Explorer les mutations des caspases et la modification post-traductionnelle par des approches de modélisation moléculaire

Résumé

Le présent protocole utilise un ensemble de simulation biomoléculaire et décrit l’approche de dynamique moléculaire (DM) pour modéliser la caspase de type sauvage et ses formes mutantes. La méthode MD permet d’évaluer l’évolution dynamique de la structure des caspases et l’effet potentiel de mutations ou de modifications post-traductionnelles.

Résumé

L’apoptose est un type de mort cellulaire programmée qui élimine les cellules endommagées et contrôle le développement et l’homéostasie tissulaire des organismes multicellulaires. Les caspases, une famille de cystéines protéases, jouent un rôle clé dans l’initiation et l’exécution de l’apoptose. La maturation des caspases et leur activité sont affinées par des modifications post-traductionnelles de manière très dynamique. Pour évaluer l’effet des changements post-traductionnels, les sites potentiels sont systématiquement mutés avec des résidus persistants à toute modification. Par exemple, le résidu de sérine est remplacé par de l’alanine ou de l’acide aspartique. Cependant, de telles substitutions pourraient altérer la conformation du site actif de la caspase, entraînant des perturbations de l’activité catalytique et des fonctions cellulaires. De plus, des mutations d’autres résidus d’acides aminés situés dans des positions critiques pourraient également briser la structure et les fonctions des caspases et entraîner une perturbation de l’apoptose. Pour éviter les difficultés liées à l’utilisation de résidus mutés, des approches de modélisation moléculaire peuvent être facilement appliquées pour estimer l’effet potentiel des substitutions d’acides aminés sur la structure des caspases. Le protocole actuel permet la modélisation de la caspase de type sauvage et de ses formes mutantes avec le progiciel de simulation biomoléculaire (Amber) et des installations de superordinateur pour tester l’effet des mutations sur la structure et la fonction des protéines.

Introduction

L’apoptose est l’un des processus cellulaires les plus étudiés qui régulent la morphogenèse et l’homéostasie tissulaire des organismes multicellulaires. L’apoptose peut être initiée par un large éventail de stimuli externes ou internes, tels que l’activation des récepteurs de mort, la perturbation des signaux du cycle cellulaire, les dommages à l’ADN, le stress du réticulum endoplasmique (RE) et diverses infections bactériennes et virales¹. Les caspases - acteurs clés de l’apoptose - sont classiquement classées en deux groupes: les initiateurs (caspase-2, caspase-8, caspase-9 et caspase-10) et les effecteurs (caspase-3, caspase-6 et caspase-7), en fonction de leur structure de domaine et de la place dans la cascade des caspases ^2,3. Lors des signaux de mort cellulaire, les caspases initiatrices interagissent avec les molécules adaptatrices qui facilitent la dimérisation induite par la proximité et l’autotraitement pour former une enzyme active. Les caspases effectrices sont activées par clivage par les caspases initiatrices et effectuent des étapes d’exécution en aval en clivant plusieurs substrats cellulaires⁴.

La maturation et la fonction des caspases initiatrices et effectrices sont régulées par un grand nombre de mécanismes intracellulaires différents, parmi lesquels la modification post-traductionnelle joue un rôle indispensable dans la modulation de la mort cellulaire⁵. L’ajout de groupes modificateurs (phosphorylation, nitrosylation, méthylation ou acétylation) ou de protéines (ubiquitination ou SUMOylation) modifie l’activité enzymatique des caspases ou la conformation et la stabilité des protéines qui régulent l’apoptose. La mutagénèse dirigée est largement appliquée pour étudier les sites potentiels de modification post-traductionnelle et discerner leur rôle. Un site de modification putatif est généralement remplacé par un autre acide aminé, qui ne peut plus être modifié. Ainsi, la sérine et la thréonine potentiellement phosphorylées sont mutées en alanine, et les sites d’ubiquitination de la lysine sont remplacés par de l’arginine. Une autre stratégie consiste à substituer un acide aminé qui imite particulièrement la modification post-traductionnelle (p. ex., le glutamate et l’aspartate ont été utilisés pour imiter la sérine phosphorylée ou la thréonine)⁶. Cependant, certaines de ces substitutions situées à proximité élevée d’un site actif ou dans des positions critiques pourraient modifier la structure des caspases, perturber l’activité catalytique et supprimer la mort cellulaire apoptotique⁷. Des effets similaires ont pu être observés dans les cas de mutations faux-sens associées à la tumeur dans les gènes de la caspase. Par exemple, la mutation tumorale de la caspase-6 - R259H - a entraîné des modifications conformationnelles des boucles dans la poche de liaison au substrat, réduisant le renouvellement catalytique efficace des substrats⁸. La substitution d’acides aminés G325A dans la caspase-8 identifiée dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou pourrait entraver l’activité de la caspase-8, ce qui a conduit à la modulation de la signalisation du facteur nucléaire kB (NF-kB) et a favorisé la tumorigenèse⁹.

Pour évaluer l’effet potentiel des substitutions d’acides aminés sur la structure et la fonction des caspases, la modélisation moléculaire peut être appliquée. L’approche de la dynamique moléculaire (DM) est décrite dans ce travail pour modéliser la caspase de type sauvage et ses formes mutantes à l’aide du package de simulation biomoléculaire (Amber). La méthode MD donne une vue de l’évolution dynamique de la structure protéique suite à l’introduction de mutations. Développé à l’origine par le groupe de Peter Kollman, le package Amber est devenu l’un des outils logiciels les plus populaires pour les simulations biomoléculaires^10,11,12,13. Ce logiciel est divisé en deux parties: (1) AmberTools, un ensemble de programmes couramment utilisés pour la préparation du système (affectation du type d’atome, ajout d’hydrogènes et de molécules d’eau explicites, etc.) et l’analyse de trajectoire; et (2) Amber, qui est centré sur le programme de simulation pmemd. AmberTools est un package gratuit (et une condition préalable à l’installation d’Amber lui-même), tandis qu’Amber est distribué avec une licence et une structure de frais distinctes. Des simulations parallèles sur un supercalculateur et/ou à l’aide d’unités de traitement graphique (GPU) peuvent améliorer considérablement les performances de la recherche scientifique sur la dynamique de la structure des protéines¹⁴. Les dernières versions logicielles disponibles sont AmberTools21 et Amber20, mais les protocoles décrits peuvent également être utilisés avec les versions précédentes.

Protocole

1. Préparation du système

NOTE: Les modèles moléculaires des formes protéiques natives et mutantes sont construits sur la base d’une structure cristalline appropriée obtenue à partir de la banque de données sur les protéines^15,16.

1. Pour récupérer la structure PDB sélectionnée, utilisez la liste déroulante Télécharger les fichiers et cliquez sur Format PDB. Supprimez les remarques et les données de connectivité, puis insérez une carte TER entre des chaînes protéiques distinctes dans le fichier PDB. Vous pouvez éventuellement définir l’état de protonation des résidus d’histidine en remplaçant le nom du résidu HIS par HIE, HID ou HIP (dossier supplémentaire 1).
   REMARQUE: Il est raisonnable de ne pas enlever les molécules d’eau résolues cristallographiquement (si elles sont présentes dans le fichier PDB).
2. Pour préparer le modèle de départ, lancez le programme tleap (package AmberTools), puis entrez des commandes qui manipulent les objets tleap .
   1. Lancez le programme : tleap. Chargez le champ de force ff14SB pour décrire la protéine avec la mécanique moléculaire : > source leaprc.protein.ff14SB.
   2. Champs de force de charge pour les molécules d’eau et les ions atomiques (Na⁺, Cl^-): > source leaprc.water.tip3p.
   3. Chargez le fichier PDB et créez des coordonnées pour les hydrogène, en créant un objet nommé mol : > mol = loadpdb protein.pdb.
   4. Vérifiez les incohérences internes qui pourraient causer des problèmes: > vérifiez mol.
      REMARQUE : Les ponts disulfures, s’ils sont présents, doivent être spécifiés manuellement. Remplacez les noms des cystéines liées par covalence CYS par CYX et tapez la commande suivante dans tleap pour créer une liaison entre les atomes SG: liaison mol.X.SG mol.Y.SG (X et Y sont des nombres de résidus de cystéine).
   5. Créer une boîte de solvant autour de la protéine (eau TIP3P, distance 12 Å) : > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
   6. Vérifiez la charge totale: > charge mol, et ajoutez des contre-ions (Na⁺ ou Cl^-) pour neutraliser le système:
      > addions mol Na⁺ 0.
   7. Créez le fichier de topologie prmtop et le fichier de coordonnées inpcrd (entrées pour l’exécution d’une simulation) : > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Quittez le programme tleap : > quittez.
      REMARQUE: Les fichiers de coordonnées au format orange peuvent être facilement convertis au format PDB à l’aide de l’outil ambpdb (reportez-vous au manuel de l’utilisateur, voir le tableau des matériaux).

2. Minimisation de l’énergie

REMARQUE: La minimisation de l’énergie est nécessaire pour éliminer les mauvais contacts et les chevauchements entre les atomes dans le système de démarrage qui conduisent à l’instabilité lors de l’exécution de MD.

1. Réaliser la première étape de la minimisation de l’énergie (2 500 pas de l’algorithme de descente la plus raide + 2 500 pas de l’algorithme de gradient conjugué) pour optimiser les positions des atomes d’hydrogène et des molécules d’eau ajoutés tout en gardant les coordonnées protéiques fixées par des contraintes de position sur les atomes lourds.
   1. Exécutez le programme pmemd comme suit :
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
   2. Suivez les arguments requis : -i Données de contrôle de fichier ; -p Topologie moléculaire du FICHIER, paramètres du champ de force, noms des atomes; -c Coordonnées initiales du DOSSIER; -o Sortie de journal lisible par l’utilisateur ; -r Coordonnées finales du DOSSIER; -ref Coordonnées de référence FILE pour les dispositifs de retenue de position.
   3. Spécifiez les options dans le fichier d’entrée min1.in :
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10,
      ntr=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2,0
      /
      REMARQUE: Options d’entrée: imin=1 effectuer la minimisation; maxcyc = 5000 nombre maximum de cycles de minimisation; La méthode de minimisation ncyc=2500 est passée de la descente la plus raide à la pente conjuguée après les cycles ncyc ; coupure = 10,0 coupure non liée (Å); ntb=1 des limites périodiques sont imposées, volume constant; ntc=1 aucune contrainte n’est appliquée aux longueurs de liaison (pour une meilleure convergence énergétique); NTF=1 toutes les interactions sont calculées; NTPR = 10 informations énergétiques sont imprimées dans le fichier de sortie à chaque étape NTPR ; ntr=1 indicateur pour retenir des atomes spécifiés à l’aide d’un potentiel harmonique; restraintmask=':1-517 & !@H=' spécifie les atomes restreints; restraint_wt=2,0 poids (kcal/mol∙Ų) pour les dispositifs de retenue positionnels.
2. Effectuer la deuxième étape de la minimisation énergétique (5 000 marches de descente les plus raides + 5 000 marches de pente conjuguées) sans contraintes pour optimiser l’ensemble du système.
   1. Utilisez min2.in et protein_min1.rst comme entrées : pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. Spécifiez les options dans le fichier d’entrée min2.in :
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      NTPR = 10
      /

3. Chauffage

REMARQUE: Cette étape vise à chauffer le système de 0 K à 300 K. Les vitesses initiales sont attribuées aux atomes puisque le modèle de départ basé sur le fichier PDB ne contient pas d’informations de vitesse.

1. Effectuer le processus de chauffage avec des contraintes de position sur les atomes de protéines (50 ps, volume constant).
   1. Utilisez heat.in et protein_min2.rst comme entrées : pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. Suivez les arguments requis : -x FICHIER jeux de coordonnées enregistrés sur la trajectoire MD.
   3. Spécifiez les options dans le fichier d’entrée heat.in :
      &cntrl
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      tempi=0,0, temp0=300,0,
      ntr=1, restraintmask=':1-517',
      restraint_wt=1,0,
      nmropt=1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      valeur1=0,1, valeur2=300,0 /
      &wt TYPE='FIN' /
      REMARQUE: Options d’entrée: imin = 0 exécuter MD; irest=0 exécuter une nouvelle simulation ; NTX=1 aucune vitesse initiale n’est lue à partir du fichier RST ; nstlim=25000 nombre d’étapes MD; dt=0,002 pas de temps (ps); les liaisons ntc=2 impliquant de l’hydrogène sont contraintes à l’aide de l’algorithme SHAKE; ntf=2 forces pour les liaisons contraintes ne sont pas calculées; Les coordonnées ntwx=500 sont écrites dans le fichier MDCRD à chaque étape NTWX ; ntt=3 Régulation de la température Langevin; gamma_ln=2,0 fréquence des collisions pour la dynamique de Langevin (ps⁻¹); tempi = 0,0 température initiale; temp0=300,0 température de référence; Les paramètres nmropt=1 spécifiés dans une liste de noms &wt sont lus ; TYPE='TEMP0' fait varier la température cible.

4. Equilibrage

NOTE: Cette étape est nécessaire pour ajuster la densité de l’eau et obtenir l’état d’équilibre de la protéine.

1. Effectuer l’équilibrage à 300 K sans aucune contrainte (500 ps, pression constante).
   1. Utilisez equil.in et protein_heat.rst comme entrées : pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. Spécifiez les options dans le fichier d’entrée equil.in :
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300,0
      /
      REMARQUE: Options d’entrée: irest=1 redémarrer la simulation; Les coordonnées et les vitesses NTX=5 sont lues à partir d’un fichier RST généré précédemment; ntb = 2 limites périodiques sont imposées, pression constante; ntp = 1 échelle de pression isotrope; TAUP = 2,0 temps de relaxation de pression (PS); NTWR = 50000 Chaque étape NTWR , le fichier RST est écrit, assurant la récupération après un crash.

5. Dynamique de production

1. Une fois l’équilibre atteint, effectuer une simulation MD de production (10 ns ou plus) à pression constante et générer le fichier de trajectoire pour l’analyse ultérieure de la structure protéique.
   1. Utilisez prod.in et protein_equil.rst comme entrées : pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. Spécifiez les options dans le fichier d’entrée prod.in :
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300.0, ig=-1
      /
      Remarque : La version parallèle de pmemd (pmemd. MPI) ou la version accélérée par GPU (pmemd.cuda) peuvent être utilisées sur les clusters d’ordinateurs et les supercalculateurs. Une longue simulation MD peut être divisée en plusieurs segments et effectuée séquentiellement. Il est fortement recommandé de définir ig=-1 (option de démarrage aléatoire) pour chaque redémarrage de simulation. Les programmes ptraj ou cppptraj peuvent être utilisés pour l’analyse et le traitement des trajectoires de coordonnées. Pour plus d’informations, consultez le manuel d’utilisation du logiciel.

Résultats

Le présent protocole peut être facilement appliqué dans les études de modification post-traductionnelle des caspases ou de mutations pathogènes. Dans cette section, le flux de travail de modélisation MD est illustré (Figure 1), qui a été utilisé avec succès dans l’étude de la caspase-2⁷. En utilisant la mutagénèse in vitro dirigée des sites de phosphorylation potentiels (Ser/Thr à Ala) et des approches biochimiques, il a été démontré que...

Discussion

L’approche DM décrite permet de modéliser à la fois les formes sauvages et mutantes de la caspase à l’aide des progiciels de simulation biomoléculaire. Plusieurs questions importantes de la méthodologie sont abordées ici. Tout d’abord, une structure cristalline représentative de la caspase doit être sélectionnée à partir de la banque de données sur les protéines. Il est important de noter que les formes monomères et dimériques de la caspase sont acceptables. Choisir des structures à haute résoluti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber20	University of California, San Francisco		Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org
AmberTools21	University of California, San Francisco		Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org