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Method Article
이 프로토콜은 오픈 소스 세포골격 시뮬레이션인 Cytosim을 사용하여 분자 모터와 수동 교차결합체로 연결된 필라멘트 네트워크의 동작을 조사하는 방법을 보여줍니다. 단계별 지침이 포함된 일반적인 워크플로우를 따라 가교제의 수를 변경하고 그에 따른 네트워크 수축성을 플롯합니다.
많은 세포골격 시스템은 이제 정확한 정량적 모델링이 가능할 만큼 충분히 잘 알려져 있습니다. 미세소관 및 액틴 필라멘트는 잘 특성화되어 있으며, 관련 단백질뿐만 아니라 그 풍부함 및 이러한 요소 간의 상호 작용이 잘 알려져 있습니다. 따라서 컴퓨터 시뮬레이션은 실험을 보완하는 방식으로 시스템의 집단 행동을 정확하게 조사하는 데 사용할 수 있습니다. Cytosim은 분자 모터와 같은 관련 단백질이 있는 유연한 필라멘트의 대규모 시스템을 처리하도록 설계된 오픈 소스 세포골격 시뮬레이션 제품군입니다. 또한 수동 가교제, 확산성 가교제, 핵기, 절단기 및 필라멘트의 비어 있는 격자 부위만 밟는 모터의 개별 버전을 시뮬레이션할 수 있는 가능성을 제공합니다. 다른 물체는 세포의 염색체, 핵 또는 소포를 나타내는 데 사용할 수 있는 구형 또는 더 복잡한 기하학을 제공하여 필라멘트를 보완합니다.
Cytosim은 시뮬레이션을 실행하고 결과를 표시하기 위한 간단한 명령줄 도구를 제공하며, 이는 다재다능하고 프로그래밍 기술이 필요하지 않습니다. 이 워크플로우에서는 i) 새 컴퓨터에 필요한 환경을 설치하고, ii) 2D 액토마이오신 네트워크의 수축을 시뮬레이션하도록 Cytosim을 구성하고, iii) 시스템의 시각적 표현을 생성하기 위한 단계별 지침이 제공됩니다. 다음으로, 시스템은 핵심 매개변수인 가교제의 수를 체계적으로 변화시켜 조사합니다. 마지막으로, 시스템의 시각적 표현은 수축성이 시스템의 구성에 따라 어떻게 달라지는지 그래프에서 볼 수 있도록 수축성의 수치화로 보완됩니다. 전반적으로, 이러한 다양한 단계는 세포골격 분야의 다른 많은 문제를 해결하기 위해 약간의 수정으로 적용할 수 있는 일반적인 워크플로우를 구성합니다.
세포골격은 세포 내의 필라멘트와 분자 모터와 같은 관련 분자로 구성되며, 이는 종종 놀라운 기계적 특성을 가진 역동적인 그물망을 구성합니다. 세포골격은 거의 모든 생명체에 걸쳐 다양한 세포 유형에서 다양한 구성으로 존재합니다. 그것의 올바른 기능은 분열, 운동성 및 분극과 같은 기본적인 세포 과정에 필수적입니다. 또한 세포 간의 기계적 상호 작용을 제어하여 조직과 유기체의 형태 형성에 영향을 미칩니다. 세포골격은 여러 기능의 기초가 되며 많은 생물학적 과정에서 나타납니다. 예를 들어, 근육의 수축은 액틴 필라멘트에 있는 미오신 분자 모터의 파워 스트로크와 관련이 있습니다. 또 다른 예는 뉴런의 유지인데, 이는 뉴런의 축삭돌기 내부에 위치한 미세소관을 따라 키네신 모터의 움직임에 의존합니다. 액틴(Actin)과 미세소관(microtubules)은 세포골격 필라멘트의 두 가지 뛰어난 유형이며, 이들이 없으면 우리가 알고 있는 생명체는 불가능할 것입니다.
세포골격은 본질적으로 생체역학적 시스템이며, 화학적 성질로만 환원될 수 없습니다. 미세소관 또는 액틴 필라멘트는 수천 개의 단량체로 만들어지며 수 마이크로미터에 걸쳐 확장됩니다. 공간에서 이러한 필라멘트의 형태와 원형질막, 핵 또는 기타 소기관에 전달할 수 있는 힘은 세포에서 필라멘트 역할의 핵심 측면입니다. 예를 들어, 액토미오신 피질1이라고 하는 액틴 필라멘트와 미오신 모터의 네트워크는 동물 세포의 세포 운동성과 형태학적 변화를 유지하기 위한 힘을 생성합니다. 식물 세포에서는 매우 다른 배열이 나타나는데, 피질 미세소관(cortical microtubules)이 셀룰로오스 섬유(cellulose fibrils)의 침착을 지시하여 세포벽 구조를 제어하며, 이는 궁극적으로 이러한 세포가 미래에 어떻게 성장할 것인지를 결정합니다2.
역학이 세포골격 작동에서 상당한 역할을 하는 것은 분명하지만, 화학도 똑같이 중요합니다. 필라멘트는 자기 조립 과정을 통해 성장하며, 단량체는 세포질3을 통해 확산된 후 필라멘트 끝에서 도킹 위치를 찾습니다. 분자 규모에서, 필라멘트 끝의 조립 및 분해는 따라서 분자 친화도(molecular affinities)4에 의해 결정된다. 유사하게, 세포골격의 단백질은 확산되고 결합 및 결합 해제 속도는 그들이 만나는 필라멘트에 대한 친화력을 결정합니다. 분자 모터의 경우, ATP 가수분해와 관련된 화학 반응의 주기는 필라멘트를 따른 움직임 및 필라멘트에 수반되는 힘과 관련이 있습니다5. 놀랍게도, 세포골격은 많은 특이한 도전 과제와 유사한 구성 요소를 포함하는 다양한 프로세스를 제공합니다. 생물학, 화학 및 물리학 사이의 인터페이스에 있는 풍부한 놀이터입니다.
세포골격계는 수학적 모델링에 적합합니다. 사실, 지난 수십 년 동안 수행된 훌륭한 연구 덕분에, 세포내이입6에서 볼 수 있듯이 주요 분자 구성 성분은 이미 확인되었을 가능성이 가장 높습니다. 효모와 같은 모델 유기체에서는 이러한 요소의 특성과 일부 프로세스에 대한 시스템 구성이 알려져 있습니다. 예를 들어, 미세소관(microtubules)7의 구조와 재료 특성, 그리고 유사분열 방추체(mitotic spindle)의 다양한 단계에서의 수와 평균 길이가 설명되었습니다8. 미세소관을 일관된 기계적 구조로 연결하는 키네신(kinesin)의 수는 종종 알려져 있습니다9. 많은 모터의 속도는 in vitro10에서 측정되었습니다. 또한 실험자는 야생형 또는 돌연변이 조건에서 생체 내에서 이러한 시스템을 관찰하고 정량화할 수 있습니다. 생체 내 및 체외 실험과 함께 이론을 결합하면 연구자들은 세포골격계에 대한 현재 지식이 관찰된 거동을 설명하기에 충분한지 테스트할 수 있습니다. 또한 수학적 및 계산 도구를 사용하면 일반적으로 단순화된 상황(예: 단일 분자 실험)에서 분자 규모의 관찰에서 파생된 가정을 기반으로 구성 요소가 집합적으로 어떻게 작동하는지 추론할 수 있습니다.
이론의 역할은 실제 사례인 섬모 박동을 사용하여 설명할 수 있습니다. 이 박동은 섬모의 미세소관을 따라 다인 모터의 움직임 때문입니다. 이 시스템에서 dynein 모터의 속도를 결정하는 것이 무엇인지 물을 수 있습니다. 한 가지 가능한 대답은 최대 속도가 특정 박동 패턴을 유지해야 하는 요구 사항에 의해 제한된다는 것입니다. 만약 그 박동이 자연선택에 의해 이루어졌다면 이것은 이해할 수 있을 것이다. 이 경우 모터가 더 빨리 움직이면 프로세스가 원하는 품질을 잃게 되어 섬모가 효율적으로 박동하지 못하거나 완전히 실패하게 됩니다. 이것이 가능하긴 하지만, 두 번째 대안은 어떤 내재적 요인이 dynein의 속도를 제한할 수 있다는 것입니다.
예를 들어, 세포에 다인(dynein)을 더 빨리 만들 수 있을 만큼 충분한 ATP가 없거나 다인(dynein)의 활동에 필요한 단백질 이동을 가속화할 수 없을 수 있습니다. 이 경우 물리적 한계에도 불구하고 모터를 더 빠르게 만들 수 있다면 박동이 향상될 것입니다. 물론 세 번째 가능성은 속도를 변경해도 프로세스에 큰 영향을 미치지 않으며, 이는 제어할 수 없는 요인에 대해 약간의 "견고성"을 제공함으로써 유기체에 유리할 수 있다는 것입니다. 이 세 가지 가능성 중에서 dynein의 속성에서 박동 패턴을 계산하여 올바른 가능성을 식별할 수 있습니다. 실제로, 적절한 수학적 모델은 박동 패턴이 다인인의 속도 변화에 의해 어떻게 영향을 받는지 예측해야 하며 물리적 세계에 존재하는 한계에 영향을 받지 않아야 합니다. 당연히 모델의 타당성을 검증해야 하지만 "잘못된" 모델조차도 흥미로운 아이디어를 생성할 수 있습니다.
모델은 분석 프레임워크의 형태를 취하거나 시스템의 수치 시뮬레이션일 수 있습니다. 어느 쪽이든, 분자 규모와 기능 규모 사이의 격차는 여전히 장애물로 남아 있으며, 여러 기계적 및 화학적 프로세스를 생물학적 시스템을 설명하는 방정식에 통합해야 하기 때문에 이러한 모델을 개발하는 것은 간단한 작업이 아닙니다. 이론은 다양한 형태로 나타나며 단순성과 현실성 사이의 다양한 절충안을 제공합니다. 모델의 세부 사항의 정도를 늘리는 것은 방정식을 푸는 능력, 즉 이론의 예측을 도출하는 능력을 제한할 수 있으므로 항상 유리한 것은 아닙니다. 시뮬레이션에도 동일한 절충안이 존재합니다. 모델러는 특정 측면을 무시하면서 고려해야 할 시스템의 구성 요소를 선택해야 합니다. 이러한 주요 결정은 연구의 목적에 따라 크게 달라집니다. 요즘에는 컴퓨터 하드웨어의 놀라운 발전으로 많은 세포골격계를 충분한 시간 동안 충분히 세부적으로 시뮬레이션할 수 있게 되었습니다. 이것은 종종 연구에서 예상치 못한 아이디어와 새로운 방향을 만들어낼 것입니다. 예를 들어, 이 프로토콜에서 사용될 것과 유사한 시뮬레이션은 구성의구성 11을 기반으로 네트워크의 수축성을 예측할 수 있는 백오브더엔벨로프(back-of-the-envelope) 계산으로 이어졌습니다.
수치적 방법은 공학 및 물리 과학에서 어디에나 존재하며 생물학에서 그 사용이 증가하고 있습니다. 오늘날 우리의 거의 모든 기술적 요소(시계, 전화, 자동차, 컴퓨터)는 컴퓨터에서 처음 고안되었으며, 이를 위한 강력한 소프트웨어가 존재합니다. 잘 특성화된 세포골격계가 주어지고 적절한 설명 수준이 결정되었다고 가정할 때, 시뮬레이션하기 전에 몇 가지 문제를 해결해야 합니다. 가장 간단한 문제의 경우 가장 적절한 작업 경로는 "처음부터 코딩하여" 시뮬레이션을 작성하는 것, 즉 일반 프로그래밍 언어 또는 MATLAB과 같은 수학적 플랫폼으로 시작하는 것일 수 있습니다. 이것은 코드 작성자가 구현된 내용에 대한 친밀한 지식을 가지고 소프트웨어가 어떻게 작동하는지 정확히 알 수 있다는 장점이 있습니다. 그러나 이 길에 위험이 없는 것은 아니며, 박사 과정 학생들이 과학적 질문을 다루기보다는 코드를 작성하는 데 대부분의 작업 시간을 소비하는 것을 목격하는 것은 드문 일이 아닙니다.
대안은 다른 사람이 고안한 소프트웨어를 사용하는 것이지만 위험이없는 것은 아닙니다. 모든 대규모 소스 코드는 이를 방지하기 위한 작성자의 가장 훌륭한 노력에도 불구하고 뚫을 수 없는 블랙 박스의 특성을 자발적으로 획득하는 경향이 있습니다. 블랙박스를 사용하는 것은 분명 과학자들의 꿈이 아니다. 소스 코드가 크면 골칫거리가 될 수도 있으며, 기존 코드 베이스를 수정하여 다른 작업을 수행하는 것보다 처음부터 시작하는 것이 더 빠를 수 있습니다. 이 문제를 완화하기 위해 언제든지 소프트웨어 작성자에게 도움을 요청할 수 있지만 이것만으로는 충분하지 않을 수 있습니다. 소프트웨어 작성자와 소프트웨어를 사용하려는 사람들 사이에는 종종 과학 문화의 차이가 있으며, 이는 많은 암묵적인 가정을 명확히 해야 함을 의미합니다. 코드를 오픈 소스로 만듦으로써 더 많은 사람들이 소프트웨어 개발에 참여하고 문서를 유지 관리하여 품질을 향상시킬 것으로 예상됩니다. 이 모든 것은 투자가 이루어지기 전에 적절하게 고려해야 하는 중요한 문제입니다. 그럼에도 불구하고 장기적으로 발전할 수 있는 유일한 방법은 공통의 과학적 관심사를 가진 광범위한 커뮤니티에서 사용하고 유지 관리하는 견고한 소프트웨어 솔루션을 촉진하는 것입니다.
이 프로토콜은 Cytosim을 사용하지만 AFINES12, MEDYAN13, CyLaKS14, aLENS15 및 AKYT16과 같이 동일한 시스템을 시뮬레이션할 수 있는 다른 오픈 소스 도구가 있습니다. 불행히도 이러한 프로젝트를 비교하는 것은 기사의 범위를 벗어납니다. 여기에서는 수축성 2D 액토미오신 네트워크를 시뮬레이션하기 위한 단계별 지침이 제공됩니다. 이 시스템은 간단하며 Cytosim의 더 잘 확립된 기능을 활용합니다. Cytosim은 2D 또는 3D로 시뮬레이션을 실행할 수 있는 크로스 플랫폼 코어 엔진을 기반으로 구축되었습니다. 모듈식 코드 기반이 있어 특정 작업을 수행하도록 쉽게 사용자 지정할 수 있습니다. Cytosim은 3D에서도 동일하게 안정적이고 효율적이며 과거에 미세소관 및 액틴 필라멘트와 관련된 다양한 문제를 조사하는 데 성공적으로 사용되었습니다 : 미세소관17의 두 과꽃의 연관성, 세포 18,19 내 핵의 움직임, 세포내 이입체6, 사이토 키네시스 20, 유사 분열 방추체21의 형성, 유사 분열 방추체22의 움직임, 염색체23의 포획, 액토미오신 네트워크11,24의 수축, 혈소판25에서 미세소관 고리의 역학 및 이러한 프로젝트를 위해 개발된 용량은 코드에서 유지되었습니다. 여기에 설명된 워크플로는 다른 많은 문제에 적용할 수 있습니다. 일부 독자에게는 익숙하지 않을 수 있는 Unix 명령줄을 사용합니다. 그러나 명령줄을 사용하는 것은 시뮬레이션 실행 프로세스를 자동화하는 가장 이식 가능하고 편리한 방법입니다. 통합 그래픽 사용자 인터페이스는 소프트웨어에 대한 쉽고 직관적인 액세스를 제공하는 것을 목표로 하지만 이는 종종 일반성을 희생해야 합니다. 이 기사의 목적은 쉽게 수정하거나 다른 문제에 적용할 수 있는 접근 방식을 설명하는 것입니다. 명령의 의미를 설명하기 위해 참고가 제공됩니다.
액토미오신 네트워크를 시뮬레이션하기 위해 필라멘트는 방향이 지정된 선으로 모델링되고 길이를 따라 분포된 꼭지점으로 표시됩니다(그림 1). 이것은 고분자 물리학에서 흔히 볼 수 있는 중간 수준의 설명으로, 필라멘트의 실제 3D 특성을 무시하지만 굽힘을 계산할 수 있습니다. 필라멘트는 말단에서 성장하고 수축할 수 있으며, 액틴과 미세소관 현상학을 모두 포함하는 다양한 모델을 따릅니다. 세포에서 필라멘트는 주로 자신의 움직임을 제한하는 상호 작용, 예를 들어 다른 필라멘트에 대한 부착 또는 단순히 세포 내 감금과 같은 상호 작용을 통해 조직됩니다. Cytosim에서 이러한 모든 상호 작용은 선형화되고 큰 행렬26으로 결합됩니다. 모든 필라멘트 꼭짓점의 움직임을 설명하는 방정식은 이 행렬에서 파생되며, 점성 매체와 브라운 운동을 나타내는 무작위 변동 항을 가정합니다. 이러한 방정식은 필라멘트에 작용하는 모든 힘과 함께 필라멘트의 움직임을 자기 일관성 있고 효율적인 방식으로 얻기 위해 수치로 해결됩니다26. 이 기계 엔진에 겹쳐진 확률적 엔진은 분자 모터의 부착 및 분리 또는 필라멘트의 조립 역학과 같은 개별 이벤트를 시뮬레이션합니다. 요약하면, Cytosim은 먼저 시뮬레이션된 역학을 사용하여 임의의 방식으로 연결된 필라멘트 네트워크의 역학을 계산하고, 두 번째로 확률적 방법을 사용하여 필라멘트를 연결하거나 영향을 미치는 단백질의 결합, 바인딩 해제 및 확산을 시뮬레이션합니다.
여기에 설명된 워크플로우는 Cytosim을 사용하여 시스템을 처음 탐색하기 위해 자주 따랐습니다. 많은 잠재적 사용자에게 중요한 단계는 소프트웨어 구성 요소를 설치하는 것일 수 있습니다. 소프트웨어를 소스 코드로 배포하는 것은 오픈 사이언스의 필수 요소를 충족하지만, 소프트웨어 개발자가 프로그램을 테스트하기 위해 제한된 아키텍처 풀에만 액세스할 수 있기 때문에 오류가 발생하기 쉽습니다. 운영 체제가 다르기 때문에 컴파일이 실패할 수 있습니다. 여기에 제공된 지침은 컴퓨터 시스템과 소스 코드가 발전함에 따라 더 이상 사용되지 않을 수 있습니다. 따라서 온라인에서 최신 지침을 주기적으로 확인하는 것이 필수적입니다. 문제가 발생할 경우 사용자가 관련 피드백 채널(현재 Gitlab의 Cytosim 홈페이지)에 게시하여 문제를 해결하는 데 도움을 주도록 적극 권장합니다.
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참고: 프로토콜은 다음 단계로 구성됩니다: Windows 10, MacOS 및 Linux에 대한 플랫폼 준비; Cytosim의 설치; 시뮬레이션 및 테스트 실행 및 그래픽 디스플레이의 구성; 여러 번의 실행, 다양한 매개 변수 : 네트워크의 가교 자 수; 수축성이 crosslinkers의 수에 의해 어떻게 영향을 받는지를 보기 위해 그래프를 생성하는 단계; 병렬 실행; 및 무작위 샘플링. ">" 다음에 오는 모든 텍스트는 터미널 창에 그대로 입력해야 하는 명령입니다. ">"는 터미널 프롬프트를 나타내며 포함되어서는 안 되지만 다른 모든 문자는 중요합니다.
1. 플랫폼 준비
참고: OS(MacOS, Windows 10 또는 Linux)에 따라 1.1단계, 1.2단계 또는 1.3단계를 수행합니다.
2. Cytosim 설치
참고: 이러한 단계는 MacOS, WSL 및 Linux와 같은 모든 OS에서 유사합니다. 다음 섹션에서는 터미널에서 명령이 실행되며 "현재 작업 디렉토리"는 시뮬레이션이 컴파일된 디렉토리로 설정되어야 합니다. 이 디렉토리를 기본 디렉토리라고 합니다. 또는 필요에 따라 파일을 복사하는 경우 별도의 디렉토리에서 모든 작업을 수행할 수 있습니다. 명령줄에 익숙하지 않은 경우 자습서(예: https://www.learnenough.com/command-line-tutorial 또는 https://learnpythonthehardway.org/book/appendixa.html)를 따르는 것이 좋습니다.
3. 시뮬레이션의 구성
4. 매개 변수 스윕
참고: 이 섹션에서는 네트워크의 가교제의 수가 체계적으로 다양합니다.
5. 그래프 만들기
참고: 이 섹션에서는 매개변수 스윕의 결과에서 플롯이 만들어집니다.
6. 그래프를 만드는 다른 방법
7. 무작위 샘플링을 사용한 플롯 개선
참고 : 변수는 Python의 "random"모듈의 생성기 함수를 사용하여 여기에서 샘플링됩니다.
8. 완전 자동화된 파이프라인
참고: 이 부분에서는 수동 개입이 필요한 모든 작업이 명령으로 대체됩니다. 이 작업이 완료되면 모든 단계를 자동으로 수행하는 단일 스크립트를 작성할 수 있습니다. 이 스크립트는 컴퓨팅 팜과 같은 원격 컴퓨터에서 실행할 수 있습니다.
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섹션 2에서 "make"를 사용하여 Cytosim을 성공적으로 컴파일하면 "bin" 하위 디렉토리에 sim, play 및 report가 생성되어야 합니다. 2.3단계("sim info")의 출력에는 무엇보다도 "Dimension: 2"가 표시되어야 합니다. 섹션 3에서 구성 파일은 보조 파일 1로 제공되는 jove.cym과 유사해야 합니다. 섹션 4에서, 시뮬레이션에서 4.8단계에서 얻은 마법사는
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이 기사에서 설명하는 방법은 설명된 프로토콜 전체에서 다양한 방식으로 사용된 세 개의 작고 독립적인 Python 프로그램에 의존합니다. 첫 번째 스크립트 사전 구성은 사용자 정의 Python 스크립트 작성의 필요성을 대체할 수 있는 다목적 도구입니다27. 단일 템플릿 파일에서 여러 구성 파일을 생성하는 데 사용되며, 어떤 매개 변수를 변경해야 하고...
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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
SLCU 모델링 클럽의 회원들, 특히 Tamsin Spelman, Renske Vroomans, Cameron Gibson, Genevieve Hines, Euan Smithers와 프로토콜의 베타 테스터인 Wei Xiang Chew, Daniel Cortes, Ronen Zaidel-Bar, Aman Soni, Chaitanya Athale, Kim Bellingham-Johnstun, Serge Dmitrieff, Gaëlle Letort, Ghislain de Labbey에게 감사드립니다. 개츠비 자선 재단(Grant PTAG-024)과 유럽 연구 위원회(ERC Synergy Grant, 프로젝트 951430)의 지원에 감사드립니다.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
A personal computer | MacOS, Windows 10 or Linux | ||
config.cym.tpl | template configuration file; https://gitlab.com/f-nedelec/cytosim.git | ||
jove.cym | Cytosim configuration file | ||
make_page.py | Python script; https://github.com/nedelec/make_page.py | ||
preconfig | Python script; https://github.com/nedelec/preconfig | ||
scan.py | Python script; https://github.com/nedelec/scan.py |
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