему контроля версий GIT (https://git-scm.com):
      > sudo apt-get install git
    8. Установите тестовые программы X11 (например, xeyes, xclock, xcalc):
      > sudo apt-get install x11-apps
    9. Отрегулируйте переменную окружения DISPLAY:
      > export DISPLAY=:0
      1. Попробуйте открыть окно X11:
        > xeyes
      2. Если это сработало, перейдите к шагу 2. Если из-за ошибки не удалось открыть дисплей, попробуйте другое значение DISPLAY.
      3. Найдите IP-адрес машины WSL2:
        > cat /etc/resolv.conf
      4. Если отображается IP-адрес, например, "nameserver 10.16.0.7", используйте этот IP-адрес вместо X.X.X.X ниже:
        > EXPORT DISPLAY= X.X.X.X:0
        > xeyes
      5. Если это сработало, перейдите к шагу 2. Если "play" не удается "открыть дисплей", попробуйте запустить его из окна "xterm":
        > sudo apt install xterm
        > xterm -display :0
      6. В открывшемся окне введите:
        > xeyes

2. Установка Cytosim

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги аналогичны для любой ОС: MacOS, WSL и Linux. В следующем разделе команды будут выдаваться в терминале, а в качестве "текущей рабочей директории" следует установить директорию, в которой была скомпилирована симуляция. Этот каталог будет называться базовым каталогом. Как вариант, все можно сделать в отдельной директории, если файлы копируются по мере необходимости. Если вы не знакомы с командной строкой, рассмотрите возможность следования учебнику, например, https://www.learnenough.com/command-line-tutorial или https://learnpythonthehardway.org/book/appendixa.html.

  1. Скачать исходный код Cytosim:
    > git clone https://gitlab.com/f-nedelec/cytosim.git cytosim
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для загрузки кода не требуется учетная запись Gitlab. Это должно создать новый подкаталог "cytosim" в текущем каталоге.
  2. Компилировать:
    > CD цитозим
    > сделать
    1. Убедитесь, что в поддиректории "bin" созданы три файла, выполнив:
      > ls bin
    2. Если шаг 2.2.1 не удался, попробуйте этот альтернативный метод компиляции, установив cmake (https://cmake.org):
      > mkdir b
      > cd b
      > cmake ..
      > сделать
      > cd ..
  3. Проверьте исполняемые файлы:
    > Информация о корзине/SIM-карте
    > Информация о корзине/игре
    1. Убедитесь, что оба исполняемых файла были скомпилированы для выполнения 2D-моделирования. Обратите внимание на следующие выходные данные запросов "info", приведенных выше:
      Размерность: 2 Периодическая: 1 Точность: 8 байт
    2. Если это не так, и только тогда, измените файл "src/math/dim.h" (откройте, отредактируйте, чтобы изменить DIM на 2, сохраните) и перекомпилируйте Cytosim:
      > сделать чистыми
      > сделать
  4. Тестовый прогон
    1. Скопируйте три исполняемых файла:
      > CP Bin/SIM SIM
      > cp Bin/Play Play
      > Корзина/отчет CP
    2. Создайте новую директорию:
      > mkdir run
    3. Скопируйте и переименуйте стандартный файл конфигурации:
      > cp cym/fiber.cym run/config.cym
    4. Запустите симуляцию:
      > CD пробег
      > .. /сим
    5. Визуализируйте результаты моделирования:
      > .. /играть
      1. Нажмите клавишу пробела для анимации. Нажмите h для получения помощи по сочетаниям клавиш.
      2. Чтобы выйти из программы, в MacOS попробуйте figure-protocol-8240-Q, или CTRL-Q, или выберите в меню пункт «Выйти ». В крайнем случае, введите CTRL-C в окне терминала, с которого была запущена функция "play".
    6. Запуск в режиме реального времени:
      > .. /играть в прямом эфире

3. Настройка симуляции

  1. Установите текстовый редактор, ориентированный на код (например, TextMate, SublimeText), если он еще не доступен.
    Откройте редактор и откройте файл "config.cym", расположенный в директории "run", созданной на шаге 2.4.2. Ознакомьтесь с различными разделами файла конфигурации, который является копией "fiber.cym" (Дополнительный файл 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Cytosim обычно читает только один файл конфигурации, оканчивающийся на ".cym". Все изменения будут производиться здесь в "config.cym". Список параметров приведен в дополнительной таблице S1 .
  2. Измените симуляцию, внеся следующие изменения в "config.cym":
    радиус = 5 → радиус = 3
    новая нить 1 → новая нить 100
  3. Сохраните файл, не меняя его имя или местоположение (перезапишите "config.cym"). Переключитесь в окно терминала и убедитесь, что симуляция изменена должным образом с помощью:
    > .. /играть в прямом эфире
    ПРИМЕЧАНИЕ: Радиус окружности указан в микрометрах (мкм), как и все расстояния в Cytosim. Цитозим следует системе единиц, адаптированных к масштабу клетки, полученных из микрометров, пиконьютонов и секунд.
  4. В пункт «Установите волокнистую нить» внесите следующие изменения:
    жесткость=20 → жесткость=0.1
    сегментация = 0,5 → сегментация = 0,2
    confine=inside, 200, cell → confine= inside, 10, cell
    В пункте "новая нить накала" изменить:
    длина=12 → длина=2
    Сокращение времени моделирования за счет изменения:
    Система Run 5000 → система Run 1000
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это регулирует свойства нити накала. Параграф "set" определяет стойкие свойства нитей накаливания, в то время как параметры в "new" обычно являются начальными условиями. Жесткость на изгиб указывается в пНμм2. Сегментация — это приблизительное расстояние между вершинами, описывающее филаменты, в микрометрах (мкм). Его нужно уменьшить, если нити накаливания сделать более гибкими. Последнее изменение уменьшает жесткость (пН/мкм) потенциала удержания, связанного с краями «ячейки». Длина, заявленная в "новом" пункте (2 мкм), является начальной длиной нитей накаливания, а поскольку в данной модели нити накала не являются динамическими, их длина не изменится. Рекомендуется подписать файл конфигурации, отредактировав первую строку:
    % Ваше имя, дата, место
    1. Проверьте действительность файла конфигурации (повторите шаг 3.3).
  5. Создание пассивных соединителей.
    1. Добавьте новый абзац в "config.cym" перед строками с командами "new" и "run", чтобы определить молекулярную активность со сродством к филаментам:
      Set hand binder {
      binding_rate = 10
      binding_range = 0,01
      unbinding_rate = 0,2
      }
    2. Чтобы определить бифункциональные сущности, добавьте еще один абзац чуть ниже:
      set pair crosslinker {
      hand1 = связующее вещество
      hand2 = связующее вещество
      жесткость = 100
      диффузия = 10
      }
    3. Добавьте команду "new" после предыдущих абзацев и перед командой "run":
      Новый сшиватель 1000
      ПРИМЕЧАНИЕ: В Cytosim скорости указываются в единицах s−1 , а диапазон - в микрометрах (мкм). Жесткость указывается в единицах пиконьютонов на микрометр (пН/мкм), а коэффициент диффузии — в микрометрах в квадрате в секунду (мкм2/с). Порядок команд в файле конфигурации важен, и эти абзацы должны отображаться перед любой командой «выполнить», иначе они не будут эффективны. Чтобы узнать больше об объектах Cytosim, следуйте инструкциям в разделе "tuto_introduction.md", который находится в подпапке "doc" базового каталога: doc/tutorials/.
  6. Создание бифункциональных моторов.
    1. Добавьте новый абзац в "config.cym", перед строками с командами "new" и "run":
      установить ручной мотор {
      binding_rate = 10
      binding_range = 0,01
      unbinding_rate = 0,2
      Активность = Движение
      unloaded_speed = 1
      stall_force = 3
      }
    2. Добавьте еще один абзац, следующий за предыдущим:
      set pair complex {
      hand1 = мотор
      hand2 = мотор
      жесткость = 100
      диффузия = 10
      ​}
    3. Добавьте команду "new" после предыдущих абзацев и перед командой "run":
      Новый комплекс 200
      ПРИМЕЧАНИЕ: "activity = move" указывает на двигатель, который непрерывно движется по нити накала. Двигатель подчиняется линейной кривой сила-скорость (рис. 1), характеризуемой скоростью без нагрузки (мкм/с) и силой сваливания (пиконьютон). На каждом временном шаге τ оно перемещается на расстояние v × τ. Использование "activity = none" указывало бы на молекулу, которая не движется, а поскольку это активность по умолчанию, можно было бы просто опустить "activity" вообще. Возможны и другие виды деятельности, например, "activity = walk" будет указывать на мотор с дискретными шагами вдоль нити накала. «unloaded_speed» положительная для двигателя с плюсовым направлением. Указание отрицательного значения заставило бы двигатель двигаться в сторону минус-концов. Это более подробно объясняется в первом уроке Cytosim (см. ссылку в шаге 3.5.2).
  7. Сохраните файл.
    Проверьте симуляцию:
    > .. /играть в прямом эфире
    Запустите симуляцию:
    > .. /сим
    Визуализируйте результаты:
    > .. /играть
    Скопируйте окончательный конфигурационный файл в базовую директорию:
    > cp config.cym .. /config.cym
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ваш окончательный файл должен быть похож на Дополнительный файл 2 ("jove.cym"). Обратите внимание, сколько времени потребовалось для вычисления этой симуляции. В следующих разделах это время будет умножено на количество симуляций, выполненных для создания графика, на котором изменяется параметр.

4. Развертка параметров

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе количество сшивающих агентов в сети систематически варьируется.

  1. Импортируйте скрипты Python.
    1. Создадим поддиректорию "byn", внутри базовой директории:
      > мкдир бын
    2. Скопируйте три скрипта из стандартного дистрибутива Cytosim:
      > cp python/run/preconfig.py byn/preconfig
      > cp python/look/scan.py byn/.
      > cp python/look/make_page.py byn/.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целях безопасности копии этих файлов предоставляются в виде Дополнительного файла 3, Дополнительного файла 4 и Дополнительного файла 5 вместе с этой статьей.
  2. Сделайте файлы исполняемыми:
    > chmod +x byn/preconfig
    > chmod +x byn/scan.py
    > chmod +x byn/make_page.py
    1. Проверьте корректное выполнение скриптов:
      Справка по > byn/preconfig
      > byn/scan.py помощь
      > byn/make_page.py помощь
      ПРИМЕЧАНИЕ: При этом должно быть выведено описание того, как может быть использована каждая команда. Можно изменить переменную PATH для более простого вызова скриптов; см. https://en.wikipedia.org/wiki/PATH_(переменная).
    2. Устранение неполадок
      1. Если ошибка «команда не найдена», проверьте указанный путь, который должен соответствовать расположению файла. Если ошибка другого типа из-за того, что ОС не предоставляет python2, отредактируйте три файла .py и измените shebang, который является первой строкой каждого файла (просто добавьте "3"):
        #!/usr/bin/env python → #!/usr/bin/env python3
  3. Скопируйте файл конфигурации, чтобы сделать его "шаблоном" (Дополнительный файл 6):
    > cp config.cym config.cym.tpl
  4. Отредактируйте файл конфигурации шаблона. В редакторе кода откройте файл "config.cym.tpl", расположенный в базовой директории. Измените одну строку, чтобы ввести переменный текстовый элемент:
    Новый сшивающий агент 1000 → новый [[range(0,4000,100)]] сшивающий агент
    ПРИМЕЧАНИЕ: Preconfig распознает код, заключенный в двойные скобки, и заменит его значением, полученным при выполнении этого кода в Python. В Python "range(X,Y,S)" задает целые числа от X до Y, с шагом S; В данном случае [0, 100, 200, 300, ... 4000]. Цель состоит в том, чтобы изменить количество сшивающих агентов, добавляемых в симуляцию.
  5. Сгенерируйте конфигурационные файлы из шаблона:
    > byn/preconfig run%04i/config.cym config.cym.tpl
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этом должно быть создано 40 файлов, по одному для каждого значения, указанного в "range(0,4000,100)". Имена файлов, которые должны быть сгенерированы Preconfig, указываются как "run%04i/config.cym". С помощью этого конкретного кода Preconfig сгенерирует "run0000/config.cym", "run0001/config.cym" и т.д. Он фактически создаст каталоги "run0000", "run0001" и т.д., и создаст файл "config.cym" в каждом из них. Обратитесь к справке Preconfig для получения более подробной информации (выполните "byn/preconfig help"). В случае ошибки проверьте, что команда набрана точно. Каждый персонаж имеет значение.
  6. Выполняйте все симуляции последовательно:
    > byn/scan.py '.. /sim' бег????
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программа "scan.py" выполнит указанную команду в списке предоставленных каталогов. В данном случае этот список директорий задается параметром "run????". Вопросительный знак — это джокер, который соответствует какому-либо одному символу. Следовательно, "run????" соответствует любому имени, начинающемуся с "run" и сопровождаемому ровно четырьмя символами. В качестве альтернативы можно использовать "run*" для создания того же списка, поскольку "*" соответствует любой строке.
    1. В случае возникновения проблем, выполните эту команду из нового окна терминала, чтобы запустить "sim" последовательно во все каталоги, созданные на шаге 4.5. Подождите примерно 30 минут, пока процесс не завершится, но это во многом зависит от мощности компьютера. Уменьшите объем запрашиваемых вычислений, отредактировав "config.cym":
      Система Run 1000 → система Run 500
  7. Визуализируйте некоторые симуляции:
    > ./play run0010
    > ./play run0020
  8. Создание изображений для всех симуляций:
    > byn/scan.py '.. /play image size=256 frame=10' run????
  9. Сгенерируйте сводную страницу в формате HTML:
    > byn/make_page.py плитка = 5 прогонов????
    1. Откройте «page.html» в веб-браузере.

5. Построение графика

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе на основе результатов анализа параметров строится график.

  1. Проверьте исполняемый файл отчета :
    > CD пробег
    > .. /report network:size
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого кадра на траектории будет выведено несколько комментариев и два числа, соответствующие "polymer" и "surface". Будет использоваться только "поверхность" сети (последний столбец).
    1. В частности, ограничьте информацию одним кадром с помощью:
      > .. /report network:size frame=10
    2. Удалите комментарии, чтобы облегчить обработку вывода:
      > .. /report network:size frame=10 verbose=0
    3. Наконец, перенаправьте вывод в файл с помощью системы Unix pipe (">"):
      > .. /report network:size frame=10 verbose=0 > net.txt
    4. Выведите содержимое файла в терминал для проверки:
      > кошка net.txt
      ПРИМЕЧАНИЕ: При этом должны быть выведены два числа. Второй – это поверхность, покрытая сетью на 10-м кадре. Чтобы выполнить одну и ту же операцию во всех директориях "run", измените директорию:
      > cd ..
  2. Сгенерируйте отчет в каждой поддиректории моделирования:
    > byn/scan.py '.. /report network:size frame=10 verbose=0 > net.txt' run????
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, scan.py выполним команду в кавычках во всех директориях, указанных в "run????". Эта команда является последней, которая была опробована на шаге 5.1. Это сгенерирует файл "net.txt" в каждом каталоге (попробуйте "ls run????").
  3. Изучите эти цифры:
    > byn/scan.py забег «Кошка net.txt????
    1. Добавьте опцию "+", чтобы объединить имя директории и вывод команды:
      > byn/scan.py + забег «Cat net.txt????
  4. Соберем эти числа в файл:
    > byn/scan.py + забег «Cat net.txt???? > results.txt
  5. Очистите файл "results.txt", удалив повторяющийся текст, который не является числовым. Откройте "result.txt" в редакторе кода и используйте команду "заменить текст", чтобы удалить все строки "run". Удалите только три буквы, а цифры сохраните; "run0000" должно стать "0000".
    ПРИМЕЧАНИЕ: В файле должны остаться только числа, организованные в три столбца.
  6. Сгенерируйте график сократимости на основе данных в "result.txt". Используйте любой метод для построения графика с использованием столбца 1 для X и столбца 3 для Y. Обозначьте ось X как число сшивающих агентов/100. Обозначьте ось Y как поверхность (микрометр^2).
  7. Храните все симуляции в отдельной директории:
    > mkdir save1
    > пробег mv???? сохранить1

6. Альтернативный метод построения графика

  1. Добавьте команду report в конце "config.cym.tpl" на новую строку после закрывающего "}" команды run:
    Сеть отчета:Размер net.txt { verbose = 0 }
  2. Сгенерируйте конфигурационные файлы:
    > byn/preconfig run%04i/config.cym config.cym.tpl
  3. Запустите все симуляции с использованием параллельных потоков:
    > byn/scan.py '.. /sim' бег???? njobs=4
    1. Отрегулируйте количество заданий (njobs=4) в зависимости от мощности компьютера. Отслеживайте использование ресурсов процессора, например, с помощью приложения «Мониторинг системы» на MacOS.
  4. Соберите данные:
    > byn/scan.py + забег «Cat net.txt???? > results.txt
  5. Делаем график, как в шагах 5.5 и 5.6.
  6. Храните все предыдущие прогоны в отдельной директории:
    > mkdir save2
    > пробег mv???? сохранить2

7. Улучшенный график с использованием случайной выборки

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь выборка переменной осуществляется с помощью функции-генератора из модуля "random" Python.

  1. В редакторе кода откройте конфигурационный файл шаблона "config.cym.tpl", расположенный в базовой директории. Добавьте две строки, непосредственно перед "новым сшивателем":
    [[num = int(random.uniform(0,4000))]]
    %[[num]] xlinkers
    Также измените команду "new", чтобы использовать эту переменную:
    новый [[range(0,4000,100)]] сшивающий → новый [[num]] сшивающий агент
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая строка создает случайную величину "num". Во второй строке выводится значение параметра. Символ "%" важен, так как он указывает Cytosim пропустить строку. В скором времени «xlinkers» будет служить узнаваемой меткой, и она должна появляться только один раз в каждом файле.
    1. В самом конце "config.cym.tpl" убедитесь, что есть инструкция по отчету:
      Сеть отчета:Размер net.txt { verbose = 0 }
  2. Сгенерируйте конфигурационные файлы:
    > byn/preconfig run%04i/config.cym 42 config.cym.tpl
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этом должно быть сгенерировано 42 файла. Это число можно увеличить, если компьютер работает достаточно быстро. Значения, сгенерированные случайным образом, можно увидеть, используя инструмент Unix "grep" для поиска файлов:
    > работают grep xlinker???? /config.cym
  3. Выполняйте все симуляции параллельно:
    > byn/scan.py '.. /sim' бег???? njobs=4
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество заданий в соответствии с емкостью компьютера. Для достижения наилучших результатов переменная "njobs" должна быть установлена равной количеству ядер компьютера.
  4. Соберите данные с помощью одной команды:
    > byn/scan.py + 'grep xlinkers config.cym; кошачий net.txt бег???? > results.txt
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опция "+" в scan.py объединит весь вывод команды в одну строку. В этом случае команда фактически состоит из двух команд, разделенных полустолбцом (";"). Сбор данных всегда можно автоматизировать с помощью скрипта Python.
  5. Очистите файл. Откройте "result.txt" в редакторе кода. Чтобы гарантировать, что все данные, относящиеся к одному моделированию, содержатся в одной строке, удалите все вхождения строки "xlinkers" и удалите символы "%" в начале каждой строки. Наконец, сохраните «result.txt», который должен быть аккуратно организован в три столбца числовых значений.
  6. Постройте график для построения графика данных, повторив шаг 5.6, но обозначьте ось X как количество сшивающих агентов
  7. Сохраните набор данных в новом подкаталоге:
    >mkdir set1
    > пробег mv???? set1/.
    > mv results.txt set1/.
  8. Вычислите другой набор данных, повторив шаги 7.2–7.6, а затем повторите шаг 7.8, заменив «set1» на «set2» во всех трех командах.
  9. Составляем комбинированный участок.
    1. Объедините два файла данных:
      > набор для кошек?/results.txt > results.txt
      ПРИМЕЧАНИЕ: Новый "result.txt" должен быть больше.
    2. Отобразите данные для построения объединенного графика, как описано в шаге 7.7.

8. Полностью автоматизированный конвейер

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части все операции, требующие ручного вмешательства, заменяются командами. Когда это будет сделано, можно будет написать единый скрипт, который выполняет все действия в автоматическом режиме. Этот сценарий можно запустить на удаленном компьютере, например на вычислительной ферме.

  1. Используйте команду "sed" в Unix для "очистки" файла results.txt, заменив шаг 7.6.
    1. Уберите "%" в начале строк:
      > sed -e 's/%//g' results.txt > tmp.txt
    2. Удалите "xlinkers":
      > sed -e 's/xlinkers//g' tmp.txt > results.txt
  2. Напишите скрипт для последовательного вызова всех команд в правильном порядке.
    1. Используйте разные языки: bash или Python.
    2. Создайте файл "pipeline.bash" и скопируйте все команды, необходимые для запуска конвейера.
    3. Выполняем скрипт:
      > bash pipeline.bash
  3. Используйте скрипт автоматической печати.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно отказаться от всех ручных вмешательств. Существует множество инструментов для создания графика в формате PDF непосредственно из файла данных, например, gnuplot (http://www.gnuplot.info), PyX (https://pyx-project.org) или Seplot (https://pypi.org/project/seplot/).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В разделе 2, успешная компиляция Cytosim с использованием "make" должна привести к созданию sim, play и отчета в подкаталоге "bin". На выходе шага 2.3 («sim info») среди прочего должно быть указано «Dimension: 2». В разделе 3 файл конфигурации должен быть похож на файл jove.cym, предоставле...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод, описанный в этой статье, основан на трех небольших и независимых программах на языке Python, которые различными способами использовались на протяжении всего описанного протокола. Первый преконфигур скрипта является универсальным инструментом, способным за?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим членов модельного клуба SLCU, особенно Тэмсин Спелман, Ренске Вруманс, Кэмерона Гибсона, Женевьеву Хайнс и Юана Смитерса, а также других бета-тестеров протокола, Вэй Сян Чу, Даниэля Кортеса, Ронена Зайдель-Бара, Амана Сони, Чайтанью Атале, Ким Беллингем-Джонстун, Сержа Дмитриеффа, Гаэль Леторт и Гислена де Лабби. Мы выражаем признательность за поддержку со стороны Благотворительного фонда Гэтсби (грант PTAG-024) и Европейского исследовательского совета (грант ERC Synergy, проект 951430).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
A personal computerMacOS, Windows 10 or Linux
config.cym.tpltemplate configuration file; https://gitlab.com/f-nedelec/cytosim.git
jove.cymCytosim configuration file
make_page.pyPython script; https://github.com/nedelec/make_page.py
preconfigPython script; https://github.com/nedelec/preconfig
scan.pyPython script; https://github.com/nedelec/scan.py

Ссылки

  1. Chugh, P., Paluch, E. K. The actin cortex at a glance. Journal of Cell Science. 131 (14), (2018).
  2. Elliott, A., Shaw, S. L. Update: Plant cortical microtubule arrays. Plant Physiology. 176 (1), 94-105 (2018).
  3. Odde, D. J. Estimation of the diffusion-limited rate of microtubule assembly. Biophysical Journal. 73 (1), 88-96 (1997).
  4. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  5. Carter, N. J., Cross, R. A. Mechanics of the kinesin step. Nature. 435 (7040), 308-312 (2005).
  6. Mund, M., vander Beek, J. A., et al. Systematic nanoscale analysis of endocytosis links efficient vesicle formation to patterned actin nucleation. Cell. 174 (4), 884-896 (2018).
  7. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  8. Ward, J. J., Roque, H., Antony, C., Nedelec, F. J. Mechanical design principles of a mitotic spindle. eLife. 3, 1-28 (2014).
  9. Burkhart, J. M., Vaudel, M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), 73-82 (2012).
  10. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. Sinauer Associates. , Sunderland, MA. (2001).
  11. Belmonte, J. M., Leptin, M., Nedelec, F. A theory that predicts behaviors of disordered cytoskeletal networks. Molecular Systems Biology. 13 (9), 941(2017).
  12. Freedman, S. L., Banerjee, S., Hocky, G. M., Dinner, A. R. A versatile framework for simulating the dynamic mechanical structure of cytoskeletal networks. Biophysical Journal. 113 (2), 448-460 (2017).
  13. Popov, K., Komianos, J., Papoian, G. A. MEDYAN: Mechanochemical simulations of contraction and polarity alignment in actomyosin networks. PLoS Computational Biology. 12 (4), 1004877(2016).
  14. Fiorenza, S. A., Steckhahn, D. G., Betterton, M. D. Modeling spatiotemporally varying protein-protein interactions in CyLaKS, the Cytoskeleton Lattice-based Kinetic Simulator. The European Physical Journal. E, Soft Matter. 44 (8), 105-119 (2021).
  15. Yan, W., et al. aLENS: Towards the cellular-scale simulation of motor-driven cytoskeletal assemblies. arXiv. , (2021).
  16. Tam, A. K. Y., Mogilner, A., Oelz, D. B. Protein friction and filament bending facilitate contraction of disordered actomyosin networks. Biophysical Journal. 120 (18), 4029-4040 (2021).
  17. Nedelec, F. Computer simulations reveal motor properties generating stable antiparallel microtubule interactions. The Journal of Cell Biology. 158 (6), 1005-1015 (2002).
  18. Gibeaux, R., Politi, A. Z., Philippsen, P., Nedelec, F. Mechanism of nuclear movements in a multinucleated cell. Molecular Biology of the Cell. 28 (5), 567-691 (2017).
  19. De Simone, A., Nedelec, F., Gönczy, P. Dynein transmits polarized actomyosin cortical flows to promote centrosome separation. Cell Reports. 14 (9), 2250-2262 (2016).
  20. Descovich, C. P., et al. Cross-linkers both drive and brake cytoskeletal remodeling and furrowing in cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 622-631 (2018).
  21. Loughlin, R., Heald, R., Nedelec, F. A computational model predicts Xenopus meiotic spindle organization. The Journal of Cell Biology. 191 (7), 1239-1249 (2010).
  22. Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
  23. Burdyniuk, M., Callegari, A., Mori, M., Nedelec, F., Lénárt, P. F-Actin nucleated on chromosomes coordinates their capture by microtubules in oocyte meiosis. The Journal of Cell Biology. 217 (8), 2661-2674 (2018).
  24. Mori, M., et al. An Arp2/3 nucleated F-actin shell fragments nuclear membranes at nuclear envelope breakdown in starfish oocytes. Current Biology. 24 (12), 1421-1428 (2014).
  25. Dmitrieff, S., Alsina, A., Mathur, A., Nedelec, F. J. Balance of microtubule stiffness and cortical tension determines the size of blood cells with marginal band across species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4418-4423 (2017).
  26. Nedelec, F., Foethke, D. Collective Langevin dynamics of flexible cytoskeletal fibers. New Journal of Physics. 9 (11), 499-510 (2007).
  27. Nedelec, F. preconfig: A versatile configuration file generator for varying parameters. Journal of Open Research Software. 5 (1), 9(2017).
  28. Burute, M., et al. Polarity reversal by centrosome repositioning primes cell scattering during epithelial-to-mesenchymal transition. Developmental Cell. 40 (2), 168-184 (2017).
  29. Manhart, A., Windner, S., Baylies, M., Mogilner, A. Mechanical positioning of multiple nuclei in muscle cells. PLoS Computational Biology. 14 (6), 1006208(2018).
  30. Jain, K., Khetan, N., Athale, C. A. Collective effects of yeast cytoplasmic dynein based microtubule transport. Soft Matter. 15 (7), 1571-1581 (2019).
  31. Strübing, T., et al. Wrinkling instability in 3D active nematics. Nano Letters. 20 (9), 6281-6288 (2020).
  32. Akamatsu, M., et al. Principles of self-organization and load adaptation by the actin cytoskeleton during clathrin-mediated endocytosis. eLife. 9, 49840(2020).
  33. Hirst, W. G., Biswas, A., Mahalingan, K. K., Reber, S. Differences in intrinsic tubulin dynamic properties contribute to spindle length control in Xenopus species. Current Biology. 30 (11), 2184-2190 (2020).
  34. Sobral, A. F., et al. Plastin and spectrin cooperate to stabilize the actomyosin cortex during cytokinesis. Current Biology. 31 (24), 5415-5428 (2021).
  35. Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. Crowder and surface effects on self-organization of microtubules. Physical Review E. 103 (6-1), 062408(2021).
  36. Gros, O. J., Damstra, H. G. J., Kapitein, L. C., Akhmanova, A., Berger, F. Dynein self-organizes while translocating the centrosome in T-cells. Molecular Biology of the Cell. 32 (9), 855-868 (2021).
  37. Serwas, D., et al. Mechanistic insights into actin force generation during vesicle formation from cryo-electron tomography. Developmental Cell. 57 (9), 1132-1145 (2022).
  38. Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
  39. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  40. Rovner, A. S., Fagnant, P. M., Trybus, K. M. Phosphorylation of a single head of smooth muscle myosin activates the whole molecule. Biochemistry. 45 (16), 5280-5289 (2006).
  41. Walcott, S., Warshaw, D. M., Debold, E. P. Mechanical coupling between myosin molecules causes differences between ensemble and single-molecule measurements. Biophysical Journal. 103 (3), 501-510 (2012).
  42. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  43. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  44. Goldmann, W. H., Isenberg, G. Analysis of filamin and alpha-actinin binding to actin by the stopped flow method. FEBS Letters. 336 (3), 408-410 (1993).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены