Esplorazione delle mutazioni della caspasi e della modificazione post-traduzionale mediante approcci di modellazione molecolare

Riepilogo

Il presente protocollo utilizza un pacchetto di simulazione biomolecolare e descrive l'approccio di dinamica molecolare (MD) per modellare la caspasi wild-type e le sue forme mutanti. Il metodo MD consente di valutare l'evoluzione dinamica della struttura delle caspasi e il potenziale effetto di mutazioni o modificazioni post-traduzionali.

Abstract

L'apoptosi è un tipo di morte cellulare programmata che elimina le cellule danneggiate e controlla lo sviluppo e l'omeostasi tissutale degli organismi multicellulari. Le caspasi, una famiglia di proteasi della cisteina, svolgono un ruolo chiave nell'inizio e nell'esecuzione dell'apoptosi. La maturazione delle caspasi e la loro attività sono messe a punto da modifiche post-traduzionali in modo altamente dinamico. Per valutare l'effetto dei cambiamenti post-traduzionali, i siti potenziali vengono regolarmente mutati con residui persistenti a qualsiasi modifica. Ad esempio, il residuo di serina viene sostituito con alanina o acido aspartico. Tuttavia, tali sostituzioni potrebbero alterare la conformazione del sito attivo della caspasi, portando a disturbi nell'attività catalitica e nelle funzioni cellulari. Inoltre, mutazioni di altri residui di amminoacidi situati in posizioni critiche potrebbero anche rompere la struttura e le funzioni delle caspasi e portare a perturbazioni dell'apoptosi. Per evitare le difficoltà di impiegare residui mutati, approcci di modellazione molecolare possono essere facilmente applicati per stimare il potenziale effetto delle sostituzioni aminoacidiche sulla struttura delle caspasi. Il presente protocollo consente la modellazione sia della caspasi wild-type che delle sue forme mutanti con il pacchetto di simulazione biomolecolare (Amber) e le strutture di supercomputer per testare l'effetto delle mutazioni sulla struttura e la funzione della proteina.

Introduzione

L'apoptosi è uno dei processi cellulari più studiati che regolano la morfogenesi e l'omeostasi tissutale degli organismi pluricellulari. L'apoptosi può essere iniziata da una vasta gamma di stimoli esterni o interni, come l'attivazione dei recettori di morte, il disturbo nei segnali del ciclo cellulare, il danno al DNA, lo stress del reticolo endoplasmatico (ER) e varie infezioni batteriche e virali¹. Le caspasi - attori chiave dell'apoptosi - sono convenzionalmente classificate in due gruppi: iniziatori (caspasi-2, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-10) ed effettori (caspasi-3, caspasi-6 e caspasi-7), a seconda della loro struttura di dominio e del posto nella cascata delle caspasi ^2,3. Sui segnali di morte cellulare, le caspasi iniziatrici interagiscono con molecole adattatrici che facilitano la dimerizzazione indotta dalla prossimità e l'autoelaborazione per formare un enzima attivo. Le caspasi effettrici sono attivate attraverso la scissione da parte delle caspasi iniziatrici ed eseguono fasi di esecuzione a valle scindendo più substrati cellulari⁴.

La maturazione e la funzione delle caspasi iniziatrici ed effettrici sono regolate da un gran numero di diversi meccanismi intracellulari, tra i quali la modificazione post-traduzionale svolge un ruolo indispensabile nella modulazione della morte cellulare⁵. L'aggiunta di gruppi modificanti (fosforilazione, nitrosilazione, metilazione o acetilazione) o proteine (ubiquitinazione o SUMOilazione) modifica l'attività enzimatica delle caspasi o la conformazione e la stabilità proteica che regolano l'apoptosi. La mutagenesi sito-diretta è ampiamente applicata per studiare i potenziali siti di modificazione post-traduzionale e discernere il loro ruolo. Un sito di modifica putativo viene solitamente sostituito da un altro amminoacido, che non può essere ulteriormente modificato. Pertanto, la serina e la treonina potenzialmente fosforilate sono mutate in alanina e i siti di ubiquitinazione della lisina vengono sostituiti con arginina. Un'altra strategia include la sostituzione di un amminoacido che imita in particolare la modificazione post-traduzionale (ad esempio, glutammato e aspartato sono stati usati per imitare la serina o la treonina fosforilate)⁶. Tuttavia, alcune di queste sostituzioni situate nelle alte vicinanze di un sito attivo o in posizioni critiche potrebbero cambiare la struttura delle caspasi, disturbare l'attività catalitica e sopprimere la morte cellulare apoptotica⁷. Effetti simili potrebbero essere osservati nei casi di mutazioni missenso associate al tumore nei geni delle caspasi. Ad esempio, la mutazione associata al tumore della caspasi-6 - R259H - ha provocato cambiamenti conformazionali degli anelli nella tasca di legame del substrato, riducendo l'efficiente turnover catalitico dei substrati⁸. La sostituzione dell'aminoacido G325A nella caspasi-8 identificata nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo potrebbe ostacolare l'attività della caspasi-8, che ha portato alla modulazione della segnalazione del fattore nucleare-kB (NF-kB) e ha promosso la tumorigenesi⁹.

Per valutare il potenziale effetto delle sostituzioni aminoacidiche sulla struttura e la funzione delle caspasi, è possibile applicare la modellazione molecolare. L'approccio della dinamica molecolare (MD) è descritto in questo lavoro per modellare la caspasi wild-type e le sue forme mutanti usando il pacchetto di simulazione biomolecolare (Amber). Il metodo MD fornisce una visione dell'evoluzione dinamica della struttura proteica in seguito all'introduzione di mutazioni. Originariamente sviluppato dal gruppo di Peter Kollman, il pacchetto Amber è diventato uno degli strumenti software più popolari per le simulazioni biomolecolari^10,11,12,13. Questo software è diviso in due parti: (1) AmberTools, una raccolta di programmi utilizzati abitualmente per la preparazione del sistema (assegnazione del tipo di atomo, aggiunta di idrogeni e molecole esplicite di acqua, ecc.) e l'analisi della traiettoria; e (2) Amber, che è incentrato sul programma di simulazione pmemd. AmberTools è un pacchetto gratuito (e un prerequisito per l'installazione di Amber stesso), mentre Amber è distribuito con una licenza separata e una struttura tariffaria. Simulazioni parallele su un supercomputer e/o utilizzando unità di elaborazione grafica (GPU) possono migliorare sostanzialmente le prestazioni per la ricerca scientifica della dinamica della struttura proteica¹⁴. Le ultime versioni del software disponibili sono AmberTools21 e Amber20, ma i protocolli descritti possono essere utilizzati anche con le versioni precedenti.

Protocollo

1. Preparazione del sistema

NOTA: I modelli molecolari delle forme proteiche native e mutanti sono costruiti sulla base di un'appropriata struttura cristallina ottenuta dalla Protein Data Bank^15,16.

1. Per recuperare la struttura PDB selezionata, utilizzare l'elenco a discesa Scarica file e fare clic su Formato PDB. Rimuovere le osservazioni e i dati di connettività e inserire una scheda TER tra catene proteiche separate nel file PDB. Facoltativamente, impostare lo stato di protonazione dei residui di istidina sostituendo il nome del residuo HIS con HIE, HID o HIP (file supplementare 1).
   NOTA: è ragionevole non rimuovere molecole d'acqua risolte cristallograficamente (se presenti nel file PDB).
2. Per preparare il modello iniziale, avviare il programma tleap (pacchetto AmberTools) e quindi immettere comandi che manipolano gli oggetti tleap .
   1. Avvia il programma: tleap. Caricare il campo di forza ff14SB per descrivere la proteina con la meccanica molecolare: > fonte leaprc.protein.ff14SB.
   2. Campi di forza di carico per molecole d'acqua e ioni atomici (Na⁺, Cl^-): > sorgente leaprc.water.tip3p.
   3. Caricare il file PDB e costruire le coordinate per gli idrogeni, creando un oggetto chiamato mol: > mol = loadpdb protein.pdb.
   4. Verificare la presenza di incongruenze interne che potrebbero causare problemi: > controllare mol.
      NOTA: i ponti disolfuro, se presenti, devono essere specificati manualmente. Sostituire i nomi delle cisteine legate covalentemente CYS con CYX e digitare il seguente comando in tleap per creare un legame tra gli atomi SG: legame mol.X.SG mol.Y.SG (X e Y sono numeri di residui di cisteina).
   5. Creare una scatola di solventi attorno alla proteina (acqua TIP3P, distanza 12 Å): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
   6. Controllare la carica totale: > mol di carica e aggiungere controioni (Na⁺ o Cl^-) per neutralizzare il sistema:
      > addions mol Na⁺ 0.
   7. Creare il file prmtop della topologia e il file inpcrd delle coordinate (input per l'esecuzione di una simulazione): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Esci dal programma tleap: > esci.
      NOTA: i file di coordinate in formato ambra possono essere facilmente convertiti in formato PDB utilizzando lo strumento ambpdb (fare riferimento al Manuale dell'utente, vedere Tabella dei materiali).

2. Minimizzazione dell'energia

NOTA: La minimizzazione dell'energia è necessaria per rimuovere eventuali contatti difettosi e sovrapposizioni tra gli atomi nel sistema di partenza che portano all'instabilità durante l'esecuzione di MD.

1. Eseguire il primo stadio della minimizzazione dell'energia (2.500 passi dell'algoritmo di discesa più ripida + 2.500 passi dell'algoritmo del gradiente coniugato) per ottimizzare le posizioni degli atomi di idrogeno aggiunti e delle molecole d'acqua mantenendo le coordinate proteiche fissate da restrizioni posizionali su atomi pesanti.
   1. Eseguire il programma pmemd come segue:
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
   2. Seguire gli argomenti richiesti: -i dati di controllo FILE; -p FILE topologia molecolare, parametri del campo di forza, nomi degli atomi; -c FILE coordinate iniziali; -o FILE output del registro leggibile dall'utente; -r FILE coordinate finali; -ref FILE coordinate di riferimento per i vincoli di posizione.
   3. Specificare le opzioni nel file di input min1.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10,
      ntr=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2,0
      /
      NOTA: Opzioni di input: imin = 1 eseguire la minimizzazione; maxcyc=5000 numero massimo di cicli di minimizzazione; Il metodo di minimizzazione NCYC=2500 passa dalla discesa più ripida al gradiente coniugato dopo i cicli NCYC ; cut=10.0 cutoff non legato (Å); ntb=1 vengono imposti limiti periodici, volume costante; ntc=1 non vengono applicati vincoli alle lunghezze di legame (per una migliore convergenza energetica); ntf=1 vengono calcolate tutte le interazioni; ntpr=10 Le informazioni sull'energia vengono stampate nel file out ogni passaggio di NTPR ; ntr=1 flag per trattenere atomi specificati usando un potenziale armonico; restraintmask=':1-517 & !@H=' specifica gli atomi trattenuti; restraint_wt=2,0 peso (kcal/mol∙Ų) per i vincoli di posizione.
2. Eseguire la seconda fase della minimizzazione dell'energia (5.000 gradini di discesa più ripidi + 5.000 gradini di pendenza coniugati) senza vincoli per ottimizzare l'intero sistema.
   1. Utilizzare min2.in e protein_min1.rst come input: pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. Specificare le opzioni nel file di input min2.in:
      &cntrl
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10
      /

3. Riscaldamento

NOTA: questa fase ha lo scopo di riscaldare il sistema da 0 K a 300 K. Le velocità iniziali sono assegnate agli atomi poiché il modello iniziale basato sul file PDB non contiene informazioni sulla velocità.

1. Eseguire il processo di riscaldamento con restrizioni posizionali sugli atomi proteici (50 ps, volume costante).
   1. Utilizzare heat.in e protein_min2.rst come input: pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. Seguire gli argomenti richiesti: set di coordinate -x FILE salvati sulla traiettoria MD.
   3. Specificare le opzioni nel file di input heat.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      ntt=3, gamma_ln=2.0,
      tempi=0.0, temp0=300.0,
      ntr=1, restraintmask=':1-517',
      restraint_wt=1,0,
      nmropt=1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      valore1=0.1, valore2=300.0 /
      &wt TYPE='END' /
      NOTA: Opzioni di input: imin = 0 eseguire MD; irest=0 eseguire una nuova simulazione; ntx=1 nessuna velocità iniziale viene letta dal file rst ; nstlim=25000 numero di passi MD; dt=0,002 passo temporale (ps); ntc=2 legami che coinvolgono idrogeno sono vincolati usando l'algoritmo SHAKE; ntf=2 le forze per i legami vincolati non sono calcolate; Le coordinate ntwx=500 vengono scritte nel file MDCRD ogni passo di NTWX ; NTT=3 Regolazione della temperatura di Langevin; gamma_ln=2.0 frequenza di collisione per la dinamica di Langevin (ps⁻¹); tempi=0.0 temperatura iniziale; temp0=300.0 temperatura di riferimento; nmropt=1 i parametri specificati in una &wt namelist vengono letti; TYPE='TEMP0' varia la temperatura target.

4. Equilibrio

NOTA: Questa fase è necessaria per regolare la densità dell'acqua e ottenere lo stato di equilibrio della proteina.

1. Eseguire l'equilibrio a 300 K senza alcuna restrizione (500 ps, pressione costante).
   1. Utilizzare equil.in e protein_heat.rst come input: pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. Specificare le opzioni nel file di input equil.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2.0,
      temp0=300.0
      /
      NOTA: Opzioni di input: irest=1 riavviare la simulazione; Le coordinate e le velocità NTX=5 vengono lette da un file RST generato in precedenza; ntb=2 vengono imposti limiti periodici, pressione costante; NTP=1 scala della pressione isotropa; taup=2.0 tempo di rilassamento della pressione (PS); NTWR=50000 Ogni passaggio NTWR , il file RST viene scritto, garantendo il ripristino da un arresto anomalo.

5. Dinamica produttiva

1. Dopo che l'equilibrio è stato raggiunto con successo, eseguire una simulazione MD di produzione (10 ns o più) a pressione costante e generare il file di traiettoria per la successiva analisi della struttura proteica.
   1. Utilizzare prod.in e protein_equil.rst come input: pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. Specificare le opzioni nel file di input prod.in:
      &cntrl
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2.0,
      temp0=300.0, ig=-1
      /
      NOTA: la versione parallela di pmemd (pmemd. MPI) o la versione accelerata da GPU (pmemd.cuda) può essere utilizzata su cluster di computer e supercomputer. Una lunga simulazione MD può essere suddivisa in diversi segmenti ed eseguita in sequenza. Si consiglia vivamente di impostare ig=-1 (opzione seed casuale) per ogni riavvio della simulazione. I programmi ptraj o cppptraj possono essere utilizzati per l'analisi e l'elaborazione di traiettorie di coordinate. Per ulteriori informazioni, consultare il Manuale dell'utente del software.

Risultati

Il presente protocollo può essere facilmente applicato in studi di modificazione post-traduzionale di caspasi o mutazioni patogene. In questa sezione viene illustrato il flusso di lavoro di modellazione MD (Figura 1), che è stato utilizzato con successo nello studio della caspasi-2⁷. Utilizzando la mutagenesi sito-diretta in vitro di potenziali siti di fosforilazione (da Ser/Thr ad Ala) e approcci biochimici, è stato dimostrato che la mutazione Ser384Ala i...

Discussione

L'approccio MD descritto consente di modellare sia le forme wild-type che mutanti di caspasi utilizzando i pacchetti di simulazione biomolecolare. Qui vengono discusse diverse questioni importanti della metodologia. In primo luogo, una struttura cristallina rappresentativa della caspasi deve essere selezionata dalla Protein Data Bank. È importante sottolineare che entrambe le forme monomeriche e dimeriche di caspasi sono accettabili. Scegliere strutture ad alta risoluzione con un numero minimo di residui mancanti è una...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber20	University of California, San Francisco		Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org
AmberTools21	University of California, San Francisco		Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org