분자 모델링 접근법에 의한 Caspase 돌연변이 및 번역 후 변형 탐구

요약

본 프로토콜은 생체 분자 시뮬레이션 패키지를 사용하고 야생형 카스파제 및 그 돌연변이 형태를 모델링하기 위한 분자 역학(MD) 접근법을 설명합니다. MD 방법은 카스파제 구조의 동적 진화와 돌연변이 또는 번역 후 변형의 잠재적 효과를 평가할 수 있습니다.

초록

세포 사멸은 손상된 세포를 제거하고 다세포 유기체의 발달 및 조직 항상성을 제어하는 프로그램 된 세포 사멸의 한 유형입니다. 시스테인 프로테아제 계열인 Caspases는 세포자멸사 개시 및 실행에 중요한 역할을 합니다. 카스파제의 성숙과 그 활성은 매우 역동적 인 방식으로 번역 후 수정에 의해 미세 조정됩니다. 번역 후 변화의 효과를 평가하기 위해, 잠재적 부위는 임의의 변형에 지속되는 잔기로 일상적으로 돌연변이된다. 예를 들어, 세린 잔기는 알라닌 또는 아스파르트 산으로 대체됩니다. 그러나, 이러한 치환은 카스파제 활성 부위의 형태를 변화시켜 촉매 활성 및 세포 기능의 장애를 초래할 수 있다. 더욱이, 중요한 위치에 위치한 다른 아미노산 잔기의 돌연변이는 또한 카스파제의 구조 및 기능을 파괴하고 세포 사멸 섭동을 유발할 수있다. 돌연변이된 잔기를 사용하는 어려움을 피하기 위해, 분자 모델링 접근법을 쉽게 적용하여 카스파제 구조에 대한 아미노산 치환의 잠재적 효과를 추정할 수 있다. 본 프로토콜은 단백질 구조 및 기능에 대한 돌연변이의 영향을 테스트하기 위해 생체 분자 시뮬레이션 패키지 (Amber) 및 슈퍼 컴퓨터 시설을 사용하여 야생형 카스파아제와 그 돌연변이 형태의 모델링을 허용합니다.

서문

세포 사멸은 다세포 유기체의 형태 형성 및 조직 항상성을 조절하는 가장 널리 연구 된 세포 과정 중 하나입니다. 아폽토시스는 사멸 수용체의 활성화, 세포주기 신호의 교란, DNA 손상, 소포체(ER) 스트레스, 및 다양한 박테리아 및 바이러스 감염과 같은 광범위한 외부 또는 내부 자극에 의해 개시될 수^있다1. 주요 세포 사멸 선수 인 카스파제는 일반적으로 개시제 (카스파제 -2, 카스파제 -8, 카스파제 -9 및 카스파제 -10)와 이펙터 (카스파 제 -3, 카스파 제 -6 및 카스파 제 -7)의 두 그룹으로 분류되며, 도메인 구조와 카스파 아제 ^2,3의 위치에 따라 다릅니다. 세포 사멸 신호시, 개시제 카스파제는 활성 효소를 형성하기 위해 근접 유도 이량 체화 및 자동 처리를 촉진하는 어댑터 분자와 상호 작용합니다. 이펙터 카스파제는 개시제 카스파제에 의한 절단을 통해 활성화되고 다수의 세포^{기질을 절단}하여 다운스트림 실행 단계를 수행합니다4.

개시제 및 이펙터 카스파제의 성숙 및 기능은 다수의 상이한 세포 내 메카니즘에 의해 조절되며, 그 중 번역 후 변형은 세포 사멸 조절에 없어서는 안될 역할을한다⁵. 변형기 (인산화, 니트로 실화, 메틸화 또는 아세틸 화) 또는 단백질 (유비퀴틴화 또는 SUMOylation)의 첨가는 카스파 제의 효소 활성 또는 세포 사멸을 조절하는 단백질 형태 및 안정성을 변화시킵니다. 부위 지향 돌연변이유발은 잠재적인 번역 후 변형 부위를 조사하고 그 역할을 식별하기 위해 널리 적용됩니다. 추정 변형 부위는 일반적으로 더 이상 변형 될 수없는 다른 아미노산으로 대체됩니다. 따라서, 잠재적으로 인산화 된 세린 및 트레오닌은 알라닌으로 돌연변이되고, 라이신 유비퀴틴 화 부위는 아르기닌으로 대체된다. 또 다른 전략은 특히 번역 후 변형을 모방하는 아미노산을 치환하는 것을 포함합니다 (예 : 글루타메이트 및 아스 파르 테이트는 인산화 된 세린 또는 트레오닌을 모방하는 데 사용되었습니다)⁶. 그러나, 활성 부위의 높은 부근 또는 임계 위치에 위치한 이들 치환 중 일부는 카스파제 구조를 변화시키고, 촉매 활성을 방해하며, 세포사멸^{세포 사멸}을 억제할 수 있다7. 카스파제 유전자에서 종양 관련 미센스 돌연변이의 경우에도 유사한 효과가 관찰될 수 있습니다. 예를 들어, caspase-6 - R259H의 종양 관련 돌연변이는 기질 결합 포켓에서 루프의 구조적 변화를 초래하여 기질⁸의 효율적인 촉매 회전율을 감소시켰다. 두경부 편평 세포 암종에서 확인 된 카스파 제 -8의 G325A 아미노산 치환은 카스파 제 -8 활성을 방해 할 수 있으며, 이는 핵 인자 -kB (NF-kB) 신호 전달의 조절로 이어지고 종양 형성⁹를 촉진시켰다.

카스파아제 구조 및 기능에 대한 아미노산 치환의 잠재적 효과를 평가하기 위해, 분자 모델링이 적용될 수 있다. 분자 역학 (MD) 접근법은 생체 분자 시뮬레이션 패키지 (Amber)를 사용하여 야생형 카스파제 및 그 돌연변이 형태를 모델링하기 위해이 작업에 설명되어 있습니다. MD 방법은 돌연변이 도입 후 단백질 구조의 동적 진화에 대한 관점을 제공합니다. 원래 Peter Kollman의 그룹에서 개발한 Amber 패키지는 생체 분자 시뮬레이션^10,11,12,13을 위한 가장 인기 있는 소프트웨어 도구 중 하나가 되었습니다. 이 소프트웨어는 두 부분으로 나뉩니다 : (1) AmberTools, 시스템 준비 (원자 유형 할당, 수소 및 명시 물 분자 추가 등) 및 궤적 분석에 일상적으로 사용되는 프로그램 모음; (2) pmemd 시뮬레이션 프로그램을 중심으로 한 앰버. AmberTools는 무료 패키지 (Amber 자체를 설치하기위한 전제 조건)이며 Amber는 별도의 라이센스 및 요금 구조로 배포됩니다. 슈퍼컴퓨터 상의 및/또는 그래픽 처리 유닛(GPU)을 사용하는 병렬 시뮬레이션은 단백질 구조 역학(¹⁴)의 과학적 연구를 위한 성능을 실질적으로 향상시킬 수 있다. 사용 가능한 최신 소프트웨어 버전은 AmberTools21 및 Amber20이지만 설명된 프로토콜을 이전 버전에서도 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 시스템 준비

참고: 천연 및 돌연변이 단백질 형태의 분자 모델은 단백질 데이터 뱅크^15,16에서 얻은 적절한 결정 구조를 기반으로 구축됩니다.

1. 선택한 PDB 구조를 검색하려면 파일 다운로드 드롭다운 목록을 사용하고 PDB 형식을 클릭합니다. 비고 및 연결 데이터를 제거하고 PDB 파일의 개별 단백질 사슬 사이에 TER 카드를 삽입합니다. 선택적으로 잔기 이름 HIS를 HIE, HID 또는 HIP로 대체하여 히스티딘 잔기의 양성자화 상태를 설정합니다(보충 파일 1).
   참고: 결정학적으로 분해된 물 분자(PDB 파일에 있는 경우)를 제거하지 않는 것이 합리적입니다.
2. 시작 모델을 준비하려면 tleap 프로그램(AmberTools 패키지)을 시작한 다음 tleap 객체를 조작하는 명령을 입력합니다.
   1. 프로그램을 시작하십시오 : 틀랩. ff14SB 힘장을 불러와 분자 역학으로 단백질을 설명하십시오 : > 소스 leaprc.protein.ff14SB를 사용하십시오.
   2. 물 분자 및 원자 이온(Na⁺, Cl^-)에 대한 하중 힘장: > 소스 leaprc.water.tip3p.
   3. PDB 파일을 불러오고 수소에 대한 좌표를 작성하여 mol: > mol = loadpdb 단백질.pdb이라는 객체를 만듭니다.
   4. 문제를 일으킬 수 있는 내부 불일치 확인: > mol을 확인하십시오.
      참고: 이황화 브리지가 있는 경우 수동으로 지정해야 합니다. 공유 결합 시스테인 CYS의 이름을 CYX로 바꾸고 tleap 에 다음 명령을 입력하여 SG 원자 사이에 결합을 만듭니다. 결합 mol.X.SG mol.Y.SG (X와 Y는 시스테인 잔기 번호입니다).
   5. 용매 상자 주위에 단백질 (TIP3P 물, 12 Å 거리): > 용매화물 몰 TIP3PBOX 12.0을 만든다.
   6. 총 전하를 확인하십시오 : 전하 mol을 >하고 반대 이온 (Na⁺ 또는 Cl^-)을 추가하여 시스템을 중화시킵니다.
      > 몰 Na⁺ 0.
   7. 토폴로지 prmtop 파일과 좌표 inpcrd 파일(시뮬레이션 실행을 위한 입력)을 만듭니다: > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. tleap 프로그램을 종료하십시오 : > 종료하십시오.
      참고: 황색 형식 좌표 파일은 ambpdb 도구를 사용하여 PDB 형식으로 쉽게 변환할 수 있습니다(사용자 설명서 참조, 재료 표 참조).

2. 에너지 최소화

알림: 에너지 최소화는 MD를 실행할 때 불안정하게 만드는 시작 시스템의 원자 사이의 잘못된 접촉 및 겹침을 제거하는 데 필요합니다.

1. 에너지 최소화의 첫 번째 단계(가장 가파른 하강 알고리즘의 2,500단계 + 공액 기울기 알고리즘의 2,500단계)를 수행하여 추가된 수소 원자와 물 분자의 위치를 최적화하는 동시에 단백질 좌표를 무거운 원자의 위치 구속으로 고정합니다.
   1. 다음과 같이 pmemd 프로그램을 실행합니다.
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
   2. 필수 인수를 따르십시오: -i FILE 제어 데이터; -p FILE 분자 토폴로지, 힘장 매개 변수, 원자 이름; -c 파일 초기 좌표; -o FILE 사용자가 읽을 수있는 로그 출력; -r 파일 최종 좌표; -ref FILE 위치 구속에 대한 참조 좌표입니다.
   3. 입력 파일 min1.in 에서 옵션을 지정합니다.
      ᄏᄏ��
      이민 = 1, 최대 사이클 = 5000, NCYC = 2500,
      컷 = 10.0, NTB = 1,
      NTC = 1, NTF = 1,
      ntpr = 10,
      ntr=1,
      구속 마스크=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2.0
      /
      참고: 입력 옵션: imin=1 최소화를 수행합니다. maxcyc=5000 최대 최소화 주기 수; NCYC=2500 최소화 방법은 NCYC 사이클 후 가장 가파른 하강에서 켤레 기울기로 전환됩니다. 컷=10.0 비본세 컷오프(Å); ntb = 1주기적 경계가 부과되고 일정한 부피; ntc = 1 결합 길이에 제약 조건이 적용되지 않습니다 (더 나은 에너지 수렴을 위해). ntf=1 모든 상호 작용이 계산됩니다. NTPR = 10 에너지 정보는 NTPR 단계마다 출력 파일에 인쇄됩니다. ntr=1 고조파 전위를 사용하여 지정된 원자를 억제하기 위한 플래그; 구속 마스크=':1-517 & !@H='는 구속된 원자를 지정합니다. restraint_wt=2.0 무게(kcal/mol∙Ų) 위치 구속용.
2. 제한 없이 에너지 최소화의 두 번째 단계(가장 가파른 하강 단계 5,000개 + 켤레 기울기 단계 5,000개)를 수행하여 전체 시스템을 최적화합니다.
   1. min2.in 및 protein_min1.rst를 입력으로 사용합니다.pmemd -O -i min2.in -p 단백질.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. 입력 파일 min2.in 에서 옵션을 지정합니다.
      ᄏᄏ��
      이민 = 1, 최대 사이클 = 10000, NCYC = 5000,
      컷 = 10.0, NTB = 1,
      NTC = 1, NTF = 1,
      ntpr=10
      /

3. 난방

알림: 이 단계는 시스템을 0K에서 300K로 가열하는 것을 목표로 합니다. PDB 파일을 기반으로 하는 시작 모델에는 속도 정보가 포함되어 있지 않으므로 초기 속도는 원자에 할당됩니다.

1. 단백질 원자 (50ps, 일정한 부피)에 위치 구속으로 가열 과정을 수행하십시오.
   1. heat.in 및 protein_min2.rst를 입력으로 사용합니다.pmemd -O -i heat.in -p 단백질.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. 필수 인수를 따르십시오: -x FILE 좌표 세트는 MD 궤적에 저장됩니다.
   3. 입력 파일 heat.in 에서 옵션을 지정합니다.
      ᄏᄏ��
      이민 = 0, irest = 0, ntx = 1,
      nstlim = 25000, dt = 0.002,
      NTC = 2, NTF = 2,
      컷 = 10.0, NTB = 1,
      NTPR = 500, NTWX = 500,
      NTT = 3, gamma_ln = 2.0,
      템피 = 0.0, 온도 0 = 300.0,
      ntr=1, 구속마스크=':1-517',
      restraint_wt=1.0,
      nmropt=1
      /
      &wt 유형 = '온도 0',
      istep1=0, istep2=25000,
      값 1 = 0.1, 값 2 = 300.0 /
      &wt 유형 = '끝'/
      참고: 입력 옵션: imin=0 실행 MD; irest = 0 새 시뮬레이션을 실행합니다. ntx=1 rst 파일에서 초기 속도를 읽지 않습니다. nstlim=25000 MD 단계 수; dt=0.002 시간 스텝(ps); 수소와 관련된 ntc = 2 결합은 SHAKE 알고리즘을 사용하여 제한됩니다. 구속된 결합에 대한 ntf=2 힘은 계산되지 않습니다. NTWX=500 좌표는 NTWX 단계마다 MDCRD 파일에 기록됩니다. ntt=3 랑게빈 온도 조절; gamma_ln=2.0 랑게빈 역학에 대한 충돌 주파수(ps⁻¹); 템피 = 0.0 초기 온도; 온도0=300.0 기준 온도; &wt 이름 목록에 지정된 nmropt=1 매개 변수를 읽습니다. TYPE='TEMP0'은 목표 온도를 변경합니다.

4. 평형

참고: 이 단계는 물의 밀도를 조정하고 단백질의 평형 상태를 얻는 데 필요합니다.

1. 제한 없이 300K에서 평형을 수행합니다(500ps, 일정한 압력).
   1. equil.in 및 protein_heat.rst를 입력으로 사용합니다.pmemd -O -i equil.in -p 단백질.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. 입력 파일 equil.in 에서 옵션을 지정합니다.
      ᄏᄏ��
      이민 = 0, irest = 1, ntx = 5,
      nstlim=250000,
      dt = 0.002,
      NTC = 2, NTF = 2,
      컷 = 10.0, NTB = 2, NTP = 1, TAUP = 2.0,
      NTPR = 1000, NTWX = 1000, NTWR = 50000,
      NTT = 3, gamma_ln = 2.0,
      임시 직원0=300.0
      /
      참고: 입력 옵션: irest=1 시뮬레이션을 다시 시작합니다. NTX = 5 좌표와 속도는 이전에 생성 된 RST 파일에서 읽습니다. ntb = 2 주기적 경계가 부과되고 일정한 압력; NTP = 1 등방성 압력 스케일링; TAUP=2.0 압력 이완 시간(PS); NTWR = 50000 NTWR 단계마다 RST 파일이 기록되어 충돌로부터 복구 할 수 있습니다.

5. 생산 역학

1. 평형이 성공적으로 달성되면 일정한 압력에서 생산 MD 시뮬레이션(10ns 이상)을 수행하고 단백질 구조의 후속 분석을 위해 궤적 파일을 생성합니다.
   1. prod.in 및 protein_equil.rst를 입력으로 사용합니다.pmemd -O -i prod.in -p 단백질.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. 입력 파일 prod.in 에서 옵션을 지정합니다.
      ᄏᄏ��
      이민 = 0, irest = 1, ntx = 5,
      nstlim = 5000000,
      dt = 0.002,
      NTC = 2, NTF = 2,
      컷 = 10.0, NTB = 2, NTP = 1, TAUP = 2.0,
      NTPR = 1000, NTWX = 1000, NTWR = 50000,
      NTT = 3, gamma_ln = 2.0,
      온도0=300.0, ig=-1
      /
      참고: pmemd의 병렬 버전(pmemd. MPI) 또는 GPU 가속 버전(pmemd.cuda)은 컴퓨터 클러스터 및 슈퍼컴퓨터에서 사용할 수 있습니다. 긴 MD 시뮬레이션은 여러 세그먼트로 나뉘어 순차적으로 수행될 수 있습니다. 모든 시뮬레이션 재시작에 대해 ig=-1(임의 시드 옵션)을 설정하는 것이 좋습니다. ptraj 또는 cppptraj 프로그램은 좌표 궤적의 분석 및 처리에 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 소프트웨어 사용자 설명서를 참조하십시오.

결과

본 프로토콜은 카스파제 또는 병원성 돌연변이의 번역후 변형의 연구에 용이하게 적용될 수 있다. 이 섹션에서는 caspase-2⁷ 연구에 성공적으로 사용 된 MD 모델링 워크 플로우 (그림 1)를 설명합니다. 잠재적 인산화 부위(Ser/Thr to Ala) 및 생화학적 접근의 시험관내 부위 지시 돌연변이유발을 사용하여 Ser384Ala 돌연변이가 카스파제-2 처리를 방지하고 효소 ...

토론

설명된 MD 접근법은 생체분자 시뮬레이션 패키지를 사용하여 카스파아제의 야생형 및 돌연변이 형태를 모두 모델링할 수 있게 한다. 방법론의 몇 가지 중요한 문제가 여기에서 논의됩니다. 먼저, 카스파아제의 대표적인 결정구조는 단백질 데이터뱅크로부터 선택될 필요가 있다. 중요하게도, 단량체 및 이량 체 형태의 카스파아제가 모두 허용됩니다. 누락된 잔류물 수가 최소인 고해상도 구조를 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber20	University of California, San Francisco		Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org
AmberTools21	University of California, San Francisco		Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org