JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol bir biyomoleküler simülasyon paketi kullanır ve vahşi tip kaspaz ve mutant formlarını modellemek için moleküler dinamik (MD) yaklaşımını açıklar. MD yöntemi, kaspaz yapısının dinamik evrimini ve mutasyonların veya post-translasyonel modifikasyonların potansiyel etkisini değerlendirmeye izin verir.

Özet

Apoptoz, hasarlı hücreleri ortadan kaldıran ve çok hücreli organizmaların gelişimini ve doku homeostazını kontrol eden bir tür programlanmış hücre ölümüdür. Sistein proteazlarının bir ailesi olan kaspazlar, apoptozun başlatılmasında ve uygulanmasında anahtar rol oynamaktadır. Kaspazların olgunlaşması ve aktiviteleri, son derece dinamik bir şekilde çeviri sonrası modifikasyonlarla ince ayarlanmıştır. Translasyonel sonrası değişikliklerin etkisini değerlendirmek için, potansiyel bölgeler rutin olarak herhangi bir modifikasyona kalıcı kalıntılarla mutasyona uğrar. Örneğin, serin kalıntısı alanin veya aspartik asit ile değiştirilir. Bununla birlikte, bu tür ikameler kaspaz aktif bölgesinin konformasyonunu değiştirebilir ve katalitik aktivite ve hücresel fonksiyonlarda bozulmalara neden olabilir. Ayrıca, kritik pozisyonlarda bulunan diğer amino asit kalıntılarının mutasyonları da kaspazların yapısını ve fonksiyonlarını bozabilir ve apoptoz pertürbasyonuna yol açabilir. Mutasyona uğramış kalıntıların kullanılmasının zorluklarından kaçınmak için, amino asit ikamelerinin kaspaz yapısı üzerindeki potansiyel etkisini tahmin etmek için moleküler modelleme yaklaşımları kolayca uygulanabilir. Mevcut protokol, mutasyonların protein yapısı ve fonksiyonu üzerindeki etkisini test etmek için hem vahşi tip kaspaz hem de mutant formlarının biyomoleküler simülasyon paketi (Amber) ve süper bilgisayar tesisleri ile modellenmesine izin verir.

Giriş

Apoptoz, çok hücreli organizmaların morfogenezini ve doku homeostazını düzenleyen en çok çalışılan hücresel süreçlerden biridir. Apoptoz, ölüm reseptörlerinin aktivasyonu, hücre döngüsü sinyallerindeki bozulma, DNA hasarı, endoplazmik retikulum (ER) stresi ve çeşitli bakteriyel ve viral enfeksiyonlar gibi çok çeşitli dış veya iç uyaranlarla başlatılabilir1. Kaspazlar - anahtar apoptotik oyuncular - geleneksel olarak iki gruba ayrılır: başlatıcılar (kaspaz-2, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-10) ve efektörler (kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7), etki alanı yapılarına ve kaspaz kaskadın 2,3'teki yerine bağlı olarak. Hücre ölüm sinyalleri üzerine, başlatıcı kaspazlar, aktif bir enzim oluşturmak için yakınlık kaynaklı dimerizasyonu ve otomatik işlemeyi kolaylaştıran adaptör molekülleri ile etkileşime girer. Efektör kaspazlar, başlatıcı kaspazlar tarafından bölünme yoluyla aktive edilir ve çoklu hücresel substratları parçalayarak aşağı akış yürütme adımlarını gerçekleştirir4.

Başlatıcı ve efektör kaspazların olgunlaşması ve işlevi, translasyonel sonrası modifikasyonun hücre ölümü modülasyonunda vazgeçilmez bir rol oynadığı çok sayıda farklı hücre içi mekanizma tarafından düzenlenir5. Modifiye edici grupların (fosforilasyon, nitrosilasyon, metilasyon veya asetilasyon) veya proteinlerin (ubikitinasyon veya SUMOilasyon) eklenmesi, kaspazların enzimatik aktivitesini veya apoptozu düzenleyen protein konformasyonunu ve stabilitesini değiştirir. Sahaya yönelik mutagenez, potansiyel post-translasyonel modifikasyon bölgelerini araştırmak ve rollerini ayırt etmek için yaygın olarak uygulanmaktadır. Varsayılan bir modifikasyon bölgesi genellikle daha fazla değiştirilemeyen başka bir amino asit ile değiştirilir. Böylece, potansiyel olarak fosforile serin ve treonin, alanine mutasyona uğrar ve lizin ubikitinasyon bölgeleri arginin ile değiştirilir. Başka bir strateji, özellikle post-translasyonel modifikasyonu taklit eden bir amino asidin ikame edilmesini içerir (örneğin, fosforile serin veya treonini taklit etmek için glutamat ve aspartat kullanılmıştır)6. Bununla birlikte, aktif bir bölgenin yüksek çevresinde veya kritik pozisyonlarda bulunan bu ikamelerin bazıları kaspaz yapısını değiştirebilir, katalitik aktiviteyi bozabilir ve apoptotik hücre ölümünü baskılayabilir7. Benzer etkiler, kaspaz genlerinde tümörle ilişkili yanlış anlam mutasyonları vakalarında da gözlenebilir. Örneğin, kaspaz-6'nın tümörle ilişkili mutasyonu - R259H - substrat bağlayıcı cepteki döngülerin konformasyonel değişikliklerine neden oldu ve substratların verimli katalitik döngüsünü azalttı8. Baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomunda tanımlanan kaspaz-8'deki G325A amino asit ikamesi, nükleer faktör-kB (NF-kB) sinyallemesinin modülasyonuna yol açan ve tümörigenezi teşvik eden kaspaz-8 aktivitesini engelleyebilir9.

Amino asit ikamelerinin kaspaz yapısı ve fonksiyonu üzerindeki potansiyel etkisini değerlendirmek için moleküler modelleme uygulanabilir. Moleküler dinamik (MD) yaklaşımı, biyomoleküler simülasyon paketi (Amber) kullanılarak vahşi tip kaspaz ve mutant formlarının modellenmesi için bu çalışmada açıklanmıştır. MD yöntemi, mutasyonların ortaya çıkmasını takiben protein yapısının dinamik evrimi hakkında bir fikir verir. Başlangıçta Peter Kollman'ın grubu tarafından geliştirilen Amber paketi, biyomoleküler simülasyonlar için en popüler yazılım araçlarından biri haline geldi10,11,12,13. Bu yazılım iki bölüme ayrılmıştır: (1) AmberTools, sistem hazırlığı (atom tipi atama, hidrojen ve açık su molekülleri ekleme, vb.) ve yörünge analizi için rutin olarak kullanılan programların bir koleksiyonu; ve (2) pmemd simülasyon programı etrafında merkezlenen Amber. AmberTools ücretsiz bir pakettir (ve Amber'in kendisini kurmak için bir ön koşuldur), Amber ise ayrı bir lisans ve ücret yapısı ile dağıtılmaktadır. Bir süper bilgisayarda ve / veya grafik işlem birimleri (GPU'lar) kullanılarak yapılan paralel simülasyonlar, protein yapı dinamiklerinin bilimsel araştırması için performansı önemli ölçüde artırabilir14. Mevcut en son yazılım sürümleri AmberTools21 ve Amber20'dir, ancak açıklanan protokoller eski sürümlerle de kullanılabilir.

Protokol

1. Sistem hazırlığı

NOT: Doğal ve mutant protein formlarının moleküler modelleri, Protein Bilgi Bankası 15,16'dan elde edilen uygun bir kristal yapıya dayanarak oluşturulmuştur.

  1. Seçilen PDB yapısını almak için, Dosyaları İndir açılır listesini kullanın ve PDB Biçimi'ne tıklayın. Açıklamaları ve bağlantı verilerini kaldırın ve PDB dosyasındaki ayrı protein zincirleri arasına bir TER kartı takın. İsteğe bağlı olarak, HIS kalıntı adını HIE, HID veya HIP (Ek Dosya 1) ile değiştirerek histidin kalıntılarının protonasyon durumunu ayarlayın.
    NOT: Kristalografik olarak çözülmüş su moleküllerini (PDB dosyasında varsa) çıkarmamak mantıklıdır.
  2. Başlangıç modelini hazırlamak için tleap programını (AmberTools paketi) başlatın ve ardından tleap nesnelerini işleyen komutlar girin.
    1. Programı başlatın: tleap. Proteini moleküler mekanikle tanımlamak için ff14SB kuvvet alanını yükleyin: > kaynak leaprc.protein.ff14SB.
    2. Su molekülleri ve atomik iyonlar için yük kuvveti alanları (Na +, Cl-): > kaynağı leaprc.water.tip3p.
    3. PDB dosyasını yükleyin ve mol: > mol = loadpdb protein.pdb adlı bir nesne oluşturarak hidrojenler için koordinatlar oluşturun.
    4. Sorunlara neden olabilecek dahili tutarsızlıkları kontrol edin: > mol'ü kontrol edin.
      NOT: Disülfür köprüleri, varsa, el ile belirtilmelidir. Kovalent olarak bağlanmış sistein CYS isimlerini CYX ile değiştirin ve SG atomları arasında bir bağ oluşturmak için tleap'a aşağıdaki komutu yazın: bağ mol.X.SG mol.Y.SG (X ve Y, sistein kalıntı sayılarıdır).
    5. Proteinin etrafında bir çözücü kutusu oluşturun (TIP3P su, 12 şmesafe): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
    6. Toplam şarjı kontrol edin: > şarj mol ve sistemi nötralize etmek için sayaçlar (Na + veya Cl-) ekleyin:
      > eklemeler mol Na+ 0.
    7. Topoloji prmtop dosyasını ve koordinat inpcrd dosyasını (simülasyon çalıştırmak için girişler) oluşturun: > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Kalabalığı programından çıkın: > çıkın.
      NOT: Amber formatlı koordinat dosyaları, ambpdb aracı kullanılarak kolayca PDB formatına dönüştürülebilir (Kullanıcı El Kitabı'na bakın, bkz.

2. Enerji minimizasyonu

NOT: Enerji minimizasyonu, MD çalıştırılırken kararsızlığa yol açan başlangıç sistemindeki atomlar arasındaki kötü temasları ve örtüşmeleri gidermek için gereklidir.

  1. Eklenen hidrojen atomlarının ve su moleküllerinin konumlarını optimize etmek için enerji minimizasyonunun ilk aşamasını (en dik iniş algoritmasının 2.500 adımı + eşlenik gradyan algoritmasının 2.500 adımı) gerçekleştirirken, protein koordinatlarını ağır atomlar üzerindeki konumsal kısıtlamalarla sabit tutun.
    1. PMEMD programını aşağıdaki gibi çalıştırın:
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
    2. Gerekli bağımsız değişkenleri izleyin: -i FILE denetim verileri; -p FILE moleküler topolojisi, kuvvet alanı parametreleri, atom adları; -c DOSYA başlangıç koordinatları; -o FILE kullanıcı tarafından okunabilir günlük çıktısı; -r DOSYA son koordinatları; -ref Konum kısıtlamaları için FILE referans koordinatları.
    3. Giriş dosyası min1.in seçenekleri belirtin:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      kesik=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10,
      ntr=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2.0
      /
      NOT: Giriş seçenekleri: imin=1 simge durumuna küçültme gerçekleştirir; maxcyc=5000 maksimum minimize çevrim sayısı; ncyc=2500 minimizasyon yöntemi, ncyc döngülerinden sonra en dik inişten konjuge gradyana geçirilir; cut=10.0 bağlanmamış kesme (Å); ntb = 1 periyodik sınırlar uygulanır, sabit hacim; ntc = 1 bağ uzunluklarına hiçbir kısıtlama uygulanmaz (daha iyi enerji yakınsaması için); ntf=1 tüm etkileşimler hesaplanır; ntpr=10 enerji bilgisi her ntpr adımında çıkış dosyasına yazdırılır; ntr=1 harmonik potansiyel kullanarak belirtilen atomları kısıtlamak için bayrak; restraintmask=':1-517 & !@H=' kısıtlanmış atomları belirtir; restraint_wt kısıtlamalar için 2,0 ağırlık (kcal/mol∙Å2).
  2. Tüm sistemi optimize etmek için enerji minimizasyonunun ikinci aşamasını (5.000 en dik iniş adımı + 5.000 eşlenik gradyan adımı) kısıtlama olmadan gerçekleştirin.
    1. min2.in ve protein_min1.rst dosyalarını girdi olarak kullanın:pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
    2. Giriş dosyası min2.in seçenekleri belirtin:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      kesik=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10
      /

3. Isıtma

NOT: Bu aşama sistemi 0 K'dan 300 K'ya ısıtmayı amaçlamaktadır. PDB dosyasına dayanan başlangıç modeli hız bilgisi içermediğinden başlangıç hızları atomlara atanır.

  1. Isıtma işlemini protein atomları üzerindeki konumsal kısıtlamalarla gerçekleştirin (50 ps, sabit hacim).
    1. heat.in ve protein_min2.rst dosyalarını giriş olarak kullanın:pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
    2. Gerekli bağımsız değişkenleri izleyin: MD yörüngesi üzerinden kaydedilen -x FILE koordinat kümeleri.
    3. Giriş dosyası heat.in seçenekleri belirtin:
      &cntrl
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      kesik=10.0, ntb=1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      tempi=0.0, temp0=300.0,
      ntr=1, kısıtlama maskesi=':1-517',
      restraint_wt=1.0,
      nmropt=1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      değer1=0,1, değer2=300,0 /
      &wt TYPE='SON' /
      NOT: Giriş seçenekleri: imin=0 MD'yi çalıştırın; irest=0 yeni bir simülasyon çalıştırın; ntx=1 rst dosyasından hiçbir başlangıç hızı okunmaz; nstlim=25000 MD adım sayısı; dt=0,002 zaman adımı (ps); ntc = 2 hidrojen içeren bağlar SHAKE algoritması kullanılarak kısıtlanır; ntf = 2 kısıtlı bağlar için kuvvetler hesaplanmaz; ntwx = 500 koordinatları her ntwx adımında mdcrd dosyasına yazılır; ntt=3 Langevin sıcaklık regülasyonu; Langevin dinamiği için gamma_ln=2.0 çarpışma frekansı (ps−1); tempi = 0.0 başlangıç sıcaklığı; temp0=300.0 referans sıcaklığı; nmropt=1 &wt ad listesinde belirtilen parametreler okunur; TYPE='TEMP0' hedef sıcaklığı değiştirir.

4. Denge

NOT: Bu aşama, suyun yoğunluğunu ayarlamak ve proteinin denge durumunu elde etmek için gereklidir.

  1. Dengeyi herhangi bir kısıtlama olmadan 300 K'da gerçekleştirin (500 ps, sabit basınç).
    1. equil.in ve protein_heat.rst dosyalarını girdi olarak kullanın:pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
    2. Giriş dosyası equil.in seçenekleri belirtin:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300.0
      /
      NOT: Giriş seçenekleri: irest=1 simülasyonu yeniden başlatın; ntx=5 koordinatları ve hızları önceden oluşturulmuş bir rst dosyasından okunur; ntb = 2 periyodik sınırlar uygulanır, sabit basınç; ntp=1 izotropik basınç ölçekleme; taup=2.0 basınç gevşeme süresi (ps); ntwr = 50000 her ntwr adımında, rst dosyası yazılır ve bir çökmeden kurtarma sağlanır.

5. Üretim dinamikleri

  1. Denge başarıyla sağlandıktan sonra, sabit basınçta bir üretim MD simülasyonu (10 ns veya daha uzun) gerçekleştirin ve protein yapısının sonraki analizi için yörünge dosyasını oluşturun.
    1. prod.in ve protein_equil.rst dosyalarını giriş olarak kullanın:pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
    2. Giriş dosyası prod.in seçenekleri belirtin:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300.0, ig=-1
      /
      NOT: pmemd'nin paralel sürümü (pmemd. MPI) veya GPU hızlandırmalı sürüm (pmemd.cuda) bilgisayar kümelerinde ve süper bilgisayarlarda kullanılabilir. Uzun bir MD simülasyonu birkaç bölüme ayrılabilir ve sırayla gerçekleştirilebilir. Her simülasyon yeniden başlatma işlemi için ig=-1 (rastgele çekirdek seçeneği) ayarlanması önemle tavsiye edilir. Ptraj veya cppptraj programları, koordinat yörüngelerinin analizi ve işlenmesi için kullanılabilir. Daha fazla bilgi için, yazılım Kullanım Kılavuzu'na bakın.

Sonuçlar

Mevcut protokol, kaspazların veya patojenik mutasyonların post-translasyonel modifikasyonu çalışmalarında kolayca uygulanabilir. Bu bölümde, kaspaz-27 çalışmasında başarıyla kullanılan MD modelleme iş akışı gösterilmiştir (Şekil 1). Potansiyel fosforilasyon bölgelerinin (Ser/Thr to Ala) in vitro bölgeye yönelik mutagenezi ve biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak, Ser384Ala mutasyonunun kaspaz-2 işlemesini önlediği ve enzimatik a...

Tartışmalar

Açıklanan MD yaklaşımı, biyomoleküler simülasyon paketlerini kullanarak hem vahşi tip hem de mutant kaspaz formlarının modellenmesine izin verir. Metodolojinin birkaç önemli konusu burada tartışılmaktadır. İlk olarak, Protein Veri Bankası'ndan kaspazın temsili bir kristal yapısının seçilmesi gerekir. Önemli olarak, kaspazın hem monomerik hem de dimerik formları kabul edilebilir. Minimum sayıda eksik kalıntı içeren yüksek çözünürlüklü yapıların seçilmesi iyi bir fikirdir. Bazı kal?...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Rus Bilim Vakfı'ndan (17-75-20102, protokol geliştirme) bir hibe ile desteklenmiştir. Temsili sonuçlar bölümünde (fosforilasyon analizi) açıklanan deneyler Stockholm (181301) ve İsveç (190345) Kanser Dernekleri tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber20University of California, San FranciscoSoftware for molecular dynamics simulation
http://ambermd.org
AmberTools21University of California, San FranciscoSoftware for molecular modeling and analysis
http://ambermd.org

Referanslar

  1. Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
  2. Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
  3. Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
  4. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
  5. Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
  6. Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
  7. Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
  8. Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
  9. Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
  10. Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
  11. Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
  12. Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
  13. Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
  14. Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
  15. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  16. Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
  17. Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
  18. Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
  19. Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 188

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır